特異性乳糖酶的開發研究進展

侯 超,張申平,馬躍龍

(1. 上海市質量監督檢驗技術研究院,上海 200233;2. 國家食品質量監督檢驗中心(上海),上海 200233)

乳糖酶,又稱β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC 3.2.1.23),由于具有水解乳糖、生成葡萄糖和半乳糖的特點,因此可用來降低含乳糖制品中乳糖含量,提高含乳糖產品的可消化性,解決乳糖不耐受問題[1]。此外,乳糖酶還具有半乳糖苷轉移作用,可用來生產低聚半乳糖(GOS)[2]。

雖然乳糖酶的來源[3]非常豐富,包括植物、動物和微生物,但乳糖酶的實際應用企業數量少,只有廣東江門量子高科生物工程有限公司利用乳糖酶來生產低聚半乳糖,澳優集團也成功推出蘇芙拉乳糖酶調制乳粉。因為實際應用的復雜條件限制了乳糖酶的應用,如,在冷鏈條件下無法高效水解牛乳中乳糖,乳糖酶容易受到胃液的影響而散失活性,工業生產的復雜反應條件導致乳糖酶的重復使用次數少、回收率低。因此,尋找適合特定應用條件下的特異性乳糖酶就顯得尤為重要。本文對特異性乳糖酶及其酶學特性進行介紹,對定向進化和應用策略方面進行總結,為特異性乳糖酶的開發和應用提供思路,以期促進乳糖酶在乳品工業中的應用。

1 特異性乳糖酶分類及研究

特異性乳糖酶沒有嚴格的定義,它是基于乳糖酶的應用背景,即在特定應用環境中能保持高酶活和穩定性的乳糖酶,可稱為特異性乳糖酶。這需要乳糖酶具有耐高溫(>50 ℃)、低溫(<10 ℃),酶活高,耐酸性、耐鹽,酶活受溶劑影響小等特性。

1.1 耐熱乳糖酶的研究

一般把酶活最適溫度在50 ℃以上的乳糖酶稱作耐熱乳糖酶。由于耐熱乳糖酶在高溫反應條件下具有獨特的工業生產和應用優勢,包括增加底物溶解度、提高反應速率、減小水解產物對酶活的抑制作用、降低微生物的污染風險等,所以,相對于常溫乳糖酶,耐熱乳糖酶具有更強的應用性[4]。

嗜熱細菌是產耐熱乳糖酶的重要來源,嗜熱細菌一般生長溫度在55 ℃以上,以其為來源開發的乳糖酶具有較好的耐熱穩定性。Kong等[5]從嗜熱細菌中克隆了一個新的β-半乳糖苷酶基因,并在大腸桿菌細胞中表達以產生β-半乳糖苷酶,結果發現:重組酶在75～90 ℃表現出相當高的熱穩定性,重組酶在75、80、85和90 ℃下的半衰期分別為10.5、4.0、1.0和0.3 h。李云等[6]從芽孢桿菌中篩選到一株高產β-半乳糖苷酶的菌株,并對純化酶進行酶學性質研究,結果發現:β-半乳糖苷酶的最適水解反應溫度是60 ℃,而且70 ℃放置60 min后,酶活仍然保留65%,可見,該β-半乳糖苷酶具有較高的熱穩定性。乳酸克魯維酵母β-半乳糖苷酶的穩定性差限制了它在低聚半乳糖合成和其他需要高溫操作中的應用,Rico-Díaz等[7]為了獲得耐熱變體,通過在酶亞基之間引入二硫鍵的合理誘變策略獲得高活性菌株,與相同條件下的天然酶相比,耐熱穩定性增強且半衰期也有所增加[7]。

1.2 低溫乳糖酶的研究

為實現乳品的冷鏈加工和運輸,盡可能保留乳品的風味和營養成分,低乳糖牛乳的工業化生產首選低溫乳糖酶水解牛乳乳糖。理想的適合低乳糖牛乳加工的低溫乳糖酶應該在低于10 ℃以下時,仍具有較高的酶活,且催化活性不受水解產物半乳糖、葡萄糖以及牛乳中Na+和Ca2+影響。篩選適合在牛乳體系中高效水解乳糖的低溫乳糖酶,是低乳糖牛乳生產企業關注的焦點,因此,在低溫下具有高活性的乳糖酶具有商業、經濟和環境效益[8]。

大多數低溫乳糖酶來自嗜冷菌和節桿菌,因為嗜冷菌長期生長在低溫環境下,最適生長溫度低。如,關波等[9]利用嗜冷桿菌制備低溫乳糖酶,生產的乳糖酶在低溫下具有較高的酶活。拉杰等[10]制備了能夠在低溫下生產無乳糖或低乳糖產品的乳糖酶,這些乳糖酶不但具有相對高的酶活,而且在反應時對溫度和pH的耐受性較好。張宇潔等[11]從天山中國一號冰川沉積物中分離出產低溫β-半乳糖苷酶的菌株,對其酶學特性研究后發現:在4 ℃時,該酶酶活為最大酶活的78%;10 mmol/L的Na+對酶活抑制作用不明顯,Ca2+對酶活具有激活作用。李夢等[12]建立了一種符合微生物宏基因組文庫構建要求的DNA提取方法,為低溫乳糖酶基因篩選奠定了基礎。姚從禹[13]從海洋微生物中克隆β-半乳糖苷酶,在大腸桿菌中進行外源表達,針對該酶在低溫下酶活好但不穩定的特性,利用復合酶保護劑提高其穩定性,使它能高效水解牛奶中的乳糖。

1.3 耐鹽乳糖酶的研究

乳清是生產干酪的副產物,直接排放會造成嚴重的環境污染。若利用乳糖酶水解乳清可合成低聚半乳糖,但乳清中含有的無機鹽會對乳糖酶的酶活造成一定的抑制作用,所以乳糖酶耐鹽能力影響其應用前景。張文洪等[14]發現,滇金絲猴糞便來源的β-半乳糖苷酶具有很好的NaCl穩定性,經4 mol/L的NaCl溶液處理1 h后,相對酶活保留率仍很高。Wang等[15]等通過篩選土壤宏基因組文庫,獲得一種新的β-半乳糖苷酶基因,并將其在畢赤酵母中表達,結果發現,該酶在0 ℃不僅有好的活性,而且低濃度鹽溶液(10 mmol/L NaCl溶液)能提升酶活。Karan等[16]對南極洲深湖中的鹽藻鹵蟲來源的β-半乳糖苷酶基因進行克隆表達,并表征酶學性質,結果發現,該酶具有嗜冷和嗜鹽特性,且在4 mol/L NaCl溶液或20%(體積分數)有機溶劑中都有很好的穩定性。

1.4 酸性乳糖酶的研究

在酸性條件下發揮最大酶活性的乳糖酶叫酸性乳糖酶,可用于生產乳糖酶制劑,能緩解機體乳糖不耐受[17]。酸性乳糖酶通過水解奶粉中的乳糖,可促進牛奶有效成分的吸收和利用[18]。如,黑曲霉和米曲霉來源的乳糖酶酶活最適pH分別在3.0～4.0、4.5～5.1,適合干酪和酸性乳清的水解[19]。

1.5 耐溶劑化乳糖酶的研究

乳清粉是乳清干燥濃縮后產物,可利用乳糖酶將乳清粉中的乳糖水解成葡萄糖和半乳糖,而且釀酒酵母能以此為底物發酵制備乙醇[20],但乳糖酶的酶活在反應中會受到乙醇溶劑的影響,繼而影響最終的生產效率。Karan等[21]發現,極端嗜鹽古菌Halorubrumlacusprofundi來源的乳糖酶在體積分數10%的乙醇溶液中穩定且具有活性,高鹽濃度(4.5 mol/L NaCl)溶液對其活性沒有影響。Wang等[22]從新疆鹽堿地的菌中克隆并表達一個乳糖酶編碼基因galM,結果發現,該酶在多種有機溶劑中仍能保持活性,并且對葡萄糖和半乳糖也具有良好的耐受性,可以此來生產生物乙醇。

2 特異性乳糖酶催化機制

特異性乳糖酶的催化機制主要有保持型機制和反轉型機制。目前普遍認為特異性乳糖酶的催化機制是保持型水解機制[23]。特異性乳糖酶催化乳糖反應可簡單分為2個過程(圖1),分別是糖基化和去糖基化過程。親核氨基酸攻擊半乳糖苷鍵中心形成半乳糖基和酶的復合中間體,羧基基團作為酸堿催化劑將質子傳遞到糖苷鍵的氧原子上,同時釋放一分子葡萄糖,此為糖基化過程。復合中間體和水反應生成半乳糖(水解反應),復合中間體和糖分子或乳糖反應時生成低聚半乳糖(轉糖苷反應),水解反應和轉糖苷反應均為去糖化過程[24]。

圖1 特異性乳糖酶催化反應機制[24]Fig.1 Characteristic lactase catalytic reaction mechanism[24]

3 特異性乳糖酶高產菌株選育

乳糖酶在乳制品中的應用范圍廣,但傳統工業生產的乳糖酶產量低、生產成本高,因此不利于其廣泛應用。為了獲得高產菌株,研究者們進行了大量的研究,已經取得一定的進展[25-27]。特異性乳糖酶和乳糖酶的高產菌株選育技術類似,主要集中在傳統理化誘變育種技術和基因工程技術。傳統理化誘變育種技術包括物理誘變技術、化學誘變技術和復合誘變技術?；蚬こ碳夹g是將優良的乳糖酶基因導入生長迅速且容易培養的微生物中,得到相應的基因工程菌,進一步通過對發酵條件優化來提高乳糖酶生產量,從而降低生產成本。特異性乳糖酶異源表達系統主要有大腸桿菌表達系統、乳酸菌表達系統、酵母表達系統和枯草芽孢桿菌表達系統。

3.1 傳統理化誘變育種技術

3.1.1 物理誘變技術

物理誘變是通過輻照處理使染色體缺失、重組或斷裂等,從而引起后代性狀產生變異[25],目前常用的誘變源有射線、超聲波和離子束等。紫外線照射是最簡單的物理操作技術,條件容易獲取且操作簡單,常用于微生物的誘變處理。劉芳寧等[26]通過紫外照射對米曲霉進行誘變實驗,獲得了最佳照射時間為15 min,繼而誘變篩選得到一株產乳糖酶能力增加幅度最大的突變株,酶活比初始菌株提高了49.22%。杜海英等[27]采用60Co-γ線誘變出發菌株的原生質體,對黑曲霉進行誘變,獲得高產高溫乳糖酶的突變菌株,最終突變菌株產特異性乳糖酶酶活是原始菌株的2.73倍。

相比較于傳統輻射源的突變頻率低、隨機性大等缺點,常壓室溫等離子體技術(ARTP)應運而生,它具有誘變操作溫度低、突變快、多樣性高、與細胞作用明顯以及對環境要求低等優點[28]。邱雯雯等[29]以ARTP誘變方式對乳酸克魯維酵母進行不同時長的誘變處理,得到4株高產乳糖酶的突變菌株,其酶活均大于原始菌株,其中最大乳糖酶酶活是原始菌株的2.8倍。

3.1.2 化學誘變技術

化學誘變是利用化學誘變劑使DNA烷基化損傷或堿基錯配、置換從而引起突變的誘變技術?；瘜W誘變劑種類很多,主要有亞硝基胍[30]、甲基磺酸乙酯[31]、硫酸二乙酯等[32]和2-脫氧葡萄糖[33]。Ibrahim等[34]使用化學誘變劑對2株雙歧桿菌進行誘變后發現,誘變菌株的產酶量比野生型增加2倍多。劉文玉等[35]通過亞硝基胍對野生低溫β-半乳糖苷酶產生菌株進行誘變,篩選出產酶活比原始菌株提高54%的菌株。

與物理誘變相比,化學誘變一般是基因的點突變,對基因組的損傷小,突變點具有特異性,但是所用試劑一般具有毒性,使用時應注意安全。

3.1.3 復合誘變技術

復合誘變技術一般同時采用2種及2種以上誘變技術進行誘變,通過復合誘變可以解決單一誘變技術的局限性,增加基因突變類型。復合誘變技術通常是物理誘變技術相互復合、物理誘變技術和化學誘變技術復合、化學技術相互復合。李寧等[36]采用紫外線和60Co-γ線協同誘變,選育出產高溫乳糖酶的高產黑曲霉菌株,突變株產酶能力和酶活均比出發菌株有所提高。劉文龍等[30]以米曲霉菌株作為出發菌株,采用紫外線和亞硝基胍復合誘變的手段,獲得一株遺傳穩定性良好的高產乳糖酶菌株,其產乳糖酶酶活較初始菌株提高62.1%。高兆建等[37]通過微波輻照和亞硝基胍復合誘變,獲得高產突變菌株,產酶量比原始菌株的提高了115.92%。

3.2 基因工程技術

3.2.1 大腸桿菌表達系統

大腸桿菌表達系統因具有良好的表達穩定、遺傳機制研究清晰、生產周期短及易于放大培養等優點,在重組蛋白的表達方面有著廣泛應用[38]。李宗顯等[39]利用大腸桿菌表達系統成功將克雷伯氏菌來源的乳糖酶基因誘導表達后,所產酶活比野生菌株的提升近10倍。Liu等[40]從凝結芽孢桿菌NL01中克隆了一種新的熱穩定乳糖酶,在大腸桿菌中表達,該酶顯示出優于商業酶的乳糖水解能力。Li等[41]從海洋細菌Alteromonassp.中克隆了一個新的β-半乳糖苷酶基因(gal2A),在大腸桿菌中表達,該酶表現出高轉糖基活性,可用于生產低聚半乳糖。

3.2.2 乳酸菌表達系統

乳酸菌是一種安全級的益生菌,乳酸菌表達系統作為一種原核表達系統[42],本身可產殺菌物質,無內毒素產生,在安全性方面有著明顯的優勢。Schwab等[43]將多種不同來源的乳糖酶基因轉入表達載體,并在乳酸乳球菌(Lactococcuslacti)中成功表達,但該系統也存在以下不足:乳酸菌在工業生產的復雜環境中難以存活,外源基因在乳酸菌中表達后,一些分泌蛋白無法分泌而滯留在細胞壁上,影響目標產品的提取效率。目前,乳酸菌表達系統還沒有在工業上進行大規模應用。

3.2.3 酵母表達系統

酵母表達系統的純化步驟簡單,具有良好的生物活性,重組產物不含內毒素[44]。對于在原核表達系統中無活性蛋白和錯誤折疊的蛋白,可以嘗試用酵母表達系統進行表達。Becerra等[45]成功實現乳糖酶在釀酒酵母中的表達。王敏[46]將米曲霉來源的乳糖酶在乳酸克魯維酵母表達系統中表達并進行條件優化,最終酶活達142.57 U/mL。

畢赤酵母是酵母表達系統中最常用的表達宿主,利用甲醇作為碳源和能量來源。與釀酒酵母相比,畢赤酵母系統具有強大的分泌表達能力,表達的蛋白產量大、活性高、細胞外雜蛋白少且純化成本降低[47],適合用于商業化生產乳糖酶。侯重文等[48]將米曲霉來源的乳糖酶基因克隆到畢赤酵母表達系統中成功表達,最終水解乳糖的酶活達530 U/mL?？紤]到甲醇為碳源可能會導致殘留毒性和火災等安全風險,胡夢凱等[49]等構建了非甲醇誘導表達載體來改善畢赤酵母中乳糖酶的表達。

3.2.4 枯草芽孢桿菌表達系統

枯草芽孢桿菌表達系統雖具有不易混入內毒素[50]、蛋白直接分泌到胞外、有利于后續的純化和生產成本低等優點,但其存在轉化效率低、自身分泌的蛋白容易將目的蛋白降解等不足。田康明等[51]通過基因工程技術獲得了乳糖酶編碼基因及其重組酶,在枯草芽孢桿菌中表達,獲得了具有較好低聚半乳糖生產能力的乳糖酶。

綜上可知,誘變育種操作簡單,需要通過大量的誘變試驗,利用高通量篩選方法從中篩選出高產菌株,但誘變育種致死率較高,一般應用于實驗室研究中?；蚬こ碳夹g能有效提高乳糖酶產量,從根本上解決乳糖酶產量問題,適用于商業化生產,但基因工程技術潛在的危害也不容忽視,需要通過進一步研究對其進行安全性論證。

4 乳糖酶定向進化研究進展

自然界野生型乳糖酶很難滿足現有應用需求,通過定向進化可獲取相關應用需求的基因。許多理性和非理性的工程策略已成功應用于優化乳糖酶,包括定點突變、截短突變、位點飽和突變、隨機突變、DNA改組和酶蛋白的單體修飾[52]。乳糖酶在DNA或蛋白質水平上的變化能獲得滿足其應用環境的特性,如,減少產物抑制作用、提高熱穩定性、改變產物成鍵類型、提高乳糖酶轉糖苷能力,這極大地促進了乳糖酶的應用和發展。

4.1 減少產物抑制作用

在乳糖酶催化乳糖水解反應時,半乳糖需要在反應過程中離開酶活性位點以進行持續催化。然而,半乳糖會因為與結合位點的相互作用而滯留在酶的活性位點上,從而導致產物抑制作用[53],難以實現高濃度乳糖的完全水解。因此,尋找耐半乳糖的乳糖酶一直是大家關注的熱點。Liu等[54]通過改變產物與酶相互作用相關殘基的定點突變來減輕產物抑制作用,結果發現,隨著半乳糖和突變酶之間的親和力降低,突變酶在乳糖水解中具有潛在應用價值。Zhao等[55]利用定點突變策略來生產富含低聚半乳糖的酸奶。Zhang等[56]通過蛋白質修飾來改善乳糖酶特性,降低半乳糖抑制作用。

4.2 提高熱穩定性

酶反應還需要更高的操作穩定性,尤其是在較高溫度下的工業應用中。Ishikawa等[57]對乳糖酶進行定點誘變,獲得了在60 ℃下具有更好熱穩定性的三重突變體(K166P、G307P、A833P)[57]。Rico-Diaz等[7]通過在亞基界面引入半胱氨酸對乳酸桿菌來源的乳糖酶進行合理突變,突變體 (R116C、T270C、G818C) 在45 ℃的半衰期提高了6.8倍,且催化活性提高;同時發現,熱穩定性和活性的提高可能與亞基之間形成二硫鍵有關,有助于強化蛋白結構。

4.3 改變產物成鍵類型

乳糖酶的分子進化也會影響產物的特異性,包括糖苷鍵和聚合狀態。Yin等[58]發現,環狀芽孢桿菌來源的天然乳糖酶傾向于催化β-1,4鍵,通過飽和突變產生的突變體R484S和R484H能合成包含交替的β-1,3和β-1,4鍵的新低聚半乳糖結構,增加了產物成分中β-1,3鍵的比例。

4.4 提高乳糖酶轉糖苷能力

在乳糖酶催化低聚半乳糖反應中,產物可繼續成為水解的底物,最終造成低聚半乳糖的產率較低。 對催化殘基外進行定點誘變可以改善轉半乳糖基化的性質,但酶的水解活性不會完全消除。 Hassan等[59]對乳糖酶進行合理設計,獲得了與-1和+1亞位點相關的3個突變體(Y296F、F417S和F417Y),使低聚半乳糖產量由39.3%提高到50%以上[59]。同樣,Wu等[60]通過定點誘變來自S.solfataricusP2的乳糖酶獲得的2個突變體(F359Q 和 F441Y),以此生產低聚半乳糖的產率為58.3%和61.7%,而天然酶產率為50.9%[60]。

5 特異性乳糖酶應用策略

乳糖酶作為一種食品添加劑,在乳品工業中應用廣泛,可用于低聚半乳糖的生產[61]、無乳糖/低乳糖牛奶的生產[62]、乳制品副產物乳清的降解[63-64]和低乳糖冰激凌的生產[65]等。超濾膜對大分子低聚糖和生物酶有優異阻隔作用,能有效用于游離特異性乳糖酶生產低聚半乳糖中所得的小分子低聚糖分離過程[66]。

雖然游離特異性乳糖酶的催化效果較好,但存在穩定性差、不能重復使用等缺點,導致生產目標的成本增加。為了保證特異性乳糖酶的催化特性,可以采用固定化酶技術。固定化特異性乳糖酶是將特異性乳糖酶與載體相互作用,將特異性乳糖酶限制在一定的空間內。特異性乳糖酶可通過物理和化學方法進行固定。物理方法包括吸附法和包埋法,化學方法包括共價結合法和交聯法。一般采用吸附法將特異性乳糖酶固定在載體材料上,這樣可以最大限度保留特異性乳糖酶的“特性”,但酶與載體作用力不強,容易脫落。交聯法是利用酶自身的雙功能團結構在交聯劑作用下連接起來的一種固定方法,是酶與載體結合最有效和最穩定的方法之一,可使酶和載體間鍵合;也可在無載體情況下,使酶分子間形成聚合物。該法操作成本低,能防止酶泄露,但交聯反應可能發生在酶的活性中心,從而使酶活降低或失活,降低固定化酶的回收率[67]。

為了提高特異性乳糖酶的固定化使用效率,有時將2種或2種以上的固定化方法聯用,如,吸附-交聯、包埋-交聯、吸附-包埋-交聯等。吸附法可以提高乳糖酶的固定化率,包埋-交聯相結合的方法能夠增加結合強度,可解決乳糖酶泄露和固定化乳糖酶操作穩定性問題。

6 結論與展望

特異性乳糖酶在乳品工業中的應用是一個持續性研發熱點,特異性乳糖酶的研究一直集中于從天然來源中篩選、基于應用條件采用分子手段對其特性進行調控和固定化應用等方面。本文以特異性乳糖酶的應用為出發點,對特異性乳糖酶進行介紹,從特異性乳糖酶的催化應用、酶的生產、酶的定向進化和應用策略等方面進行綜述。

特異性乳糖酶的分子調控技術(定點突變)極大地提高了轉糖基化活性和底物耐受性,擴大了其應用范圍。通過研究酶的三維結構和功能的關系,開發高效的高通量篩選方法來檢測轉糖基化活性,可以加速商業化特異性乳糖酶的生產。隨著基因工程技術的發展,特異性乳糖酶的催化機制和調控機制會有更深入的研究,新的特異性乳糖酶基因也會不斷地被克隆和突變,應逐漸提高其在食品工業方面的安全性研究。在實際應用中,固定化特異性乳糖酶能很好地發揮其特性,但在固定化過程中會損失一部分特性,應開發新的固定化方法和應用載體來保持或增加其催化特性。