miR-140-3p 靶向AGT5 調控鼻咽癌細胞增殖、侵襲、遷移及自噬研究

王忠巧，高 妍，司峰志

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是頭頸部常見惡性腫瘤之一，進展快，復發率高，很多患者初次就診時已經出現遠處轉移。因此，探索NPC 進展分子機制、 尋找新的治療靶點迫在眉睫。 微小RNA（microRNA，miRNA）是一類22nt 的非編碼RNA，參與調控癌細胞的惡性生物學進程。 研究顯示，miR-140-3p 在多種腫瘤組織中差異表達， 參與調控細胞增殖、侵襲并促進細胞凋亡的作用[1～3]。Zou X 等[4]研究發現，miR-140-3p 在NPC 患者血漿中低表達，對NPC 具有一定的診斷價值。然而miR-140-3p 對NPC的作用及分子機制尚不明確。自噬是細胞的一種程序性死亡，參與腫瘤的發生發展、藥物抵抗等[5]。 抑制自噬可促進NPC 細胞的增殖、轉移，如Zhu Q 等[6]研究發現，上調miR-106a-5p 可抑制NPC 細胞自噬產生，進而促進細胞增殖、侵襲及遷移。但也有文獻報道，抑制自噬可增強NPC 細胞的放化療敏感性[7]。目前多項研究發現，miRNA 參與了腫瘤細胞自噬的調控[8，9]。 筆者所在課題組前期通過生物信息學網站分析發現，miR-140-3p 與自噬相關基因5 （autophagy related genes 5，AGT5）存在核苷酸結合位點，而AGT5 在自噬發生中扮演著重要角色，因此推測miR-140-3p 可能通過靶向AGT5 調控細胞自噬影響NPC 進展。 基于此， 筆者主要探討了miR-140-3p 對NPC 細胞惡性生物學行為、自噬的影響及其與AGT5 的靶向調控關系，希望為NPC 的防治提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞

人NPC 細胞——CNE2 細胞、 人鼻黏膜上皮細胞——HNEpC 細胞（北納生物，中國）。

1.1.2 主要試劑

達氏修正伊氏培養液 （Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）（安徽白鯊生物科技有限公司，中國）；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（百克賽斯生物科技有限公司，中國）；lipofectamine 8000（上海碧云天生物有限公司，中國）；TRizol（Invitrogen，美國）；引物序列、過表達（overexpression，OE）-AGT5 質粒、OEAGT5 空載體、miR-140-3p 模擬物（mimic）質粒、miR-140-3p 抑制劑（inhibitor）質粒、miR-140-3p mimic 空載體及miR-140-3p inhibitor 空載體、 野生型（wild type，WT）-AGT5 載體、突變型（mutant，MUT）-AGT5載體（北京博爾邁生物技術有限公司，中國）；CCK-8（cell counting kit-8）檢測試劑盒（上海生物，中國）；CCK-8 試劑盒（杭州赫貝科技有限公司，中國）；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（武漢科謹生物科技有限公司，中國）；兔抗人β-actin、微管關聯蛋白輕鏈3Ⅰ（microtubule-associated protein 1 light，LC3Ⅰ）、 微管關聯蛋白輕鏈3Ⅱ （microtubule-associated protein 3 light，LC3Ⅱ）、AGT5、自噬關鍵分子酵母Atg6 同系物1（ATG6 autophagy related 6 homolog，Beclin1）、p62、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒（上海碧云天生物有限公司，中國）。

1.1.3 主要儀器

酶標儀 （美谷分子， 中國）；NANOdrop 2000 儀（Bio-rad 公司，美國）；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠電泳器械（上海懋康生物科技有限公司，中國）；天能VE-586 曝光機（上海天能科技有限公司， 中國）；ABI 7900 PCR 儀（ABI公司， 美國）；ARM200F 原子級分辨率透射電子顯微鏡（電子株式會社，日本）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、轉染及分組

CNE2、HNEpC 細胞使用含有10%胎牛血清、0.1%青霉素/鏈霉素的DMEM 進行培養。 培養條件：37 ℃、體積分數5%CO2，每隔2 d 更換新鮮培養液。取傳代3 次對數生長期的CNE2 細胞接種到6 孔板，細胞鋪滿50%板面積時使用lipofectamine 8000 將不同質粒轉染細胞分為如下各組：miR-140-3p 組（轉染miR-140-3p mimic 質粒），si-miR-140-3p 組（轉染miR-140-3p inhibitor 質粒），miR-空白對照（negative control，NC）組 （轉染miR-140-3p mimic 空載體），NC 組 （轉染miR-140-3p inhibitor 空載體），si-miR-140-3p+OE組（轉染miR-140-3p inhibitor 質粒、OE-AGT5 空載體），si-miR-140-3p + AGT5 組 （轉染miR-140-3p inhibitor 質粒、OE-AGT5 質粒）。 繼續培養48 h 后進行后續實驗。

1.2.2 CCK-8 測定細胞活力

制備單細胞懸液，按照8000/孔（每孔100 μL）的密度接種在96 孔板上， 并在體積分數5 % CO2、37 ℃的培養箱中進行孵育處理， 分別在24、48、72 h更換新鮮培養液，加入10 μL CCK-8 溶液，培養箱孵育3 h。孵育結束后采用酶標儀在450 nm 處讀取各處理組細胞的光密度（optical density，OD）。 每組實驗獨立重復3 次。

1.2.3 Tanswell 實驗測定細胞侵襲、遷移能力

對于侵襲實驗， 首先用無血清培養液配置基質膠，向Tanswell 小室的上室中加入60 μL 基質膠，放入培養箱中凝固，下室中加入10%胎牛血清，然后制備單細胞懸液；按照1×104個細胞接種到上室，培養48 h后去除培養液，棉簽拭去上室未穿的細胞，上室穿過去的細胞用4%多聚甲醛溶液固定10 min，0.1 %結晶紫染色，光學顯微鏡下拍照、計數。 對于遷移實驗，上室中不加入基質膠，其他步驟參考侵襲實驗。

1.2.4 免疫熒光檢測自噬

制備單細胞懸液，按照1×104/孔（每孔200 μL）的密度接種在6 孔板， 并在體積分數5%CO2、37 ℃培養箱中進行孵育處理24 h， 然后每孔加入1 μL Ad-mRFP-GFP-LC3B，繼續培養12 h 后激光共聚焦采集圖像。

1.2.5 實時定量聚合酶鏈式反應

實時定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 檢測miR-140-3p 和AGT5 mRNA 的表達。

使用TRizol 從各組細胞中提取總RNA， 測定濃度、純度。 根據試劑盒說明書逆轉錄成cDNA，然后PCR。 體系：cDNA 2 μL， 上下游引物各0.2 μL，2 ×Tip Green qPCR Sper Mix 5 μL， 焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）水2.6 μL。條件：95 ℃2 min，95 ℃15 s，60 ℃15 s，共40 個循環，構建溶解曲線。2-△△Ct法表示基因相對含量。內參選擇甘油醛3-磷酸脫氫酶 （glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、U6。

引物序列：AGT5，forward 5′-AGGCCTATGTGTTCACCTGC-3′，reverse 5′-CACATCTTGGCGCGAAAGTC-3′；miR-140-3p，forward 5′-GACCCAGTTCAAGTAATTCAG-3′，reverse CGAGCCAAGTAATGGAGAA-3′；GAPDH，forward 5′-TATAAATTGAGCCCGCAGCC-3′，reverse 5′-TACGACCAAATCCGTTGACTC-3′；U6，forward 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；reverse 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.6 Western blot

檢測AGT5、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1 和p62 蛋白表達。

將各處理組細胞裂解物通過二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法進行總蛋白定量，按照1 ∶4 的比例向上清液中加入5× 蛋白上樣緩沖液，并于沸水中加熱變性10 min。 取50 μg 蛋白進行SDS-PAGE電泳進行蛋白分離，采用濕轉法將分離的蛋白轉至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用5%脫脂牛奶于室溫下封閉2 h 后，分別加入AGT5（1 ∶1000）、LC3Ⅰ（1 ∶1000）、LC3Ⅱ（1 ∶1000）、Beclin1（1 ∶1000）及p62（1 ∶1000）一抗，在4 ℃條件下搖床孵育過夜。 用Tris 鹽緩沖溶液-吐溫 （Tris-buffered saline Tween，TBST）溶液清洗3 次，每次5 min，以辣根酶標記的二抗（1 ∶1000）室溫孵育1 h，以TBST 溶液清洗3 次，每次5 min。最后均勻滴加增強型化學發光（enhanced chemiluminescence，ECL）溶液后于凝膠成像儀進行曝光拍照。 采用ImageJ 軟件測定條帶灰度值，以目標蛋白與內參β-actin 的比值作為其相對表達量。 以上實驗重復3 次。

1.2.7 在線網站預測miR-140-3p 與AGT5 的靶向關系

使用TargetScan 在線網站（http://www.targetscan.org/）預測miR-140-3p 與AGT5 的靶向關系。

1.2.8 雙熒光素酶報告

在轉染前24 h，將CNE2 細胞以每孔1×104/mL細胞接種在24 孔板中。 將miR-NC 或miR-140-3p mimics 分別與WT-AGT5、MUT-AGT5 載體共轉染到CNE2 細胞中。 使用雙熒光素酶報告分析系統在轉染后24 h 進行熒光素酶分析。 螢火蟲螢光素酶活性被標準化為每個反應的海腎螢光素酶活性。

1.3 統計學方法

使用Graphpad Prism 軟件8.0（Graphpad Software Inc.，美國）進行統計分析。 其中計量資料以均值±標準差表示。 兩組及多組間比較分別采用Student t 檢驗、方差分析。 P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CNE2、HNEpC 細胞AGT5 蛋白及其mRNA、

miR-140-3p 表達水平比較

CNE2 細胞miR-140-3p、AGT5 蛋白及其mRNA表達水平低于HNEpC 細胞（P ＜0.01）。 見圖1、表1。

表1 CNE2、HNEpC 細胞AGT5 及miR-140-3p 表達水平Tab.1 Expression levels of AGT5 and miR-140-3p in CNE2 and HNEpC cells

圖1 Western blot 檢測AGT5 蛋白表達電脈圖Fig. 1 Electrophoretograms of AGT5 protein expression detected by Western blot

2.2 4 組CNE2 細胞增殖、侵襲及遷移比較

miR-140-3p 組CNE2 細胞48 h、72 h 細胞增殖、侵襲、遷移數低于miR-NC 組（P ＜0.01）。si-miR-140-3p 組CNE2 細胞48 h、72 h 細胞增殖、侵襲、遷移數高于NC 組（P ＜0.01）。 見圖2 和表2、3。 說明上調miR-140-3p 可抑制細胞的增殖、侵襲及遷移能力。

表3 miR-140-3p 對4 組CNE2 細胞侵襲、遷移影響的比較Tab.3 Comparison effect of miR-140-3p on invasion and migration in 4 groups of CNE2 cell

圖2 miR-140-3p 對CNE2 細胞增殖、侵襲及遷移的影響Tanswell 實驗光學顯微鏡圖Fig.2 Tanswell experiment optical microscope images of miR-140-3p effect on proliferation,invasion and migration of CNE2 cells

2.3 4 組CNE2 細胞自噬蛋白表達比較

miR-140-3p 組CNE2 細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1 蛋白水平， 黃色熒光強度高于miR-NC 組，p62蛋白水平低于miR-NC 組（P ＜0.01）；si-miR-140-3p組細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1 蛋白水平，黃色熒光強度低于NC 組，p62 蛋白水平高于NC 組 （P ＜0.01）。見圖3、4 和表4。 說明miR-140-3p 可促進細胞自噬的發生。

表4 4 組細胞自噬相關蛋白表達水平比較Tab.4 Comparison expression levels of autophagy-related protein in 4 groups

圖3 Western blot 檢測4 組CNE2 細胞自噬蛋白表達的電泳圖Fig. 3 Electrophoretograms of autophagy-related protein expression in 4 groups of CNE2 cell detected by Western blot

圖4 4 組自噬相關蛋白表達免疫熒光檢測結果比較Fig.4 Comparison results of immunofluorescence detection of autophagy-related protein expression in 4 groups

2.4 上調AGT5 逆轉miR-140-3p 敲低對CNE2 細胞的影響

2.4.1 3 組敲低miR-140-3p 后細胞增殖、 侵襲及遷

移比較

si-miR-140-3p + OE 組細胞48 h、72 h 細胞增殖、侵襲、遷移細胞數高于NC 組（P ＜0.01）；si-miR-140-3p+AGT5 組細胞48 h、72 h 細胞增殖、侵襲、遷移細胞數低于si-miR-140-3p+OE 組（P ＜0.01）。 見圖5 和表5、6。

表5 下調AGT5 逆轉miR-140-3p 過表達對3 組CNE2 細胞不同時間細胞增殖的比較Tab.5 Comparison down-regulation of AGT5 reverses miR-140-3p overexpression on proliferation of CNE2 cells at different times in 3 groups

表6 下調AGT5 逆轉miR-140-3p 過表達對3 組CNE2 細胞侵襲及遷移影響的比較Tab.6 Comparison of down-regulation of AGT5 reversed effect of miR-140-3p overexpression on invasion and migration in 3 groups of CNE2 cell

圖5 下調AGT5 逆轉miR-140-3p 過表達對3 組CNE2 細胞侵襲及遷移Tanswell 實驗光學顯微鏡圖Fig. 5 Tanswell experiment optical microscope images of down-regulation of AGT5 reversed effect of miR-140-3p overexpression on invasion and migration in 3 groups of CNE2 cell

2.4.2 3 組miR-140-3p 過表達后細胞自噬比較

si-miR-140-3p+OE 組細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白水平、黃色熒光強度低于NC 組，p62 蛋白水平高于miR-NC 組（P ＜0.01）；si-miR-140-3p+ AGT5 組細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1 蛋白水平、黃色熒光強度高于si-miR-140-3p + OE 組，p62 蛋白水平低于miR-NC 組（P ＜0.01）。 見圖6、7 和表7。

表7 3 組細胞自噬相關蛋白表達水平比較Tab.7 Comparison expression levels of autophagy-related proteins in 3 groups

圖6 Western blot 檢測miR-140-3p 對3 組CNE2 細胞自噬相關蛋白表達電泳圖Fig.6 Electrophoretograms of autophagy-related protein expression of miR-140-3p in 3 groups of CNE2 cell detected by Western blot

圖7 miR-140-3p 對3 組CNE2 細胞自噬表達影響的免疫熒光圖Fig.7 Immunofluorescence images of miR-140-3p on autophagy expression in 3 groups of CNE2 cells

2.5 miR-140-3p 與AGT5 的靶向關系

miR-140-3p 組細胞AGT5 蛋白水平高于miRNC 組（0.95±0.11 vs 0.45±0.07）（P ＜0.01），si-miR-140-3p 組細胞AGT5 蛋白水平低于NC 組（0.12±0.02 vs 0.46±0.06）（P ＜0.01）。 TargetScan 在線網站預測發現，miR-140-3p 與AGT5 mRNA 存在結合位點。miR-140-3p+WT-AGT5 組細胞熒光素酶活性高于miR-NC + WT-AGT5 組（1.75 ± 0.06 vs 1.00 ± 0.01）（t = 20.540，P ＜0.01），miR-140-3p + MUT-AGT5 組細胞熒光素酶活性與miR-NC + MUT-AGT5組比較（1.00±0.02 vs 1.00±0.01），差異無統計學意義（P ＞0.05）。 見圖8。

圖8 4 組細胞AGT5 蛋白表達電泳圖和miR-140-3p 與AGT5 的核苷酸結合位點Fig.8 Electrophoretograms of AGT5 protein expression and nucleotide binding sites of miR-140-3p and AGT5 in 4 groups

3 討論

NPC 是耳鼻喉最常見的惡性腫瘤之一， 其在中國的發病率、死亡率逐漸升高，盡管多種治療方法在一定程度上改善了患者預后，但總體預后不佳。 NPC的進展涉及多種基因調控，異質性高。 因此探索NPC發生和發展的分子機制，對于腫瘤的防治、改善患者預后至關重要。

miRNA 在腫瘤進展中發揮重要功能， 隨著對miR-140-3p 研究的深入，miR-140-3p 在腫瘤中的作用越來越清楚，如Wang Y 等[10]研究發現，miR-140-3p 過表達可抑制膀胱癌細胞的增殖、 侵襲。 此外，miR-140-3p 在胃癌組織中低表達，上調miR-140-3p可抑制胃癌細胞增殖、侵襲及遷移能力[11]。 然而miR-140-3p 與NPC 生物學行為的關系尚不清楚。 有文獻報道，NPC 患者血漿miR-140-3p 低表達， 診斷NPC的效能良好[12]。 筆者研究結果顯示，NPC 細胞miR-140-3p 表達水平低于正常鼻腔黏膜細胞，提示miR-140-3p 可能參與了NPC 發生。 為明確miR-140-3p對NPC 細胞的影響， 筆者所在課題組構建了miR-140-3p 過表達、敲低NPC 細胞株，結果顯示，上調miR-140-3p 可抑制NPC 細胞的增殖、侵襲及遷移能力， 反之下調miR-140-3p 可促進鼻咽癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力，這與其他腫瘤相關研究結果基本一致。

自噬是一種保守的分解代謝過程，參與細胞許多生理過程。 自噬發生過程中，細胞質成分被溶酶體蛋白酶溶解。 此外，自噬有助于去除受損的細胞器和細胞質聚集體，從而緩解細胞應激并維持體內平衡。 最近研究發現， 自噬在NPC 發生發展過程中扮演著重要角色，如鄭方靜等[13]研究發現，上調miR-216a 可誘導NPC 細胞自噬的產生，進而抑制細胞增殖、侵襲及血管合成。 也有文獻報道，miR-197-3p 可抑制NPC細胞自噬，進而抑制腫瘤細胞惡性表型，增強放射治療敏感性[14]。 有研究發現，抑制自噬可增強NPC 的化學治療敏感性[15]。 這些研究說明，自噬在NPC 發生發展及治療中扮演著重要角色。 鑒于自噬在NPC 中的作用，筆者觀察了miR-140-3p 與NPC 自噬的關系。LC3 是自噬小體上的膜蛋白，在自噬泡形成過程中發揮重要作用， 自噬形成后，LC3Ⅰ經泛素化修飾形成LC3Ⅱ，被認為是自噬的標記物[16]。 p62 在自噬小體與溶酶體融合后被降解，因此自噬發生時p62 蛋白水平減少[17]。 Beclin1 可誘導自噬泡的形成，可促進自噬的形成。 筆者研究結果顯示，上調miR-140-3p 可促進LC3Ⅱ、Beclin1 表達，抑制p62 表達，提示miR-140-3p 誘導了腫瘤自噬產生，反之下調miR-140-3p 得到相反的結果。

ATG5 位于人體染色體6q21 位點， 在自噬小體形成過程中，ATG5 蛋白可與ATG12 形成復合物，錨定于自噬泡膜上，促進自噬體膜的延伸，促進自噬體形成[18]。 大量研究發現，ATG5 與惡性腫瘤進展、化學治療抵抗有關[19，20]。但ATG5 與NPC 的關系尚不清楚，筆者研究結果顯示，NPC 細胞ATG5 蛋白表達水平低于正常鼻腔黏膜細胞， 提示ATG5 可能參與了NPC發生。 多種miRs 與ATG5 存在靶向調控關系[21，22]，既然miR-140-3p 可調控自噬， 因此筆者猜測miR-140-3p 與ATG5 可能存在靶向關系。 筆者研究結果顯示，miR-140-3p 與ATG5 mRNA 存在核苷酸結合位點， 進一步熒光素酶實驗證實兩者存在靶向關系。進一步研究發現， 上調miR-140-3p 可促進NPC 細胞ATG5 蛋白表達，反之下調miR-140-3p 抑制NPC細胞ATG5 蛋白表達。最后回復實驗表明，上調ATG5可逆轉敲低miR-140-3p 對NPC 細胞自噬的抑制作用。 通過以上結果證明miR-140-3p 可通過正性調控ATG5 介導的自噬。

總之，miR-140-3p 可正性靶向調控ATG5，進而抑制NPC 細胞的增殖、侵襲、遷移及自噬。 miR-140-3p 有望成為NPC 防治的一個靶點。