貽貝足蛋白fp-5在大腸桿菌中的表達、修飾與功能分析

姚 林,謝紫莎,王 瑞,2,張魯嘉,李 莎,2

(1. 南京工業大學 食品與輕工學院,江蘇 南京 211800;2. 南京工業大學 材料化學工程國家重點實驗室,江蘇 南京211800;3. 華東師范大學 化學與分子工程學院,上海 201100)

貽貝(mussel)多生長在寒溫帶,屬廣鹽性貝類,遍布世界各沿海國家,其分泌的足絲能夠形成足絲盤固定在海洋礁石上[1-2]。貽貝足絲的主要成分為貽貝足蛋白(Mfp),該蛋白具有卓越的黏附能力、良好的生物相容性和生物降解性,因此在生物醫藥領域作為一種生物膠黏劑被廣泛研究[3-4]。其中,3,4-二羥基苯丙氨酸(Dopa)在黏附中起到至關重要的作用,使Mfp能夠通過氫鍵、π-π/π-陽離子相互作用、靜電相互作用、氧化交聯和金屬-鄰苯二酚配位鍵與底物相互作用[5]。目前已經報道的Mfp有6種(Mfp-1～Mfp-6),其中Mfp-5位于貽貝足底部與外界基層接觸部分,Dopa含量高達25%～30%,是發揮黏附作用的關鍵蛋白[6]。

在天然條件下,通過酸萃取法直接從貽貝足部獲得的蛋白量極少[7-8]。利用基因工程手段在大腸桿菌(E.coli)中合成貽貝足蛋白是一種可行的技術,有望帶來巨大的經濟和社會效益。然而,大腸桿菌細胞無法實現將酪氨酸殘基羥基化為Dopa的翻譯后修飾過程,而體外通過酪氨酸酶修飾存在效率低的缺陷。Choi等[9]將貽貝融合蛋白fp-151與來自抗生鏈霉菌(Streptomycesantibiocus)的酪氨酸酶(TyrSa)共表達,得到cofp-151,與體外修飾蛋白相比,黏合強度提高了4倍。該研究為改善重組貽貝足蛋白的功能提供了新的思路,而高效的酪氨酸酶是實現這一過程的關鍵因素之一。同時,Streptomycescastaneoglobisporu具有更強的黑色素合成能力[10-11],來源于S.castaneoglobisporus的酪氨酸酶(TyrSc)活性更強。此外,來自多刺疣微菌(Verrucomicrobiumspinosum)的酪氨酸酶(TyrVs)可高效生產L-Dopa,有助于提升Mfp黏合性能[12]。

為了進一步改善Mfp在真核表達系統中產量低、在原核系統中缺乏至關重要的翻譯后修飾過程的問題,本研究在E.coli中表達地中海貽貝足蛋白(fp-5),同時將不同來源的酪氨酸酶(TyrSa、TyrSc、和TyrVs)與fp-5共表達進行體內修飾,并對修飾前后的fp-5蛋白測定修飾率和性能,以期為貽貝足蛋白的功能性表達與潛在應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

使用的菌株、質粒和引物列于表1。大腸桿菌E.coliDH5α和大腸桿菌E.coliBL21(DE3)分別作為克隆宿主和表達宿主。密碼子優化后的基因合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司,引物合成及測序驗證委托通用生物系統(安徽)有限公司。胰蛋白胨和酵母提取物,Oxoid公司;限制性核酸內切酶和Primerstar Max聚合酶,ThermoFisher公司;4×SDS-PAGE上樣緩沖液和標準蛋白分子量Marker,寶日醫生物技術(北京)有限公司;來源于蘑菇的酪氨酸酶,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其他化學試劑均為市售分析純。

表1 本研究使用的菌株、質粒和引物

1.2 方法

1.2.1 重組表達載體的構建

從NCBI數據庫中搜索得到貽貝足蛋白fp-5的cDNA基因mgfp-5序列(GenBank AY521220.1),并基于大腸桿菌的密碼子使用偏好進行了密碼子優化。根據模板基因序列和pET28a(+)載體設計引物P1和P2,擴增成熟肽編碼區域。用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR擴增產物,并回收mgfp-5基因,BamHⅠ和XhoⅠ限制性內切酶對pET28a(+)質粒和PCR產物雙酶切并膠回收,再將線性質粒和PCR產物在37 ℃下連接30 min,所得質粒命名為pET28a(+)-fp5,在N端帶有6×His標簽。

類似地,將編碼不同來源酪氨酸酶的DNA序列合成并分別插入pACYCDuet-1的BamHⅠ/HindⅢ 酶切位點和NdeⅠ/XhoⅠ 酶切位點(TyrSa/ORF438:GenBank M11582.1;TyrSc/ORF378:GenBank AY254101.1/GenBank AY254102.1);pETDuet-1的NdeⅠ/XhoⅠ 酶切位點(TyrVs:GenBank MK550618.1)。得到的質粒分別命名為pACYC-TyrSa-438、pACYC-TyrSc-378和pETDuet-TyrVs。用引物對P3/P4從pET28a-fp5擴增mgfp-5基因,連接到EcoR Ⅰ/HindⅢ 酶切的pETDuet-TyrVs線性載體上,得到質粒pETDuet-TyrVs-fp5。

1.2.2 重組質粒的轉化

用化學轉化法將重組質粒pET28a-fp5轉入E.coliBL21(DE3)感受態細胞中,產物在抗性平板(含25 μg/mL卡那霉素)上均勻涂布,37 ℃過夜培養后挑取單克隆進行雙酶切驗證,驗證正確的陽性克隆送至測序。

用CaCl2法制備工程菌E.coli(pET28a-fp5)感受態,然后將pACYC-TyrSa-438、pACYC-TyrSc-378轉化至該感受態細胞,得到雙載體表達系統。將pETDuet-TyrVs-fp5轉化至E.coliBL21(DE3)感受態細胞,實現酪氨酸酶和fp-5共表達。同上述方法涂布在相應抗性的平板并進行驗證。

1.2.3 重組貽貝足蛋白的表達純化

挑取測序正確的單克隆接種于5 mL含有25 μg/mL卡那霉素的LB培養基(NaCl 10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L)中,37 ℃、200 r/min過夜培養。將菌液按1%的接種量轉接至100 mL相應抗性的LB液體培養基中,振蕩培養OD600達到0.6～0.8,加入誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度1 mmol/L,相同條件下繼續培養6 h。發酵結束后在5 000 r/min、4 ℃下離心20 min收集菌體,并儲存在-80 ℃以供后續使用。

將收集的菌體用磷酸緩沖鹽液(PBS)洗滌,參照文獻[13]純化目的蛋白。用Bradford法檢測蛋白質含量后冷凍干燥,-80 ℃保存。

1.2.4 重組貽貝足蛋白的修飾

1)NBT/Gly染色試驗。由于硝基藍四氮唑(NBT)在堿性條件下發生氧化還原反應具有染色能力,因此常用NBT/Gly染色法檢測多巴和多巴醌的存在。將凍干蛋白粉重溶在0.1 mol/L PBS(pH 7.0)中,使用10 U來源于雙孢蘑菇的商品化酪氨酸酶室溫下振蕩修飾6 h,得到體外酪氨酸酶修飾的fp-5(mfp-5)。牛血清白蛋白(BSA)為陰性對照,分別將2 μL質量濃度為1 mg/mL的蛋白溶液滴在PVDF膜表面,37 ℃下過度干燥后,參照文獻 [13]進行染色試驗。

2)差異光譜法。為了定量酪氨酸酶修飾的fp-5中的Dopa含量,酸-硼酸鹽差異光譜法測定。在堿性pH下Dopa與硼酸鹽配位化合,因此紫外吸收光值更高。用紫外-可見分光光度計測量1 mmol/L Dopa標準品和修飾后fp-5分別在0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L硼酸鈉中250～350 nm波長處的吸光值。用樣品在0.1 mol/L硼酸鈉中292 nm處的吸光值減去0.1 mol/L HCl中的吸光值,得到差異光譜值。根據比爾定律(式(1))計算樣品中Dopa的濃度。

A=εbc

(1)

式中:A—Dopa在292 nm下的吸光差值;ε—摩爾吸光系數,3 200 L/(mol·cm);b—吸收層厚度,cm;c—Dopa的濃度,mol/L。

再以蛋白濃度計算得到Dopa的數量,每個fp-5分子含有20個酪氨酸殘基,由此得到修飾率[14]。

1.2.5 重組貽貝足蛋白的功能分析

1)附著力。研究了未修飾和修飾fp-5在不同類型材料表面的涂層能力。具體涂層顯色過程參照文獻[15],增設了聚苯乙烯和聚乙烯兩種較玻璃具有不同親疏水性的材料。通過Gel-Pro Analyzer軟件(Media Cybernatics,version 4.0.0.4)對蛋白斑點圖像進行掃描分析,比較斑點強度。每個樣品重復測量3次。

2)黏附力。通過Mfp黏結兩塊鋁片(寬10 mm×長 100 mm)的搭接剪切實驗,可以測量Mfp的大規模黏附強度。將鋁片依次浸泡在正己烷、丙酮、乙醇和MQ水中15 min,清潔鋁片表面[16]。在室溫下干燥過夜后,在每個鋁片黏附端滴加10 μL的50 g/L乙酸溶液,將5 mg凍干蛋白粉溶解并用抹刀均勻涂抹,2個鋁片覆蓋重疊(10 mm × 10 mm)。為保證重疊區貼合均勻,用夾子固定,放入37 ℃培養箱3 h進一步交聯。用萬能材料試驗機測量剪切力,用100 N稱重傳感器,剪切方向的速度為 2 mm/min。

2 結果與討論

2.1 序列分析及重組質粒的構建

用Signalp-5.0在線軟件[17]進行信號肽預測,通過Neighbor-Joining方法,對細菌和真菌來源的酪氨酸酶進行系統發育樹分析,并對重組載體進行驗證,結果見圖1。由圖1可知:fp-5的成熟肽區域由76個氨基酸構成。經NCBI同源性比對,貽貝5型足蛋白具有高度保守序列,來源于紫貽貝(Mytilusedulis)和地中海貽貝(Mytilusgalloprovincialis)的5型足蛋白的氨基酸序列幾乎一致。來源于Verrucomicrobium屬、Strepthomyces屬和Agaricus屬的酪氨酸酶處于不同進化枝,其中TyrSa和TyrSc處于相對近距離進化枝。為了實現重組TyrSa/TyrSc的功能表達,插入ORF438/ORF378片段,它們可以促進Cu2+進入活性位點以具有酶活[18]。如果表達TyrVs去除C端延伸區的截斷部分,酶活會更高[19]。

圖1 序列分析及重組載體的驗證Fig.1 Sequence analysis and verification of recombinant vector

通過PCR從克隆質粒擴增目的基因片段,fp-5、TyrSa、ORF438、TyrSc、ORF378和TyrVs的基因片段的理論大小分別為250、822、441、822、381和1 011 bp。對構建的重組載體進行雙酶切驗證,條帶大小與預期一致(圖1(d))。再將構建的質粒送至公司測序驗證,插入序列正確,表明重組表達載體構建成功。

2.2 重組貽貝足蛋白的表達與純化

圖2為重組貽貝足蛋白的表達與純化結果。由圖2可知:E.coli(pET28a-fp5)經IPTG誘導后能夠表達分子量～1.24×104的可溶蛋白fp-5,與理論分子量一致,表達量約為總蛋白量的51%,產量約為19.3 mg/L。N端融合6×His標簽的fp-5經Ni柱親和層析純化,洗脫得到純度約98%的目的蛋白(圖2(b)),在雙載體和單載體系統中,重組fp-5蛋白與來源于細菌的酪氨酸酶成功共表達,體內修飾fp-5(cofp-5)和TyrVs(～3.80×104)以可溶形式表達,而TyrSa(～3.24×104)和TyrSc(～3.27×104)大部分表達為包涵體,cofp-5在單載體表達系統中的分子量(～1.07×104)小于雙載體系統中的分子量(～1.24×104)。ORF438(～1.49×104)或 ORF378(～1.30×104)的分子量與cofp-5相似,因此,它們不能通過SDS-PAGE清楚地區分。當單獨攜帶pACYC-TyrSa-438或pACYC-TyrSc-378質粒的大腸桿菌表達時,ORF438或ORF378僅以不溶性形式存在(數據未顯示)。

圖2 重組蛋白的表達與純化SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein expression and purification

2.3 重組貽貝足蛋白的修飾分析

通過NBT/Gly氧化還原循環染色方法,定性檢測Dopa殘基,不同顏色強度的斑點反映了不同水平的Dopa含量,結果見圖3(a)。由圖3(a)可知:作為陰性對照的BSA和缺乏Dopa的未修飾fp-5完全沒有被染色,體外修飾的mfp-5可以看到一個淡藍紫色的斑點,與TyrSa體內修飾的cofp-5(5-Sa)顏色強度相近。此外,TyrSc體內修飾的cofp-5(5-Sc)顏色較淺,而TyrVs體內修飾的cofp-5(5-Vs)顯示出最強的藍紫色斑點。由此可見,不同修飾方式和酪氨酸酶能夠對fp-5蛋白的酪氨酸殘基進行不同程度的修飾。

圖3 cofp-5中酪氨酸殘基修飾的分析Fig.3 Analysis of tyrosine modifications in cofp-5

進一步比較3種表達系統中cofp-5的產量和酪氨酸的修飾率,結果見圖3(b)。由圖3(b)可知:體內修飾蛋白5-Vs、5-Sa和5-Sc的產量分別為18.6、27.2和19.1 mg/L。該產量低于先前文獻[20]的fp-5產量(4.5 L培養物產量約為50 mg/L),可能是由于搖瓶試驗和發酵罐發酵工藝的不同,其中5-Vs表達量的降低可能是由于TyrVs的大量可溶表達。

通過酸-硼酸鹽差異光譜分析定量體內修飾cofp-5中Dopa,結果見圖3(b)。由圖3(b)可知:5-Vs中的20個酪氨酸殘基中約有11個羥基化為Dopa,修飾率約為55.20%,高于5-Sa(約15.70%)和5-Sc(約26.00%)。目前僅有報道對共表達修飾前后的黏附性進行測試,而未進一步分析修飾率[9]?？傮w而言,采用共表達體內修飾與體外修飾的貽貝足蛋白(9.6%)相比[21],修飾率顯著提高。

2.4 重組貽貝足蛋白在不同表面的附著力

為了研究不同酪氨酸修飾率的fp-5蛋白的附著和涂層性能,本研究對BSA、mBSA(體外修飾的BSA)、fp-5、mfp-5(體外修飾的fp-5)、5-Vs、5-Sa和5-Sc進行了對比分析。分別將這幾種蛋白質溶液滴在不同種材料的表面,即載玻片(glass)、聚苯乙烯板(PS)和聚乙烯薄膜(PE)。通過振蕩沖洗后考馬斯亮藍染色,研究蛋白附著力強度,結果如圖4(a)、4(b)和4(c)所示。由圖4(a)～(c)可知:BSA和mBSA被完全沖掉,未修飾和修飾的fp-5不同程度地黏附在所有測試基材上。修飾后的fp-5表現出顯著的表面包覆能力,而未修飾的fp-5輕微黏附在表面,這表明Dopa不是促成Mfp黏附特性的唯一因素[22]。已有的研究僅對Mfp(fp-5[23]和fp-3[15])體外修飾前后在玻璃表面的附著力進行測試,其中fp-5的附著強度僅通過肉眼觀察比較。選取不同親疏水性表面,通過軟件分析斑點強度,發現在更疏水的表面,Dopa對附著力影響更大,這可能是由于Dopa含有大量的芳香結構,通過疏水相互作用附著在疏水材料表面,在Dopa氧化自聚合過程中,逐漸形成更大的共軛結構,疏水作用顯著增強。

圖4 修飾/未修飾fp-5在各種表面涂層分析Fig.4 Recombinant fp-5 with or without tyrosinase modified coating to various surfaces

通過Gel-Pro軟件對蛋白斑點強度進行分析,結果如圖4(d)～4(f)所示。由圖4(d)～4(f)可知:5-Vs的蛋白斑點顏色在所有材料表面相對較深。這說明通過酪氨酸酶共表達修飾,將酪氨酸殘基羥基化為Dopa,Dopa通過π-π/π-陽離子相互作用,從而一定程度提升了重組貽貝足蛋白的附著力。

2.5 重組貽貝足蛋白的黏附強度

為了量化重組貽貝足蛋白的大規模黏附水平,通過搭接剪切試驗,分別對fp-5、5-Vs、5-Sa和5-Sc黏附鋁片的情況進行研究,結果如圖5(a)所示。對5-Vs進行黏附試驗,結果見圖5(b)。由圖5(a)可知:未修飾fp-5的剪切強度為(0.07±0.002) MPa,而5-Sa((0.08±0.030) MPa)和5-Sc((0.14±0.006) MPa)的剪切強度值略高于未修飾fp-5的。值得注意的是,cofp-5中黏附強度最大的為5-Vs((0.32±0.02) MPa),約為未修飾的fp-5的4.6倍。這是由于酪氨酸酶體內修飾后,Dopa通過形成金屬-鄰苯二酚配位鍵增強黏附作用。盡管cofp-5的整體黏附強度小于之前的文獻報道,其中fp-5的強度為1.11 MPa[20],但這些研究是在不同的實驗條件下進行的,并且先前的研究未測試修飾后的黏附強度,難以直接進行比較。由圖5(b)可知:力-距離曲線的最高點為黏合頭的物理斷裂處,后逐漸下降。綜上,采用來源于多刺疣微菌的酪氨酸酶體內修飾fp-5的策略獲得了具有強黏附特性的貽貝蛋白(5-Vs)。

圖5 fp-5和cofp-5的大規模黏附強度Fig.5 Bulk-scale adhesive strength of fp-5 and cofp-5

3 結論

在E.coli中實現fp-5的共表達修飾,并對修飾率和黏附性進行定量分析,主要結論如下:

1)成功在大腸桿菌中共表達fp-5和酪氨酸酶,實現酪氨酸殘基體內羥基化為Mfp黏附過程中的關鍵物質Dopa。

2)比較不同體內修飾cofp-5的產量和修飾率,篩選出最佳共表達系統,蛋白5-Vs產量18.6 mg/L,修飾率約為55.20%,遠高于體外修飾效率。

3)對5-Vs附著力和黏附強度進行評價,黏附力約為未修飾fp-5的4.6倍,有望作為生物黏合劑應用于生物醫用材料等領域。