自動化磁珠法提取血清脂溶性維生素應用LC-MS/MS檢測的性能評價

孔 卓，李春艷（北京積水潭醫院醫學檢驗中心，北京 100035）

脂溶性維生素是體內的輔酶和催化劑，主要溶解于脂肪，儲存于肝臟，對人體的生長發育、免疫、應激等均有重要作用。脂溶性維生素缺乏會引起人體生理機能、新陳代謝、細胞調節紊亂，誘發多種疾病，而攝入過量則易引起蓄積中毒，甚至導致死亡[1-2]。因此，監測人體內脂溶性維生素的濃度非常必要，有助于人體健康的評價、疾病的診斷以及治療過程中攝入量的控制，臨床意義重大。液相色譜串聯質譜（liquid chromatography-tarndem mass spectromerry,LC-MS/MS）技術以其高靈敏度、高特異度的強大優勢，被廣泛應用于臨床檢驗領域，且在維生素、單胺類神經遞質、激素等項目的檢測中備受青睞。目前臨床采用質譜技術檢測脂溶性維生素的過程中，大多是通過手工操作完成樣本提取，以萃取法居多，需濃縮、正壓、多次離心等[3-6]，自動化程度極低，對操作人員技能要求較高，容易出現假陽性結果。自動化磁珠法樣本制備前處理簡單，自動化程度較高，極大程度地降低了人為因素，節約了人力和時間成本，并且有望將液相色譜-串聯質譜技術發展成為前處理和檢測一體的全自動分析儀。故本研究擬采用磁珠法進行樣本前處理，聯合液相色譜串聯質譜檢測人血清中脂溶性維生素含量，并與傳統萃取法檢測結果作為對照，評估該檢測程序的分析性能，為臨床脂溶性維生素樣本檢測自動化前處理的方法選擇提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集當天臨床檢測剩余血清樣本，選取非乳糜、黃疸的200 例樣本分裝后保存于-80℃備用。本研究經過醫院倫理委員會審核批準后實施。

1.2 儀器與試劑 液相色譜串聯質譜系統（美國Waters Xevo TQ-S IVD）；ZPTQ 32 自動化磁珠法質譜全自動樣品處理系統（北京梅斯質譜生物科技有限責任公司）；BY-R20 型高速冷凍離心機（北京白洋醫療器械有限公司）；MTV-100 多管渦旋混合儀和MB100-2A 微孔板恒溫振蕩器（杭州奧盛儀器有限公司）；傳統萃取法脂溶性維生素測定試劑盒（杭州凱萊譜精準醫療檢測技術有限公司）；自動化磁珠法脂溶性維生素測定試劑盒（北京梅斯質譜生物科技有限責任公司）。維生素A 質控品：90，432，864 ng/ml；25-維生素D2質控品：3，14.4，28.8 ng/ml；25-維生素D3質控品：7.5，36，72 ng/ml；維生素E 質控品：1 725，8 280，16 560 ng/ml；維生素K 質控品：0.3，1.44，2.88 ng/ml。

1.3 方法

1.3.1 自動化磁珠法樣本制備：按照試劑盒操作說明操作，將100 μl 血清樣本加入預設的96 孔中的樣本位置，再將同位素內標加入其中，后將96 孔板轉移至前處理系統ZPTQ 32 儀器中進行自動化樣本提取。標線、質控和樣本同步操作處理。

1.3.2 傳統萃取法樣本制備：按照試劑盒操作說明操作，取50 μl 血清樣本，加入250 μl 脂溶性維生素萃取液（含內標），渦旋8 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液200 μl 待測。標線、質控和樣本同步操作處理。

1.3.3 色譜條件：色譜柱為 Kinetex 2.6 μm C18 100A 30×2.1 mm，流動相為0.1%甲酸水（A）～ 0.1%甲酸甲醇（B），梯度洗脫：0～ 0.5 min，40%流動相A；0.5～ 2 min，40%～ 0%流動相A；2～ 3.5 min，0%流動相A；3.51～ 5 min，40%流動相A；流速0.5 ml/min；柱溫40 ℃，進樣量10 μl。

1.3.4 質譜條件：采用正離子電噴霧離子化多反應監測模式（MRM），離子源溫度 150℃，毛細管電壓 3.5 kV，脫溶劑氣和輔助氣為氮氣，脫溶劑氣（氮氣）體積流量 800 L/h，脫溶劑氣溫度 600℃，其他主要參數見表1。

表1 脂溶性維生素的相關質譜參數

1.3.5 性能驗證：性能驗證過程參考《液相色譜-質譜臨床應用建議》[7]和《液相色譜串聯質譜臨床檢測方法的開發與驗證》[8]兩部專家共識。

1.3.5.1 線性、定量限和檢測限評價指標 以標準溶液的濃度為X軸，標準品和內標峰面積的比值為Y軸，進行線性回歸分析，經“1/X2”權重得到線性回歸方程，且r2＞0.99。將血清樣本中各物質峰面積和其內標的峰面積比值代入線性回歸方程，計算樣本中脂溶性維生素A，D2，D3，E，K 的含量。檢測限為信噪比≥3 時的濃度，定量限為信噪比≥10 時的濃度，且連續10 次測定的變異偏差應＜20%。

1.3.5.2 精密度評價方案：混合血清樣本平均分為2份，1份加入適量低濃度混合標準品作為低值樣本，1 份加入適量高濃度混合標準品作為高值樣本，混勻后分別分裝保存于-80 ℃冰箱。每天各取出1 支，制備8 個平行管，測定三個批次，計算精密度，批內精密度和批間精密度的相對偏差應≤±15%。

1.3.5.3 正確度評價方案：通過加標回收率判斷測定準確度，混合血清、混合血清添加脂溶性維生素A，D2，D3，E，K 兩個水平的混合標準品溶液各10 μl，按上述前處理方法處理，各制備3 個平行管，計算加樣回收率和測量偏差，加樣回收率的相對偏差應≤±15%。

1.3.5.4 基質效應評價方案：采用樣本處理后加入法。取8 份來源于不同個體的血清樣本，每份樣本分為3份，經過自動磁珠法提取后，一份加入水空白，一份加入10 μl 脂溶性維生素高濃度混合標準品，最后一份加入10 μl 脂溶性維生素低濃度混合標準品，3 份均加入20 μl 混合內標。去除空白樣本的信號值后與溶劑中標準品峰面積（或峰面積比值）進行比較，判斷基質效應，基質效應的相對偏差應≤±15%。

1.3.5.5 攜帶污染評價方案：選擇高值質控和低值質控樣本作為實驗對象，分別進行高-低質控進樣循環5 次和低-低質控進行循環5 次，高-低值樣本循環進樣結果均值與低-低值樣本循環進樣結果均值之差應小于低-低值樣本循環進樣結果均值的3s。

1.4 統計學分析 兩種前處理方法提取并檢測，檢測結果使用MedCalc?20.0.27（比利時MedCalc Software bvba 公司）軟件進行統計學分析。采用Bland-Altman 法比較兩種前處理方法結果的一致性，通過Passing-Bablok 回歸分析兩種前處理方法結果之間的相關性。

2 結果

2.1 血清樣本經自動化磁珠法提取脂溶性維生素后檢測得到的各色譜峰 峰形對稱，峰形良好互不干擾；與傳統萃取法提取后的檢測結果比較，未發現自動化磁珠法提取后的雜峰有明顯增多。

2.2 自動化磁珠法提取脂溶性維生素性能評價結果2.2.1 線性、定量限和檢測限：脂溶性維生素A，D2，D3，E，K 在標準曲線范圍內相關性良好，各批次的相關系數均在0.99 以上，定量限和檢測限滿足要求，相關具體參數見表2。

表2 磁珠法提取脂溶性維生素LC-MS/MS 檢測的回歸方程、相關系數、線性范圍、定量限及檢出限

2.2.2 精密度和正確度：見表3。脂溶性維生素A，D2，D3，E，K 的低值樣本和高值樣本批內精密度分別在0.66%～4.83%，0.15%～3.70%；批間精密度分別在1.16%～4.33%，2.44%～6.61%，加標回收率在87%～112%，百分偏差均在±15%以內，滿足檢測要求。

表3 磁珠法提取脂溶性維生素LC-MS/MS 檢測的精密度和正確度

2.2.3 基質效應和攜帶污染：見表4。脂溶性維生素A，D2，D3，E，K 在電噴霧離子源檢測下幾乎沒有基質抑制，經同位素內標校正，基質效應均在100%左右；高-低值樣本循環進樣結果均值與低-低值樣本循環進樣結果均值之差均小于低-低值樣本循環進樣結果均值的3s，滿足檢測要求。

表4 磁珠法提取脂溶性維生素LC-MS/MS 檢測的基質效應和攜帶污染

2.2.4 方法比對：見表5。對自動化磁珠法和傳統萃取法兩種方法提取200 例臨床血清樣本中脂溶性維生素的測定結果進行Bland-Altman 和Passing-Bablok 回歸分析。Bland-Altman 分析結果顯示所有樣本均在±1.96s，表明兩種提取方法檢測結果具有較高的一致性，Passing-Bablok 回歸分析結果顯示兩種提取方法的檢測結果相關性良好（均r＞0.99，95% CI 均在0.986～0.997 之間）。

表5 兩種方法提取臨床血清樣本中脂溶性維生素的測定結果比較

3 討論

脂溶性維生素是人體內不可或缺的一類營養物質，缺乏或過量均會對身體機能造成損傷，誘發多種疾病[3,5]。人體缺乏維生素A，會引起兒童發育不良、皮膚干燥、干眼病、夜盲癥等；缺乏維生素D 可能會導致兒童佝僂病、成人骨質疏松癥、軟骨癥、肌無力，增加老年人跌倒和骨折的風險；維生素E 與肌肉、神經、生殖有關，攝入不足可能產生運動失調、毛發脫落、不育等癥狀；維生素K 又叫凝血維生素，缺乏可能致凝血時間延長，嚴重時危及生命[9]。但是補充過量的脂溶性維生素同樣會導致不良事件的發生，維生素A 補充過量可引起維生素A 過多癥、牙齦出血，甚至出現急性或慢性中毒；維生素D 補充過量則可能會導致血鈣濃度過高，引起鈣鹽在腎臟、肺臟、神經系統和心血管系統等重要器官和組織的沉積鈣化，產生不可逆的嚴重損害；長期服用較大劑量的維生素E 有可能出現肌無力、疲倦、頭痛和惡心等中毒癥狀，維生素E 過量還可能引起大出血；過量補充維生素K 會導致人體發生癌癥和出現皮疹的現象，孕婦服用大劑量維生素K有可能造成新生兒黃疸。綜上所述，對于兒童以及孕婦等特殊人群，準確檢測脂溶性維生素尤為重要。

兒童由于受關注度高、年齡小、描述病情能力弱等特點，在兒科臨床診療工作中，許多家長以及一些臨床醫生對兒童是否要補充維生素、是否需要持續補充以及擔心維生素過量或中毒等方面常常存在困惑。脂溶性維生素譜檢測為指導臨床上維生素科學合理補充提供有力的參考依據。對于高代謝水平的孕產婦而言，維生素缺乏或過量均會造成不理想的妊娠結局，有研究表明，維生素D 與維生素D受體結合后可參與胚胎著床、妊娠相關蛋白和細胞因子的分泌及鈣的輸送，在維持正常妊娠和胎兒發育中發揮著重要作用[10]。由于孕婦及家屬對維生素的認知不足，只是單純認為補充維生素D 就夠了，忽視了維生素A，E，K 的意義，導致妊娠期、圍產期以及新生兒發育期間產生不同程度的危害。故建議提高醫生及孕婦對合理補充維生素的重視程度，加強宣傳和引導，使孕期維生素營養檢測成為常規，根據孕婦自身需要制定個體化補充方案，避免因補充不當造成孕產婦及圍生兒隱匿性不良結局。因此，對人體內脂溶性維生素含量的檢測是非常必要的。

目前臨床常用的方法主要集中在免疫法、色譜法和質譜法，各有優劣。免疫法雖操作簡單，但無法精準區分VD2，VD3，只能測VD 總含量，且不可同時檢測多種脂溶性維生素[3]；色譜法可精準區分VD2，VD3，也可同時檢測多種脂溶性維生素，但其靈敏度不高，且操作復雜[11-13]；常見的質譜法雖然靈敏度高，但其前處理的方法包括固相萃取、液液萃取及蛋白沉淀等，均存在各自不足，如蛋白沉淀的方式簡單、成本低，但是處理粗糙，對儀器、色譜柱污染較大，且易出現離子抑制導致檢測靈敏度較差，一般僅適用于含量較高的藥物濃度監測；液液萃取的方式成本較低，但是使用揮發性溶劑較多，且需經過離心、取上清、氮吹等較為繁瑣的步驟，僅適用于脂溶性維生素、脂肪酸等中等極性或弱極性物質的提??；若是含量較低的代謝物或激素類物質需使用固相萃取法，該方法能有效提取濃縮待測物，但成本較高，還需多次離心、濃縮等復雜過程，對操作人員要求較高，自動化程度極低，容易造成假陽性結果[3-5]。

本研究采用的磁珠法是通過在磁珠表面進行化學基團修飾，使待測物與磁珠表面鍵合相發生吸附解吸附的過程（模擬固相萃?。?，將活化平衡后的磁珠加入待測樣本中，充分混勻，使待測物被吸附在磁珠上，再通過不同極性強度的洗脫溶液洗脫，以達到待測物的分離和純化[14-15]。與傳統固相萃取法相比，磁珠法通過磁珠的轉移來實現目標待測物的分離，不僅操作簡單、自動化程度較高，且未來有望實現前處理和檢測分析一體的全自動液相色譜-串聯質譜設備。

綜上，自動化磁珠法樣本制備聯合液相色譜串聯質譜檢測人血清中脂溶性維生素的檢測性能穩定，滿足相關指南及臨床檢測要求。磁珠法在未來有望實現大規?；瘧糜谂R床質譜檢測的自動化前處理過程，提高檢測效率和精度，方便臨床檢驗應用。