陰離子交換樹脂固定化核酸酶P1的研究

王天賜,徐 康,侯亞利,楊忠華

(武漢科技大學 化學與化工學院,湖北 武漢 430081)

5′-核苷酸及其衍生物具有很高的營養保健價值、藥用價值和鮮味,被廣泛用于食品添加劑[1]、嬰幼兒奶粉[2]、藥品[3]和飼料[4]中。目前,工業上主要利用核酸酶P1生產5′-核苷酸。然而,游離酶在實際應用時存在易失活、酶與產物難以分離、對極端環境的耐受能力差、成本昂貴、難以重復利用等問題。通過研究,科研工作者們發現將核酸酶P1進行固定化不但可以使核酸酶P1重復利用,在一定程度上還可以增強目標酶的穩定性[5]。

載體的選擇是固定化酶技術的核心,它直接關系到固定化酶的酶學性質、固定化效果和酶學性質。樹脂作為一種價格低廉、載酶量大、穩定性好且對人體無毒無害的載體,受到研究者們的青睞,因而被廣泛使用。目前,以樹脂作為固定化載體時,最常用的固定化方法為吸附法和交聯法。吸附法雖然具有操作簡單、條件溫和及酶活回收率高等優點,但是固定化酶的穩定性較差,導致固定化酶很難滿足工業生產的需要。對于交聯法,雖然酶活回收率會有一定程度的降低,但固定化酶的穩定性會大幅度提高,從而可以滿足工業生產的需求。因此,工業上更多采用交聯法固定酶。Zhong等[6]發現,利用戊二醛對氨基樹脂LX-1000HA進行交聯固定化的脂肪酶,其穩定性大幅度提高,在重復利用15次后,酶活仍保留87.3%。

基于此,本研究利用不同類型樹脂對核酸酶P1進行固定化,以固定化核酸酶P1的酶活為評價標準,對固定化載體進行篩選并對固定化工藝條件進行優化,然后檢測在最佳條件下制備的固定化酶的儲存穩定性,以期為核酸酶P1固定化酶的工業化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核酸酶P1,安琪酵母股份有限公司贈予;環氧樹脂(ER)、氨基樹脂1(AR1)、氨基樹脂2(AR2)、帶氨基和環氧基的樹脂(EAR)、陽離子交換樹脂1(CR1)、陰離子交換樹脂1(AER1)、大孔吸附樹脂1(MPAR1)、大孔吸附樹脂2(MPAR2),西安藍曉科技新材料股份有限公司;陰離子交換樹脂2(AER2),鄭州勤實科技有限公司;陽離子交換樹脂2(CR2),上海安瀾德生物科技有限公司;含氰基的樹脂(CGR)、陽離子交換樹脂3(CR3),天津允開樹脂科技有限公司;醋酸、醋酸鈉、鉬酸銨、高氯酸為分析純,戊二醛(體積分數為25%)為生化試劑,國藥集團化學試劑有限公司。表1為各種樹脂的理化參數。

表1 各種樹脂的理化參數

1.2 實驗方法

1.2.1 酶活和蛋白檢測方法

蛋白質含量的測定采用Bradford染色法[7]。

核酸酶P1酶活的檢測采用紫外-可見分光光度法[8]。測定原理是,通過檢測核酸酶P1酶解RNA的產物在260 nm處的吸光值,來間接測得酶活。具體測定方法如下:以pH 5.4的30 g/L RNA為底物,在70 ℃下與酶反應,利用核酸沉淀劑(2.5 g/L鉬酸銨-25 g/L高氯酸溶液)終止反應后,于260 nm處測定析光值。酶活力定義:在所述測定條件下,1 min催化生成的核苷酸使260 nm處的吸光度A260差值為 1.0 時的酶量為一個單位(U)。

相對酶活和酶活回收率的計算分別見式(1)和(2)。

相對酶活=固定化酶酶活/固定化酶最高酶活×100%

(1)

酶活回收率=固定化酶總酶活/樣品總酶活×100%

(2)

1.2.2 核酸酶P1的初步純化

采用熱激、硫酸銨分級沉淀及透析的方法,對源于桔青霉發酵液中的核酸酶P1進行初步純化[8],從而去除雜蛋白,提高核酸酶P1的濃度。純化后酶液的蛋白質量濃度為529.0 μg/mL,酶活為13 253.3 U/mL。將該酶液儲存在4 ℃的冰箱中,作為后續實驗使用的酶液。

1.2.3 核酸酶P1的固定化

1)吸附法。取1.0 g樹脂于100 mL燒杯中,加入pH 5.4的核酸酶P1的酶液40 mL(含10 mL的核酸酶P1粗酶液),在25 ℃、60 r/min下吸附一定時間。倒去上清并用去離子水洗去未結合的酶,用濾紙吸干樹脂表面附著的去離子水,儲存于4 ℃的冰箱中備用。

2)交聯法。取1.0 g樹脂于50 mL離心管中,加入10 mL一定濃度的戊二醛,交聯一定時間后,用去離子水洗去未交聯的戊二醛。后續操作同吸附法。

1.2.4 固定化條件

載體材料的性質和固定化過程是影響固定化核酸酶P1催化性能的關鍵因素。首先,利用不同類型樹脂材料為載體固定化核酸酶P1,以吸附量和核酸酶P1的酶活為評價指標篩選最佳固定化載體。其次,采用交聯法優化固定化條件,即分別加入0.25 mL～5.0 mL的酶量、質量分數0.25%～3.0%的戊二醛、交聯時間0.5～3 h、固定化時間2 ～12 h、酶液的pH 4.2～5.8,制備固定化酶,分析探討固定化條件對核酸酶P1酶活的影響。最后,檢測在優化條件下制備的固定化酶的酶活。

1.2.5 響應面分析

1)Plackett-Burman實驗。根據單因素實驗的結果,利用Minitab軟件設計Plackett-Burman實驗,篩選出對固定化效果影響最大的3個因素,利實驗因素和水平設計見表2。

2)Box-Behnken實驗。對于Plackett-Burman實驗篩選出對固定化效果影響最大的3個因素,設計Box-Behnken實驗,確定最佳的固定化條件,實驗因素和水平設計見表3。通過Minitab軟件進行響應面模型的建立和數據處理,并進行實驗驗證。

表3 Box-Behnken實驗的因素和水平設計

1.2.6 固定化酶的穩定性

1)熱穩定性。向10 mL的離心管中分別加入等量的游離酶和固定化酶,再加入等體積10 mmol/L pH 6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液,分別置于40、50、60、70、80和90 ℃的水浴鍋中,水浴30 min,然后測固定化酶和游離酶的相對酶活。

2)酸堿穩定性。向10 mL的離心管中分別加入等量的游離酶和固定化酶,再加入等體積10 mmol/L pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液,置于4 ℃的冰箱中,保溫1 h,然后測固定化酶和游離酶的相對酶活。

3)儲存穩定性。向50 mL的離心管中分別加入等量的游離酶和固定化酶,置于4 ℃的冰箱中。第3天和第7天時測一次游離酶和固定化酶的酶活,隨后每隔7 d測一次酶活。

4)操作穩定性。將固定化酶按照1.2.1節的方法,連續操作8次,測相對酶活。將第一次的酶活定義為100%。

2 結果與分析

2.1 樹脂的篩選

ER、AR1、AR2、EAR、MR1和MR2等大孔樹脂主要是通過氫鍵和范德華力對酶分子進行吸附,而AER1、AER2、CR1、CR2、CGR等離子交換樹脂通過離子鍵和范德華力對酶分子進行吸附[9]。所有樹脂對核酸酶P1的吸附結果如表4所示。

表4 各種樹脂吸附數據統計各種樹脂吸附數據統計

注:ER為環氧樹脂,AR1、AR2為氨基樹脂,EAR為同時有氨基和環氧基的樹脂,AER1、AER2為陰離子交換樹脂,MPAR1、MPAR2為大孔吸附樹脂,CR1、CR2、CR3為陽離子交換樹脂,CGR為帶氰基的樹脂。

由表4可知: ER、MR1、MR2、CR1、CR2、CR3和CGR樹脂固定化后的酶活較低,這可能是由于樹脂表面的官能團羧基、氰基、酯基和碳18等與核酸酶P1結合后,嚴重影響了核酸酶P1活性中心,導致酶活降低。在ER、EAR、AR1、AR2、AER1和AER2這6種樹脂中,以AER1樹脂為載體時,酶活最高,主要原因可能是,與AR2樹脂相比,AR1樹脂的親水性較弱,不利于核酸酶P1和底物的結合;與AR2樹脂和RAE樹脂不同,AER1樹脂主要通過離子鍵吸附核酸酶P1,而核酸酶P1含有3個Zn2+,導致更易于形成離子鍵;與AER2樹脂相比,由于樹脂的孔徑等因素的影響,AER1樹脂對核酸酶P1的吸附量更大。以AER1樹脂為載體,僅在對樹脂進行篩選時,固定化酶的比酶活就能達到35 131.7 U/g,遠高于其他研究成果。如,劉紅等[5]以纖維素為載體,其比酶活達到6 000.0 U/g。何林姣等[10]以氨基樹脂固定化核酸酶P1,其比酶活也僅能達到10 013.0 U/g。因此,選擇離子交換樹脂AER1作為固定化酶的載體進行下一步的研究。

2.2 固定化條件的優化

2.2.1 酶量

酶量直接關系到載體所能結合的酶分子的數量,是影響固定化酶酶活的主要因素?？疾烀噶繉潭ɑ傅拿富畹挠绊?結果如圖1所示。由圖1可知:隨著酶量的增加,固定化酶的酶活先增加后基本不變,最佳的酶量為2.0 mL。當酶量從0.25 mL增至2.0 mL時,固定化酶的酶活不斷增加;當酶量從2.0 mL增至5.0 mL時,固定化酶的酶活基本不變。這可能是因為過多的酶負載在載體上會導致載體表面上酶分子聚集和酶分子的催化位點被覆蓋,使酶活不再增加[11]。綜上所述,最佳的酶量為2.0 mL。

圖1 酶量對核酸酶P1固定化效果的影響Fig.1 Effect of enzyme amount on immobilization of nuclease P1

2.2.2 戊二醛用量

戊二醛作為最常用的交聯劑,可以通過多點或多亞基固定來提高酶的穩定性[12]?？疾煳於┯昧繉怂崦窹1固定化效果的影響,結果如圖2所示。由圖2可知:隨著戊二醛質量分數的升高,固定化酶酶活先增大后減小,在戊二醛質量分數為0.25%時達到最大值。這可能是由于戊二醛可以提高酶和載體結合的穩定性,防止酶分子從載體上脫落;但是戊二醛也會和酶的活性中心交聯,導致酶活降低;而且在戊二醛的濃度較高時,戊二醛分子可能會出現羥醛縮合,附著在載體表面,從而阻礙酶分子和載體結合,導致酶活降低[13]。綜上所述,最佳的戊二醛質量分數為0.25%。

圖2 戊二醛用量對核酸酶P1固定化效果的影響Fig.2 Effect of glutaraldehyde mass ratio on immobilization of nuclease P1

2.2.3 交聯時間

交聯時間影響結合到載體上的戊二醛數量和戊二醛的穩定性,從而對核酸酶P1的固定化效果產生影響,因此考察交聯時間對固定化酶酶活的影響,結果見圖3。由圖3可知:隨著交聯時間的延長,固定化酶的酶活先增大后減小。這可能是因為當交聯時間較短時,隨著交聯時間的延長,載體和酶結合的穩定性增強,導致酶分子不易從載體上脫落,使酶活不斷增大;當交聯時間較長時,戊二醛分子會被氧化,導致無法和酶分子結合,使酶活降低。邵衛祥等[14]制備的磁性交聯酶聚集體,最佳的交聯時間為2.0 h,載體的不同導致最佳交聯時間也不同,但是在不同時長的條件下交聯時,固定化效果的變化和本研究一致。因此,最佳的交聯時間為1.5 h。

圖3 交聯時間對核酸酶P1固定化效果的影響Fig.3 Effect of cross-linking time on immobilization of nuclease P1

2.2.4 固定化時間

固定化時間是核酸酶P1和載體的接觸時間,它影響著固定在載體上的酶分子數量,對核酸酶P1的固定化效果有著巨大的影響,因此考察固定化時間對固定化酶酶活的影響,結果見圖4。由圖4可知:隨著固定化時間延長,固定化酶的酶活先增加后降低,在固定化時間為10 h時達到最大值。這可能是因為當固定化時間較短時,隨著固定化時間的延長,載體吸附的酶分子數量不斷增加;當固定化時間較長時,載體表面吸附的酶分子過多,產生了一定的空間位阻,阻礙底物和產物的進出,并且部分酶失活。這與文獻[15]的結果較為一致。

圖4 固定化時間對核酸酶P1固定化效果的影響Fig.4 Effect of immobilization time on immobilization of nuclease P1

2.2.5 pH

pH會影響酶和載體的電離狀態,進而影響酶和載體的結合與空間結構,使固定化效果受到影響[16]。因此考察pH對固定化酶酶活的影響,結果見圖5。由圖5可知:隨pH的增大,固定化酶的酶活呈現先增加后下降的趨勢,最佳的pH為5.0。這可能是由于AER1樹脂作為離子交換樹脂,與核酸酶P1的結合主要依賴離子鍵的作用。當pH發生變化時,酶分子和AER1樹脂的電離情況隨之發生變化,離子鍵也受到影響。當pH較低時,隨著pH的增大,載體表面的電荷分布逐漸有利于酶分子和載體的結合;當pH較高時,隨著pH的增加,載體表面的電荷分布逐漸不利于酶分子和載體的結合,使酶活降低[17]。固定化時最佳的pH為5.0,比核酸酶P1游離酶的最適pH為5.5[18]的低。這與Zou等[19]在制備固定化鹵醇脫鹵酶時的現象一致。

圖5 pH對核酸酶P1固定化效果的影響Fig.5 Effect of pH on immobilization of nuclease P1

2.2.6 響應面分析

1)Plackett-Burman實驗結果與分析。利用Minitab 17軟件進行實驗設計與分析,Plackett-Burman設計與結果見表5,方差分析結果見表6。以固定化酶的酶活(表觀酶活)為響應值,對數據進行分析。

表5 Plackett-Burman實驗設計及結果

表6 Plackett-Burman實驗方差分析結果

由表6可知:酶量和pH對固定化酶酶活的影響顯著,戊二醛質量分數、交聯時間和固定化時間對固定化酶酶活的影響不顯著。其中,交聯時間的P=0.124,接近0.05,所以可以將其視作對固定化酶酶活有較大影響的因素。因此,進一步研究酶量、pH和交聯時間對固定化酶表觀酶活的影響(Box-Behnken實驗)。

2)Box-Behnken實驗結果與分析。利用Minitab 17軟件進行實驗設計與分析,研究酶量(A)、pH(B)和交聯時間(C)對固定化酶酶活的影響,Box-Behnken實驗設計與結果見表7,方差分析結果見表8。以固定化酶酶活為響應值,對數據進行回歸擬合,得到固定化酶酶活與各因素的回歸方程為固定化酶酶活=-645 879+67 024A+230 998B+47 395C-14 668A2-22 218B2-13 062C2-1 233AB+ 1 875AC-2 298BC。

表7 Box-Behnken實驗設計與結果

表8 Box-Behnken實驗方差分析結果

由表8可知:模型的P=0.002<0.05,說明該模型有顯著意義。R2=0.954 4,表明該模型的擬合度很好,可以比較好地反映各因素對固定化酶酶活的影響。所有項中,AB、AC和BC是不顯著,表明酶量、pH和交聯時間的交互作用對固定化酶酶活的影響較小。

3)實驗驗證。根據響應面分析(圖6)的結果,確定最佳的固定化條件為酶量2.17 mL、pH 5.06、交聯時間1.53 h。在該條件下,模型預測的固定化酶的比酶活為47 177.09 U/g?？紤]實際的可操作性,調整固定化條件為酶量2.2 mL、pH 5.1、交聯時間1.5 h。在此條件下制備固定化酶,其比酶活為47 980.95 U/g,與預測值比較接近。這表明該模型可以很好地反映固定化酶的酶活與各種固定化條件之間的關系,固定化條件的優化比較合理。

圖6 各因素交互作用影響固定化酶酶活的響應面圖Fig.6 Response surface map of the interaction of various factors affecting the enzymatic activity of immobilized enzymes

2.3 固定化酶的穩定性

2.3.1 熱穩定性

酶對溫度的變化非常敏感。因此考察固定化酶的熱穩定性,結果見圖7。由圖7可知:隨著溫度的升高,固定化酶和游離酶的酶活回收率不斷降低,并且兩者降低的幅度基本一致,但在大部分溫度條件下,固定化酶的熱穩定性都略高于游離酶。這表明固定化后核酸酶P1的熱穩定性有一定程度的提高。

圖7 固定化酶和游離酶的熱穩定性Fig.7 Thermostability of immobilized and free enzymes

2.3.2 酸堿穩定性

考察pH對固定化酶酶活的影響,結果見圖8。由圖8可知:游離酶的穩定性受pH變化的影響較大,在pH 6.0時,穩定性最好,在4 ℃下儲存1 h后保留75.4%的酶活;而固定化酶的穩定性受pH變化的影響較小,并且在所有pH條件下的穩定性均高于游離酶。這可能是由于固定化后改變了酶分子所處的微環境,使外界環境的pH變化對酶分子的影響減小。綜上所述,固定化后核酸酶P1的酸堿穩定性大幅度提高。

圖8 固定化酶和游離酶的酸堿穩定性Fig.8 Acid-base stability of immobilized and free enzymes

2.3.3 儲存穩定性

固定化酶在實際使用時,儲存和運輸是無法避免的。如果酶的儲存穩定性不好,即使酶的其他性質再好,也失去了意義。因此儲存穩定性是衡量固定化效果的一個重要指標[20]?？疾旃潭ɑ傅膬Υ娣€定性,結果見圖9。由圖9可知,與游離酶相比,固定化酶在4 ℃下的儲存穩定性有一定程度的提高。固定化酶在4 ℃下儲存6周后,仍能保留51.8%的酶活,是游離酶的1.6倍。這可能是由于固定化后,酶分子所處的微環境發生了改變,核酸酶P1的活性中心受到了一定的保護,從而提高了酶的儲存穩定性。這有利于核酸酶P1的工業化應用,為工業化連續生產核苷酸奠定了基礎。

圖9 固定化酶和游離酶在4 ℃儲存的穩定性Fig.9 Stability of immobilized and free enzymes stored at 4 ℃

2.3.4 操作穩定性

固定化酶在實際應用中,往往會多次重復利用。因此,操作穩定性也成為了衡量固定化酶穩定性的一個重要指標。圖10為固定化酶的操作穩定性。由圖10可知:隨著使用次數的增加,固定化酶的酶活回收率不斷降低;在連續使用8次后,固定化酶的酶活只保留7.5%。這可能是由于載體為離子交換樹脂,戊二醛對穩定性的提升不足,在多次重復利用后,載體上的酶大量脫落,導致酶活不斷降低。

圖10 固定化酶的操作穩定性Fig.10 Operational stability of immobilized

3 結論

以戊二醛交聯的樹脂為載體,固定化核酸酶P1。對載體進行篩選后,確定的最佳載體為AER1樹脂。優化的固定化條件為酶量2.2 mL、戊二醛質量分數0.25%、交聯時間1.5 h、固定化時間10.0 h、pH 5.1。在該條件下制備的核酸酶P1的酶活為48 168.9 U/g。固定化酶在60 ℃下水浴30 min,酶活保留了49.6%,是游離酶的1.15倍;與游離酶相比,固定化酶在所有pH條件下的穩定性都有一定程度的提高,在4 ℃、pH 8.0下儲存1 h后保留95.8%的酶活;固定化酶在4 ℃下儲存6周后,仍能保留51.8%的酶活,是游離酶的1.6倍;固定化酶在連續使用8次后,固定化酶的酶活保留7.5%。本文的研究結果可為固定化核酸酶P1的工業化應用奠定基礎。