UPLC-MS法測定肉制品中蝦過敏原含量的不確定度評定

梁瑞強,劉彤彤,羅嬌依,曹 進,孫姍姍

(中國食品藥品檢定研究院 國家市場監管重點實驗室(食品質量與安全),北京 100050)

蛋白類抗原是引起食物過敏的主要因素,其中蝦肉又屬于主要的過敏食物[1-2]。在臨床上,曾有因食用蝦而導致過敏的報道,蝦肉過敏可引起皮膚刺激和消化系統紊亂,更嚴重的情況會導致血管性水腫和休克[3]。蝦過敏原主要包括原肌球蛋白、肌質鈣結合蛋白和血藍蛋白等,因此,針對這些過敏原的性質特點,免疫學技術、色譜質譜聯用技術和分子生物學技術等分析蝦過敏原的方法相繼出現[4-8]。目前,我國的相關標準要求:對可能引起過敏反應的食品及其制品進行相關標注和提示[9]。

對于食品過敏原的檢測,技術人員常采用實時鏈式聚合酶反應法(RT-PCR)或酶聯免疫吸附法(ELISA)[10]。RT-PCR是通過測定與過敏原蛋白質相關的DNA片段而得到過敏原蛋白的含量,若過敏原蛋白的基因序列中有未知基因序列,則該方法不適用。ELISA法的基本原理是抗體和抗原的相互作用,如果樣品中非過敏原蛋白與抗體產生交叉反應,則會影響檢測結果的準確性。此外,光譜法、電泳法、比色法和液相色譜法等雖然都可用于蛋白質含量測定,從而應用于食品過敏原檢測,但對于基質復雜的樣品也不適用。相比于上述技術手段,超高效液相色譜串聯質譜法(UPLC-MS)不僅可以通過離子質荷比(m/z)的差異同時鑒定多種蛋白質,還能通過測定目標肽段來定量蛋白質含量,具有靈敏度高、專屬性強、容易實現自動化進樣的優勢[11]。采用UPLC-MS法進行過敏原定量分析不僅可以避免ELISA法檢測時可能出現交叉反應的缺點,還能一定程度上彌補RT-PCR法遇到未知基因序列而無法定量的不足。通常,使用質譜技術研究食品過敏原的對象主要集中在含有牛奶、堅果類和大豆成分的食品。如,含有牛奶的飲料、水果制品和烘烤類食品,含有各類堅果(核桃仁、杏仁等)的預包裝食品,含有大豆成分的復雜加工食品等,但對于肉制品中蝦類過敏原的研究相對較少。因此,基于食品安全監管需求、技術優勢和現有研究的短板,采用UPLC-MS技術開發肉制品中蝦過敏原的檢測方法是一個具有前景的方向。

由于蛋白質具有分子量大、電荷多等特點,單純依靠質荷比(m/z)并不能直接實現對蛋白質的鑒定,需要采用合適的酶解方法將目標蛋白質降解成肽段,再從中尋找能夠代表蛋白質結構和含量特點的專屬性肽段(特征肽段)進行分析。筆者課題組劉彤彤等[12]前期研究利用蛋白質組學相關技術獲得肉制品中蝦過敏原的特征肽段,并完成了使用UPLC-MS技術檢測過敏原含量方法的開發。對于具體含量測定方法,不僅需要保證使用此方法進行檢測所得結果的準確度和可信程度,而且還要評定測量不確定度,以使測定方法的結果較為客觀。

因此,本研究的目的在于通過測量不確定度來表征所開發的UPLC-MS檢測結果的合理離散度并評估測量結果的質量,并建立該方法測定肉制品中蝦過敏原含量的不確定度數學模型,分析實驗過程中引入不確定度的分量和占比,得到對檢測結果產生影響的主要因素,以期為在實際應用場景中使用此方法的操作過程提供合理建議,也為提高實驗結果的準確度和置信度提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

UPLC-Xevo TQ-S型超高效液相色譜串聯三重四極桿質譜儀、胰蛋白酶(質譜級,1 mg),美國沃特世公司;Synergy HT型酶標儀,德國BioTek 公司;B-491型恒溫水浴鍋,瑞士步琪公司;AL204、XP205型電子天平,瑞士梅特勒-托利多公司;SORVALL Legend MICRO21 R型離心機,美國賽默飛世爾科技公司;ZWY-240型渦旋振蕩器,美國Scientific Industries 公司。

1.2 試劑

甲酸、乙腈(質譜純)、胰蛋白酶(質譜級,1 mg),美國賽默飛世爾科技公司;三羥甲基氨基甲烷(分析純),美國西格瑪奧德里奇公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)片劑,北京索萊寶科技有限公司;鹽酸(分析純),國藥集團化學試劑有限公司;Bradford 蛋白測定試劑盒,美國伯樂公司;對照品肽段:IR-9(序列為IVELEEER,純度≥97.05%,批號為P200720-XT642878),內標肽段為IR-9*(序列為IVEL*EEER,純度≥95.40%,批號為P200720-XT818725),上海吉爾生化有限公司;實驗用水由H2O pro-DI-B型超純水器(德國賽多利斯公司)制備。

PBS溶液:取PBS 片劑1片加 100 mL 超純水超聲溶解后,混勻即得。

胰蛋白酶溶液:用 1 mL 超純水溶解胰蛋白酶即得,質量濃度為 1 mg/mL。

1.3 樣品

從京東商城購買包含蝦類成分的肉制品(包括不同品牌的香腸、肉丸和火腿等)作為樣品,共20批;空白樣品(牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉、鱸魚、黑魚、鯉魚、黃鱔等比例混合)購于北京物美超市。由于蝦類屬于節肢動物門生物,與脊索動物門中哺乳綱、鳥綱和硬骨魚綱的親源性較遠,故選為陰性基質;另因以上肉類常作為混雜肉類制成熟食預包裝食品,故選為研究基質對象。所有樣品儲存于-20 ℃冰箱。

1.4 儀器及分析條件

在前期的方法開發工作中,通過蛋白質組學技術得到了蝦過敏原蛋白的特征肽段,并合成了對應的同位素內標肽段。將特征肽段作為對照品(外標),同位素內標肽段作為內標,使用UPLC-Xevo TQ-S質譜自帶的IntelliStart技術自動得到內標和外標的質譜條件和多反應監測(MRM)通道參數,并根據在超高效液相色譜上外標、內標的色譜行為優化得到合適的色譜條件。

具體色譜條件為色譜柱UPLC HSS T3(150 mm×2.1 mm,1.8 μm,美國沃特世公司)、柱溫30 ℃、進樣量5 μL、流速0.3 mL/min。流動相:A相為0.1%甲酸-水溶液(體積分數),B相為乙腈。梯度洗脫程序:0 min,V(A)∶V(B)=82∶18;0.5 min,V(A)∶V(B)=82∶18;8.0 min,V(A)∶V(B)=55∶45,8.3 min,V(A)∶V(B)=18∶82;8.6 min,V(A)∶V(B)=18∶82 ;9.0 min,V(A)∶V(B)=82∶18;11.5 min,V(A)∶V(B)=82∶18。

質譜條件為利用正離子掃描方式的電噴離子源(ESI+),掃描模式為多反應監測(MRM),毛細管電壓3.2 kV,去溶劑氣溫度500 ℃,離子源溫度150 ℃,脫溶劑氣流量800 L/h,錐孔氣流量為150 L/h。MRM通道參數見表1,其中565.5→917.6為外標肽段IR-9的定量離子對,569.0→924.7為內標肽段IR-9*的定量離子對。

表1 蝦過敏原肽段MRM通道參數

1.5 對照品溶液的制備

在前期方法開發階段,根據樣品中待測成分的大致含量范圍確定了標準工作溶液的工作范圍,從而得到對照品溶液的制備方法。

分別精確稱取1.04 mg外標IR-9、0.76 mg內標IR-9*,用1 mL Tris-HCl(50 mmol/L)溶液溶解,得到外標溶液IR-9濃度為893.8 μmol/L、內標溶液IR-9*濃度為638.1 μmol/L。再分別吸取外標溶液112.0 μL,用50 mmol/L Tris-HCl溶液定容至5 mL,內標溶液31.3 μL,用50 mmol/L Tris-HCl溶液定容至2 mL,得到外標儲備溶液濃度為20 μmol/L、內標儲備溶液濃度為10 μmol/L。進一步稀釋得到濃度為5 μmol/L外標中間溶液和濃度為2.5 μmol/L的內標中間溶液。取適量外標中間溶液,再加入內標中間溶液,用水稀釋定容,分別配制成外標濃度為0.001、0.01、0.1、0.5和2.0 μmol/L的標準工作溶液(各濃度工作溶液均含有0.1 μmol/L內標溶液)。

1.6 樣品溶液的制備

根據樣品的性質特點并參照文獻[11]所述樣品處理方法,對樣品前處理條件進行研究,得到了本研究的樣品溶液制備方法。

在50 mL離心管中精密稱取樣品5 g。用移液器準確加入30 mL PBS溶液,超聲提取30 min。設置10 000 r/min的轉速,溫度為15 ℃,離心10 min。量取上清液5 mL,加乙腈5 mL,渦旋振蕩1 min后靜置,棄上清液,用1 mL PBS溶液復溶殘渣,并經0.45 μm濾膜過濾。準確移取上述濾液500 μL,加入40 μL 2.5 μmol/L內標溶液、10 μL胰蛋白酶液,渦旋混勻,于37 ℃恒溫水浴中反應16 h,取出并加入體積分數10%的甲酸-水溶液10 μL以終止反應,補超純水至1 mL。設置10 000 r/min的轉速,溫度為4 ℃,離心10 min,得到待分析的上清溶液。

1.7 數學模型的建立

據《測量不確定度表示指南》規定:測量不確定度評定步驟時,首先要建立數學模型,具體數學模型應當包含所有對測量結果的不確定度有影響的修正值和修正因子。在測量中,當被測量值(即輸出量)由其他量(即輸入量)通過函數來確定時,可以得到一個數學模型,這樣建立的數學模型可用來計算測量結果,也能用來評定測量結果的不確定度。實際情況中,對于一些檢測方法,雖然有些輸入量對測量結果有影響,但由于信息量的缺乏,在具體測量時無法定量計算它們對測量結果的影響,從而無法得到與輸出量相關的解析表達式;也有些輸入量由于對測量結果的影響很小,從而可以被忽略不計,這時測量不確定度評定的數學模型才可以與計算公式相同。

根據樣品處理過程,得到蝦過敏原含量的計算公式式(1),此式描述了被測量(蝦過敏原含量,即輸出量)與酶解液中外標濃度(輸入量)之間的函數關系,因此將式(1)作為本次不確定度的評定數學模型。

(1)

式中:X為每1 kg樣品中蝦過敏原的質量,mg/kg;c為酶解溶液中外標的濃度,μmol/L;V1為提取樣品時加入PBS溶液的體積,mL;V2為酶解溶液的定容體積,mL;V3為待酶解樣品提取溶液的體積,mL;m為稱樣量,g;M為蝦過敏原(蛋白質)的摩爾質量,32 663 g/mol;1 000為換算系數。

1.8 不確定度來源分析

綜上可知,本研究方法的不確定度來源主要包括樣品稱量、重復性試驗、方法準確度、樣品前處理過程和樣品溶液測定過程,同時每個過程引入的不確定度又有各自的分量,結合文獻[13-14]將這些不確定度來源和相互關系用“魚骨圖”表示,具體見圖1。

圖1 不確定度來源分析Fig.1 Analysis of uncertainty sources

1.9 樣品稱量引入的合成相對標準不確定度um,rel

本研究用使用萬分之一電子天平稱樣,每次稱量會引入相對標準不確定度,而樣品稱量引入的相對標準不確定度由多次稱量的不確定度合成。單次稱量的相對標準不確定度以及樣品稱量引入的合成相對標準曲線不確定度的計算見式(2)～(3)。

(2)

式中:um,rel(n)為單次稱量的相對標準不確定度;um為單次稱量的標準不確定度,g。

(3)

式中:um,rel為供試品稱量過程引入的合成相對標準不確定度。

1.10 重復性試驗引入的相對標準不確定度ur,rel

平行稱量同一肉制品樣品6份,按1.6所示方法處理,得到6次測定結果的均值。由于此不確定度分量對應的測量值屬于多次獨立重復測量的結果,可按照A類不確定度評定[15],具體計算見式(4)。

(4)

式中:ur為重復性試驗引入的標準不確定度,mg/kg;ur,rel為重復性試驗引入的相對標準不確定度;Sr為n份平行樣品含量測定結果的標準偏差,mg/kg;ci為單份樣品的含量測定結果,mg/kg;c0為n份平行樣品含量測定結果的平均值,mg/kg;n為樣品重復性試驗測定的次數。

1.11 方法準確度引入的相對標準不確定度ua,rel

方法準確度一般用回收率來表示。本次回收率試驗過程中選取3個濃度水平進行加標,在每個濃度水平中平行處理6份樣品,共得出回收率試驗數據18個,可計算得到回收率的平均值。按照顯著性檢驗(t檢驗),若回收率的平均值與100%的差異有統計學意義,引入的不確定度即用回收率平均值的標準偏差計算[13],具體計算見式(5)。

(5)

式中:ua為回收率平均值的標準不確定度,%;ua,rel為方法準確度引入的相對標準不確定度;Sa為回收率平均值的標準偏差;ai為單次回收率,%;a0為回收率的平均值,%;n為回收率測定的次數(n=18)。

1.12 樣品前處理過程引入的相對標準不確定度uxv,rel

樣品的前處理過程用到了不同量程的移液器進行吸液,分別為1～10 mL移液器吸液10 mL,0.5～5 mL移液器吸液5 mL,100～1 000 μL移液器分別吸液1、0.5和0.44 mL,10～100 μL移液器吸液40 μL(0.04 mL)以及0.5～10 μL移液器吸液10 μL(0.01 mL),共經7次操作,具體計算見式(6)。

(6)

式中:uxv,rel為前處理過程取引入的相對標準不確定度;u(v1),u(v2),…,u(vi)分別為用移液器吸液體積為v1,v2,…,vi時的引入的相對標準不確定度;n1,n2,…,ni為用移液槍進行吸液v1,v2,…,vi的操作次數。而每次吸液操作引入的相對標準不確定度又由移液器的校準u1(vi)、溫度效應u2(T,vi)和吸液體積重復性u3(vi)引入的相對標準不確定度3個分量合成得到。

u1(vi)的計算見式(7)。

(7)

式中:u1(vi)為移液器校準引入的相對標準不確定度;Evi為移液器對應吸液體積的允許誤差,mL;vi為移液器對應的吸液體積,mL;k為包含因子。

u2(T,vi)的計算見式(8)。

(8)

式中:V為量具取液或者定容的體積,mL;ΔT為實驗環境的實際溫度與實驗室標準溫度(20 ℃)的偏差,℃(本次取值為5 ℃);2.1×10-4為水的膨脹系數,℃-1。

u3(vi)的計算見式(9)。

u3(vi)=Svi/vi

(9)

式中:Svi為用移液器吸取樣品前處理操作中對應的各吸液體積的水10次并進行稱量的結果標準偏差,mL;vi為用移液器吸取樣品前處理操作中對應的各吸液體積,mL。

1.13 樣品溶液測定過程引入的相對標準不確定度uxc,rel

樣品溶液測定過程引入的相對標準不確定度由對照品純度up,rel、對照品稱量uω,rel、標準溶液配制us,rel和標準曲線擬合uL,rel這4部分相對標準不確定度分量合成得到,具體計算見式(10)。

(10)

up,rel的計算見式(11)。

(11)

式中:up,rel為對照品純度引入的相對標準不確定度;Ep為對照品純度允許誤差,%;p為對照品純度,%。

uω,rel的計算見式(12)。

(12)

式中:uω,rel為對照品稱量引入的相對標準不確定度;uω為對照品稱量的標準不確定度;ω為稱取對照品的質量,g。

本實驗在標準溶液配制過程中進行了100～1 000 μL移液器吸液1 mL、0.5 mL,10～100 μL移液槍吸液0.1 mL,20～200 μL移液槍吸液185.8 μL、112.0 μL,0.5～5 mL移液槍吸液2.5mL,10 mL容量瓶定容,5 mL容量瓶定容,共8種操作。因此us,rel的計算見式(13)。

(13)

式中:us,rel為標準溶液配制過程中產生的相對標準不確定度;uv1、uv2、…、uvi分別為使用不同量具(不同規格移液器或容量瓶)的吸液或定容體積為v1、v2、…、vi時的產生的相對標準不確定度;n1、n2、…、ni為吸液或定容體積為v1、v2、…、vi時對應量具的使用次數。每次吸液或定容的操作產生的相對標準不確定度又由量具的校準u1(vi)、溫度效應u2(T,vi)和量具體積重復性u3(vi)的相對標準不確定度合成得到。對應的計算方法參照1.12中的公式(7)～(9)。

uL,rel的計算見式(14)～(16)。

(14)

(15)

(16)

式中:SL為標準曲線的剩余標準差;a和b分別為標準曲線的截距和斜率;n為擬合標準曲線的濃度點數;p為樣品的測定次數;C0為標準曲線各點濃度的平均值;C為樣品溶液中待測成分濃度的平均值;C0j為標準曲線各點的濃度;Aaj為各標準曲線各點的實際響應值;Aj為根據回歸方程計算的各點理論響應值;uL為標準曲線擬合的標準不確定度;uL,rel為標準曲線擬合過程引入的相對標準不確定度。

1.14 方法的合成相對標準不確定度和擴展不確定度

方法的合成相對標準不確定度(uc,rel)由各相對標準不確定度分量通過式(17)計算。

(17)

方法的相對擴展不確定度(Urel)計算見式(18)。

Urel=kuc,rel

(18)

式中:uc,rel為方法的合成相對標準不確定度。

方法的合成標準不確定度(uc)的計算見式(19)。

uc=uc,relX

(19)

式中:X為重復性試驗測定結果均值。

方法的擴展不確定度(U)計算見式(20)。

U=kuc

(20)

2 結果與討論

2.1 um,rel計算結果

2.2 ur,rel計算結果

2.3 ua,rel計算結果

2.4 uxv,rel計算結果

2.4.1 移液器的校準引入的相對標準不確定度u1(vi)

2.4.2 溫度效應引入的相對標準不確定度u2(T,vi)

2.4.3 吸液體積重復性引入的相對標準不確定度u3(vi)

據式(9)計算,u3(10 mL)=0.007 59,u3 (5 mL)=0.000 314,u3(1 mL)=0.000 895,u3(0.5 mL)=0.001 21,u3(0.44 mL)=0.001 06,u3(0.04 mL)=0.001 43,u1(0.01 mL)=0.007 67。

2.4.4 前處理過程引入的相對標準不確定合成

根據2.4.1～2.4.3節的計算結果,可以合成不同移液器在各自吸液體積時的相對標準不確定度,具體計算如下

結合前處理過程中不同移液器吸液不同體積操作的次數,據式(6)合成前處理過程中引入的相對標準不確定度,具體結果為

2.5 uxc,rel計算結果

2.5.1 對照品純度和對照品稱量引入的相對標準不確定度up,rel、uω,rel

2.5.2 標準溶液配制引入的相對標準不確定度us,rel

對于100～1 000 μL移液器,吸液1 mL、0.5 mL產生的相對標準不確定度在2.4.1節中已說明,分別為u1 mL=0.003 62,u0.5 mL=0.005 94。

按照2.4.2所述,據式(8),溫度效應引入的相對標準不確定度均為0.000 606。

體積重復性引入的相對標準不確定度按2.4.3節所述參照公式(9)計算的得到。各移液槍體積重復性不確定分別為u3(0.1 mL)=0.004 28,u3(185.8 μL)=0.003 05,u3(112 μL)=0.002 57,u3(2.5 mL)=0.000 903。容量瓶體積重復性不確定度計算過程為:分別對5 mL、10 mL容量瓶用超純水定容,稱質量,重復此操作10次,用得到的稱量數據計算標準偏差,進而得到相對標準不確定度:u3(5 mL A)=0.000 333;u3(10 mL A)=0.001 50。

對每次吸液或定容的操作產生的相對標準不確定度的合成,結果如下

根據式(13)合成標準溶液配制過程中引入的相對標準不確定度us,rel

2.5.3 標準曲線擬合引入的相對標準不確定度uL,rel

外標IR-9的標準曲線方程y=1.848 4x-0.008 6,相關系數r2=1(n=5,相關系數大于 0.999)。橫坐標為外標的物質的量濃度,縱坐標為外標峰面積與同位素內標峰面積的比值乘以內標濃度。據式(14)～(16),標準曲線各點濃度C0j分別為0.001、0.01、0.1、0.5和2.0 μmol/L;Aaj分別為0.002 0、0.017 0、0.171 0、0.901 0和3.691 0;Aj分別為-0.006 8、0.009 9、0.176 2、0.915 6和3.688 2。重復性試驗中樣品溶液中待測成分濃度的平均值C為0.107 μmol/L,C0為0.522 2 μmol/L,b和a分別為1.848 4和-0.008 6。通過以上數據可計算得到uL=0.003 95 μmol/L。

2.5.4 樣品溶液測定過程引入的相對標準不確定度合成

據式(10),結合2.5.1～2.5.3節的計算結果,對樣品溶液測定過程引入的相對標準不確定度進行合成,uxc,rel的具體結果為

2.6 合成相對標準不確定度和擴展不確定度計算

據式(17)計算,由各不確定度分量合成相對標準不確定度uc,rel為

據式(18),取置信度為95%時的擴展因子k=2,得到方法的相對擴展不確定度為Urel=2×0.057 9=0.116。

據式(19),其中X取重復性試驗測定結果均值,20.90 mg/kg,得方法的合成標準不確定度uc=0.057 9×20.90=1.21 mg/kg。

據式(20),仍取置信度為95%時的包含因子k=2,計算得到方法的擴展不確定度U=2×1.21=2.42 mg/kg。

因此,運用本方法定量分析肉制品中蝦過敏原含量的結果為(20.90±2.42) mg/kg。

2.7 各不確定度分量的占比

綜上可知,本方法引入的相對標準不確定度由樣品稱量、重復性試驗、方法準確度、樣品前處理過程和樣品溶液測定過程5部分產生的相對標準不確定度分量合成得到,各不確定度分量的占比見表2。由表2可直觀看出,用此方法進行定量分析,檢測結果的不確定度主要來源于樣品溶液測定過程。進一步觀察全部不確定度評定過程可知,樣品溶液測定過程不確定度的主要來源為對照品純度、對照品稱量、標準溶液配制和標準曲線擬合,占比分別為0.4%、33.5%、21.8%和44.4%。

表2 UPLC-MS測定肉制品中蝦過敏原含量的不確定度分量占比

2.8 分析討論

結合不確定度評定結果和2.7節所示不確定度分量占比分析可知,對照品的稱量和標準曲線擬合過程產生了較大的不確定度。

對于對照品的稱量,本次實驗采用的是十萬分之一天平,稱取1.04 mg,而十萬分之一天平的實際分度值為0.01 mg,如果按照《中華人民共和國藥典》(2020年版)凡例中的要求“‘精密稱定’系指稱取重量應準確至所取重量的千分之一”(注:此處的“重量”即為“質量”),則用該天平稱樣至少應為10 mg,才能使得稱樣品的千分之一不小于天平的實際分度值[20]。由于本次研究過程得到的合成肽段較少,可能導致不確定度的放大。因此,在實際檢測過程中,稱量對照品的質量應確保大于所使用天平的最小稱樣量。

對于標準曲線擬合過程,本實驗標準工作溶液濃度為0.001～2.000 μmol/L,跨越3個數量級。這可能導致標準曲線各點濃度的平均值偏差的平方和變大,由式(14)可知,該值放大會增加標準曲線擬合的標準不確定度。因此,在實驗過程中應根據樣品中待測成分的實際含量合理配制標準曲線工作溶液的濃度范圍。

從前期方法開發階段對實際樣品的檢測結果可知,蝦過敏原含量最低值2.3 mg/kg,最高值為448.1 mg/kg。依據GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》可知,被測組分含量在1～1 000 mg/kg時,實驗室內變異系數應在3.8%～11%(重復測定次數至少為6)[21]。在2.6節中所列方法的相對擴展不確定度為0.116(即11.6%),雖然實際檢測時通常制備2份平行樣,但為盡可能避免不確定度影響結果的準確性,所以在使用本方法檢測樣品中蝦過敏原含量時,報告的檢測結果最好帶有與結果單位相同的測量不確定度[22]。

3 結論

本研究評定了用UPLC-MS法測定肉制品中蝦過敏原含量過程存在的不確定度,發現定量分析結果的不確定度主要來源是樣品溶液測定過程,而其中對照品的稱量和標準曲線的擬合產生的不確定度較大,應在實驗中采取增大對照品稱樣量和合理化標準曲線工作溶液濃度范圍等方式以減少不確定度,并在報告檢測結果時附帶與結果單位相同的不確定度。本研究將所開發的蝦過敏原含量測定方法中可能產生的不確定影響進行定量表示,可為后期準確測定肉制品中蝦源過敏原的含量提供科學依據。