單一及混合乳酸菌發酵對番木瓜汁品質的影響

周 瑤 李 娟 賈鳳霞 黃婧禹 蘇智敏 陳 崗

(重慶市中藥研究院,重慶 400065)

發酵不僅能延長食品保質期,還可以增強食品的感官特性,增加生物利用度和改善食品的營養價值等。例如,植物乳桿菌發酵提高了番石榴果提取物的植物化學和理化特性[1]。乳酸菌發酵的一個重要方面是利用碳水化合物、蛋白質、微量元素、礦物質及次生代謝產物多酚等進行代謝,產生有機酸、糖、芳香族化合物及新的功能成分[2]。

番木瓜(CaricapapayaL.)自17世紀傳入中國后在中國各省被廣泛栽培。成熟的番木瓜果實除富含碳水化合物(6.50%～9.51%)外[3],還含有其他多種營養元素,包括蛋白質(0.40%～1.17%)、胡蘿卜素(約1 mg/100 g)、維生素C(40～60 mg/100 g)和維生素A(18.50～56.50 mg/100 g)等。有研究[4-5]表明,根據品種和成熟度的不同,吃半個木瓜(100 g)就能提供普通成年人所需維生素A的2%～10%,而維生素A對人體非常有益,不僅具有抗氧化特性,還能通過視黃醇結合蛋白信號傳導調節胰島素敏感性和維持脂肪的穩態。此外,野生木瓜果肉中總酚含量為9.16 μmol沒食子酸當量/g果肉,與番荔枝科的其他水果相當,包括番荔枝、石榴、蔓越莓等。木瓜中還富含原花青素(濃縮單寧),為一種極好的健康抗氧化劑[6]。此外,番木瓜還具有多種生理功能,包括抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等特性。特別是在降糖方面,口服木瓜葉提取物可顯著降低糖尿病大鼠的血糖水平、轉氨酶和甘油三酯[7]。還有一種已商品化的木瓜制劑,證明其可以改善糖尿病前期和糖尿病患者血小板[8]。

番木瓜有不愉快氣味,且是一種極易腐爛的水果,不易保存[9-10]。而通過乳酸菌發酵處理不僅能延長其保質期還能改善其風味。目前,大多數乳酸菌的研究僅限于單菌或混合菌對某種基質的獨立研究,對同一種基質的單菌和混合菌在同一條件下的對比研究較少。雖然有充分的證據表明益生菌混合物對多種疾病有有益作用,然而混合物比其組成菌種更有效的證據較為有限。此外,在一個證明益生菌混合物更有效的12項研究中,有4項研究表明混合物不是更有效的,說明混合物比單獨使用的成分菌種更有效或更不有效,取決于不同的菌種[11]。

研究擬探討3種不同的乳酸菌(植物乳桿菌、鼠李糖桿菌和嗜酸乳桿菌)單菌和兩兩混合菌對番木瓜汁發酵后植物化學、微生物學和風味特性的影響,并分析番木瓜汁總酚、總黃酮成分與降血糖和抗黑色素的相關性,以期為尋找合適的發酵劑,開發出一種具有改善功能和促進健康特性的番木瓜益生菌發酵飲料提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

番木瓜:別名紅心冰糖牛奶木瓜,甜度比一般的番木瓜高,選用單果在500 g左右,果肉飽滿成熟,無病蟲害,采自云南西雙版納;

植物總酚測試盒、植物類黃酮測試盒、α-葡萄糖苷酶測試盒:蘇州科銘生物技術有限公司;

酪氨酸酶活性檢測試劑盒:北京索萊寶科技有限公司;

甲醇:色譜純,賽默飛世爾科技有限公司;

其他試劑均為國產分析純;

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus):廣州匯健生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

潔凈工作臺:ZHJH-C1118C型,上海智城分析儀器制造有限公司;

立式壓力蒸汽滅菌器:LDZM-80KCS型,上海申安醫療器械廠;

電熱恒溫培養箱:DHP-9162B型,上海一恒科學儀器有限公司;

高效液相色譜儀:LC-20A-DAD型,日本島津公司;

三重四極桿氣相色譜—質譜聯用儀:TSQ8000EVO型,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;

全自動酶標儀:P-800型,杭州遂真生物技術有限公司;

臺式高速冷凍離心機:3-18KS型,德國西格瑪離心機公司;

紫外可見分光光度計:752型,上海舜宇恒平科學儀器有限公司;

pH計:PHS-25型,上海儀電科學儀器股份有限公司;

阿貝折光儀:WAY-2W型,上海儀電物理光學儀器有限公司;

超低溫冰箱:DW-86L390型,澳柯瑪股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 番木瓜汁發酵果汁的制備 選擇新鮮無腐爛、成熟度合適的番木瓜,清洗,去皮去籽,切塊打漿后得到木瓜原漿,加入1倍質量的蒸餾水,65 ℃殺菌30 min,于潔凈工作臺按106CFU/mL接種量分別接種植物乳桿菌(Lp)、鼠李糖桿菌(Lr)、嗜酸乳桿菌(La)以及3種乳桿菌按1∶1兩兩復配的菌懸液:植物乳桿菌+鼠李糖桿菌(Lp+ Lr),植物乳桿菌+嗜酸乳桿菌(Lp+ La),鼠李糖桿菌+嗜酸乳桿菌(Lr+La),37 ℃恒溫培養72 h。未發酵和發酵樣品經過濾后,濾液于-80 ℃冷凍備用。

1.2.2 理化指標測定

(1) pH值:采用pH計法。

(2) 可溶性固形物含量:參照NY/T 2637—2014。

(3) 總酸:參照GB/T 12456—2008。

(4) 活菌數:參照GB 4789.35—2010。

1.2.3 總酚、總黃酮含量測定 通過植物總酚測試盒、植物類黃酮測試盒測定。

1.2.4 有機酸含量測定 參照GB 5009.157—2016。

1.2.5 單糖含量測定 參照GB 5009.8—2016。

1.2.6α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性測定 通過α-葡萄糖苷酶測試盒和酪氨酸酶活性檢測試劑盒測定。

1.2.7 揮發性物質測定 根據Gomes等[12]的方法適當修改,采用三重四極桿氣相色譜—質譜聯用儀測定番木瓜汁中揮發性物質,色譜柱為Supelcowax(30 m×0.25 mm,0.25 μm)。色譜條件:進樣溫度200 ℃;不分流模式;升溫程序為以2 ℃/min從50 ℃升至150 ℃,保持5 min;載氣(He)流速1 mL/min。質譜條件: EI源;電子能量70 eV;傳輸線溫度250 ℃;離子源溫度 230 ℃;掃描方式為全掃描;質量范圍(m/z)為20～350。

2 結果與分析

2.1 番木瓜汁發酵過程中理化性質的變化

由表1可知,木瓜汁發酵72 h后,各組可溶性固形物含量均從9.5 °Brix降至8.0～8.5 °Brix。木瓜果實的pH值為5左右,符合3種乳酸菌生長的最適pH值,發酵72 h后,各組pH值均降低為3.3左右。各組可滴定酸含量均顯著增加。

表1 番木瓜汁發酵過程中理化性質的變化?

單菌發酵中,雖然3種乳酸菌以相似的細胞數[6.00 lg(CFU/mL)]接種,但發酵72 h后,Lr活菌數最高為7.52 lg(CFU/mL);La最低為7.26 lg(CFU/mL),與Malik等[12]的結果類似,其活菌數下降的最可能原因是果汁酸度迅速增加?；旌暇l酵組中,Lp+Lr的活菌數最高為7.61 lg(CFU/mL),同時也是所有發酵組中(單菌和混菌)活菌數最高的組,而Lp+La的最低[7.00 lg(CFU/mL)]。綜上,單一菌種也可以滿足番木瓜的發酵要求。同時,混合發酵組中的活菌數與菌種的相互作用有很大關系。即使是同一種發酵劑,由于菌種產酸能力、耐酸能力、營養物質競爭等,可能導致比單一菌種好或不好的發酵效果[13]。

2.2 番木瓜汁發酵后糖類的變化

由表2可知,發酵和未發酵的木瓜汁中均未檢出蔗糖,可能是其值低于儀器檢出限而未被檢出,由此說明木瓜為蔗糖含量少的低熱量水果,與于璐等[14]的結果一致。單一菌種發酵中,3種乳酸菌均能消耗葡萄糖,其中植物乳桿菌的消耗能力最強。所有菌對果糖的消耗能力均低于葡萄糖的,特別是嗜酸乳桿菌幾乎未消耗果糖?；旌暇l酵中也有類似結果,各組主要以消耗葡萄糖為主。據報道[15],嗜酸乳桿菌在單糖中只能利用葡萄糖作碳源。

表2 番木瓜汁發酵72 h后糖類的變化?

植物乳桿菌則能夠同時代謝兩種糖類,且在葡萄糖存在的情況下,果糖是其第二優選單糖[16]。半乳糖和葡萄糖被證明是鼠李糖最有效的碳源[17]。綜上,番木瓜汁經植物乳桿菌單菌發酵后可能會產生更佳的風味。

2.3 番木瓜汁發酵后有機酸含量的變化

由表3可知,番木瓜原汁中5種有機酸含量差異較大,其中檸檬酸含量最高為3.47 g/L;蘋果酸含量次之,為2.98 g/L。番木瓜汁經各種乳酸菌發酵后,有機酸組成發生了顯著而不同的變化。發酵72 h后,乳酸和琥珀酸含量顯著增加,檸檬酸和蘋果酸含量顯著降低,酒石酸含量變化不大。其中,乳酸是番木瓜汁發酵后形成的主要有機酸,Lp在所有發酵組中產生乳酸量最高為14.41 g/L,Lr+La產量較低(10.89 g/L),其他發酵組結果相近。Chen等[18]研究發現,經嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌發酵后,番木瓜汁中乳酸含量分別為5.43,5.71 g/kg。事實上,大多數乳桿菌可以通過一種蘋果乳酸酶將蘋果酸脫羧直接轉化為乳酸,還可以代謝檸檬酸產生乳酸、二乙?；?、乙酰丙酮和乙酸[19]。Mousavi等[16]發現植物乳桿菌能夠利用蘋果酸作為碳源,且蘋果酸的代謝與糖代謝同時開始。因此,各組檸檬酸和蘋果酸含量在發酵后均顯著降低,而乳酸含量則顯著增加。李維妮等[20]研究表明,乳酸菌能夠利用三羧酸循環產生的檸檬酸合成琥珀酸,故發酵后琥珀酸含量增加,而適當含量的琥珀酸有利于產品的口感,但由于其具有苦咸味,過量則可能會造成不利的口感,直接影響果汁的酸味。

表3 發酵72 h后番木瓜汁的有機酸含量變化?

綜上,單菌種發酵和混合菌種發酵番木瓜汁過程中,5種有機酸的代謝變化情況具有相似性。特別注意的是,單菌種Lp在產乳酸上更具有優勢性,很大程度上可能歸功于植物乳桿菌具有較強的產酸和利用碳水化合物的能力。因為Lp屬于同型發酵類型中的兼性異型發酵群,具有全面的糖代謝,有很強的發酵碳水化合物的能力,主要產生乳酸和少量乙酸[21-22]。而La只有糖酵解途徑,表現為同型乳酸發酵,只生成乳酸[23-24]。此外,葉盼[25]通過6種乳酸菌發酵蘋果汁證實了Lp具有較強的產酸能力(植物乳桿菌>瑞士乳桿菌>戊糖片球菌>副干酪乳桿菌>明串珠球菌>嗜酸乳桿菌)。

2.4 番木瓜汁發酵后總酚、總黃酮含量和部分功能特性的變化

2.4.1 總酚、總黃酮含量 由表4可知,發酵明顯提高了樣品的總酚和總黃酮含量。發酵組的總酚和總黃酮含量分別為1.17～2.93,0.81～1.38 mg/g干基,顯著高于未發酵組(1.15,0.52 mg/g干基)。與其他乳酸菌相比,Lp也使得果汁中具有更高的總酚和總黃酮含量,可能與乳酸菌合成水解酶的能力有關。此外,乳酸發酵果汁中多酚含量較高也可能是聚合物降解的結果,聚合物的降解是將復雜化合物轉化為自由形式,由酚氧化酶調節,而酚氧化酶的合成則依賴于乳酸菌。研究[26]表明,植物乳桿菌在代謝多酚方面表現出很高的酶活性,在乳桿菌屬的所有物種中,負責合成酚脫羧酶和單寧酶的基因只有植物乳桿菌所特有,被認為具有最高的多酚代謝能力。Wang等[27]利用嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖桿菌發酵藍莓汁,所有發酵組的總酚含量分別提高了20.49%,37.6%,12.46%,總黃酮含量分別提高了20.3%,37.5%,16.0%。

表4 發酵72 h后番木瓜汁總酚和總黃酮含量的變化?

2.4.2 功能特性變化 由圖1可知,番木瓜汁對α-葡萄糖苷酶的抑制率為10.47%。發酵后α-葡萄糖苷酶抑制率顯著提高,Lp、Lr,、La的分別為48.48%,36.55%,43.46%。Lp+Lr、Lp+La、Lr+La發酵番木瓜汁后,α-葡萄糖苷酶抑制率分別為39.86%,44.39%,39.47%?？傮w來看,Lp單菌發酵后,α-葡萄糖苷酶的抑制作用略強,歸因于酚酸和黃酮類活性物質的增加。多酚可以通過疏水相互作用與α-葡萄糖苷酶的活性位點結合,競爭性抑制這些酶的催化活性。Ankolekar等[28]研究表明,各品種總酚含量與α-葡萄糖苷酶含量呈負相關(r=-0.79～-0.99)。也有研究[29]表明,α-葡萄糖苷酶抑制活性與總黃酮含量顯著相關。由表5可知,α-葡萄糖苷酶抑制率與總酚、總黃酮含量具有顯著正相關性,相關性分別為0.837和0.844。高鶴[30]研究表明,發酵過程中,植物乳桿菌分泌的酶可以通過水解苦瓜中皂甙的糖苷鍵釋放苷元和多酚類物質,達到抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。不同乳酸菌對α-葡萄糖苷酶抑制能力的差異,可能是由于不同菌種對酚類物質的代謝不同所致[27]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

表5 發酵番木瓜汁的功能特性和主要活性成分的相關系數?

酪氨酸酶是黑色素合成反應的限速酶,其異常表達過量和催化活性升高會引起黑色素生成過多,從而引發黃褐斑、老年斑等色素性疾病。由圖2可知,各發酵番木瓜汁中酪氨酸酶抑制活性均顯著增加,且單菌發酵組的抑制性比混合菌發酵組的更強。由表5可知,酪氨酸酶抑制率與總酚含量呈顯著正相關(r=0.847),但與總黃酮含量無顯著相關性。田絲竹等[31]研究發現,酚酸提取物對酪氨酸酶具有較高的抑制能力,該抑制能力與總酚含量高度相關(r=0.879)。Lizardo等[32]研究表明,副干酪乳桿菌單菌發酵對酪氨酸酶抑制活性比植物乳桿菌單菌及兩者混菌發酵的更強。

綜上,乳酸菌發酵的活性成分和功能特性可能與多酚之間存在深層次的雙向關聯,酚類化合物含量與乳酸菌的代謝直接相關。而酚類化合物可以影響乳酸菌的生長和代謝[19]。相比混合菌發酵,單一菌可能更可取,混合菌的優勢主要取決于菌種的相互作用。因此,正確選擇發酵基質和相應的乳酸菌有可能生產出具有高功能性食品的潛力。

2.5 番木瓜汁發酵后揮發性成分的變化

Pino等[33]研究表明,番木瓜中主要揮發性成分以酯類為主(約占總揮發物的40.8%～63.0%),而Farina等[4]研究表明,芳樟醇(可達90%以上)和異硫氰酸芐酯為揮發性氣味的關鍵。由表6可知,丁酸和芳樟醇是木瓜原汁的主要成分,分別約占總成分的89%和7%。經乳桿菌發酵后的揮發性成分發生了顯著性變化,各組丁酸含量顯著降低,芳樟醇則略微增加。一般認為,丁酸會產生干酪般甜膩的不愉快氣味,引起部分消費者的不適感。芳樟醇及芳樟醇氧化衍生物是木瓜特有香氣的主要貢獻者之一,是一種帶有濃青木青氣息,似玫瑰木,屬花香型的香氣成分[34]。

表6 發酵72 h后木瓜汁中主要揮發性成分

原木瓜汁中主要有6種揮發性成分,包括酸類、醇類、酚類和烷烴類化合物。Lp、Lr、La、Lp+Lr,Lp+La、Lr+La發酵共產生了25種揮發性化合物,生成了許多新的化合物,包括酮類、酯類、芳香類和烷烴類化合物。所有發酵組中,Lp產生的揮發性化合物最多為18種,其次為La(14種)及Lp+La(14種)。Lr產生的主要成分最少,僅4種。Lp+Lr產生的成分也較少(5種)。一般認為,揮發性成分的差異與菌種種類以及菌種的胞內酶有關。在單菌種發酵中,Lp產生的香氣成分最多,La產生的香氣成分大部分與其類似,與Chen等[18]的結果類似。這可能是因為在乳桿菌屬的所有物種中,Lp具有合成部分酶的特有基因,比如酚脫羧酶、單寧酶等[26]。在混合菌發酵中,Lp+Lr產生的香氣成分最少,可能是Lp+Lr共同發酵時互相產生拮抗[13],而Lr在所有發酵中菌種存活率最高,因此其在與Lp混合發酵時可能占據優勢地位,而Lr單菌發酵時產生的揮發性成分最少,所以混合發酵產生的芳香成分比其他兩種混合菌的少。

6個發酵組中,僅Lp產生幾種特有的香氣成分,包括苯甲醇、丙酸甲酯、甲苯和苯甲醛。據報道[18,35],苯甲醇具有杏仁香氣,苯甲醛具有杏仁、櫻桃甜味,能給木瓜汁提供更豐富的香氣成分。此外,大部分發酵組(Lp、La、Lp+La、Lr+La)中的木瓜汁新增了很多烷烴類物質,其主要來源于脂肪酸烷氧自由基的斷裂及對氨基酸的降解代謝過程,由于香味閥值較高,其對木瓜汁的風味貢獻較小[25]。發酵后的果汁中均不同程度地增加了令人愉快的水果香氣的苯甲醇。

總體來看,乳酸菌發酵可以增加水果汁中揮發性風味物質種類。接種乳酸菌后,木瓜汁中令人不愉快氣味的丁酸含量顯著降低,香氣成分種類顯著增加,賦予了木瓜發酵汁獨特復雜的香氣。使用單一菌種發酵劑Lp比混合發酵劑產生了更多的香氣成分,說明Lp在木瓜汁中的適應性較廣,單一發酵風味成分更佳。

3 結論

以番木瓜汁作為3種乳酸菌發酵底物,通過對不同發酵物化性質的比較,篩選出了一株更適合發酵的菌株。結果表明,發酵提高了番木瓜汁的總酚、總黃酮含量,對α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶的抑制作用增強。3種乳酸菌均能在番木瓜汁中存活,活菌數>7.00 lg(CFU/mL)。雖然植物乳桿菌和鼠李糖桿菌混菌發酵的活菌數在所有發酵組中最高,但在其他方面尤其是在產香氣成分上最差?？偟目磥?植物乳桿菌在產乳酸,促進總酚、總黃酮含量,抑制葡萄糖苷酶和酪氨酸酶活性以及增加番木瓜風味物質上更具優勢。因此,使用植物乳桿菌單一菌株發酵番木瓜汁是首選。后續可深入探究木瓜優勢發酵劑發酵的功能機制,如減肥、降血糖等機制,有利于木瓜功能性飲料的實際應用。