不同月齡蘇淮育肥豬纖維表觀消化率、腸道長度與微生物差異分析

杜陶然,牛清,5,蒲廣,李開軍,劉根盛,牛培培,張總平,李強,李平華,黃瑞華*

(1.南京農業大學養豬研究所,江蘇 南京210095;2.南京農業大學淮安研究院,江蘇 淮安 223001;3.淮安新勢畜牧服務有限公司,江蘇 淮安 223001;4.淮安市淮陰新淮種豬場,江蘇 淮安 223322;5.上海市農業科學院,上海 201106)

作為世界第一養豬大國,我國目前豬飼料原料以玉米、豆粕為主。在我國飼料資源逐漸匱乏,玉米、大豆等糧食作物進口量不斷提高,“人畜爭糧”矛盾日漸突出的情況下,尋找谷物飼料原料的替代品迫在眉睫。近年來,人們對豬飼料研究的關注點也從蛋白質和能量飼料轉移到來源豐富且價格低廉的粗飼料上。因此,研究中國地方豬種的耐粗飼性能,促進中國地方豬節糧型粗飼技術的推廣,可以大幅度降低飼養成本,減少浪費和污染,緩減農業資源的供需矛盾。

豬胃和小腸不能產生降解日糧纖維的酶,消化吸收粗纖維主要通過其大腸中微生物的降解來實現[1]。大腸內微生物,尤其是纖維分解菌分泌纖維素酶復合體,將纖維作為發酵底物,水解纖維素聚合體,產生單糖或寡糖,再經發酵產生乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸(short chain fatty acid,SCFA),最終被機體吸收利用,其中結腸中SCFA可為生長豬提供 5%～28%的能量來源[2]。

不同品種豬腸道發育存在差異,在相同生長環境中,中國地方豬品種及含有地方豬血統的培育豬種能夠表現出更優的纖維適應力[3]。Fevrier等[4]對大白豬和梅山豬飼喂高粗纖維的日糧,發現梅山豬較大白豬更耐粗飼。Kemp等[5]對梅山豬與荷蘭長白豬飼喂粗纖維日糧,結果同樣發現梅山豬的日糧粗纖維消化率明顯高于長白豬。Urriola等[6]用梅山豬和不同年齡體重的約克夏豬進行試驗,在回腸末端制作簍管,測定不同品種豬飼喂不同水平日糧纖維消化率的差異,結果發現梅山豬較約克夏豬具有更高的消化道表觀總消化率。

中國地方豬品種的耐粗特性可能與其腸道發育有關。Fevrier等[4]發現梅山豬較大白豬有更強的粗纖維消化能力的優勢緣于梅山豬擁有更重的胃腸道。Urriola等[6]研究也認為,梅山豬對高纖維日糧消化率更強的原因,與梅山豬大腸相對質量更重緊密相關。Yen等[7]研究也證實梅山豬胃腸道質量顯著大于大白豬。程澤信等[8]通過對野豬和長白豬內臟器官的觀察發現,野豬的十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸的長度寬度均比長白豬大,且質量也比長白豬大,說明野豬的耐粗飼能力強。宋青龍等[9]對8月齡野豬和長白豬的研究發現,野豬消化道主要器官胃、小腸、大腸、肝和胰的相對長度或相對質量均高于長白豬。特別是與消化有關的小腸的相對質量、大腸的相對長度兩指標達到了極顯著的水平。

除腸道發育外,腸道微生物也是影響豬纖維消化能力的重要因素。Fevrier等[4]發現梅山豬較大白豬更耐粗飼的原因是梅山豬擁有更豐富的大腸微生物。Urriola等[6]研究也發現,梅山豬大腸內活躍的纖維降解菌對不同纖維日糧消化能力不同,其具體的微生物學機制尚未明晰。目前明確影響纖維消化率的微生物報道不多,其中白化瘤胃球菌、柔嫩梭菌是常見的纖維分解菌[10]。

豬的纖維降解能力也與日齡有關,許多研究表明豬的日齡越大,其利用纖維的能力越強。Bindelle等[10]運用體外發酵方法發現不同年齡階段不同體重豬腸道菌群的發酵能力不同;Urriloa等[6]也發現 102 kg 的大白豬對干酒糟及其可溶物中的粗纖維(crude fiber,CF)表觀總消化率顯著高于80 kg的大白豬。本實驗室前期對28、60、90和150 d蘇太豬的纖維表觀消化率進行了分析,發現CF和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber,ADF)的表觀消化率在 150 d 時最高,且與年齡成正相關;90 d組中性洗滌纖維(neutral detergent fiber,NDF)表觀消化率極顯著高于60 d組,與150 d組無顯著性差異[11],但育肥后期(7、8月齡)的纖維消化能力是否存在差異未知。

蘇淮豬是我國新近培育成功的瘦肉型豬種,含有75%大白血統和25%淮豬血統,具備其父本大白豬瘦肉率高的特點,又保留其母本淮豬“耐粗”的特性。本課題組前期研究表明,蘇淮豬可以適應35%的全脂米糠高纖維日糧[12-13],而且用12.77%脫脂米糠替代部分育肥日糧中的玉米對蘇淮豬生長性能和營養物質表觀消化率無顯著影響[14],初步證明蘇淮豬的耐粗特性。蘇淮豬的商品銷售以優質肉為主,適度控制其生長速度,不在6月齡上市,延長飼養期是生產優質肉的有效手段,因此蘇淮豬育肥豬一般7或8月齡上市。但蘇淮豬育肥后期(7、8月齡)的纖維消化能力是否存在差異未知,其纖維消化率能力與其腸道發育和腸道常見纖維分解菌關系有待確定。因此,本課題比較了7、8月齡蘇淮豬的各類纖維表觀消化率與腸道發育的差異,并將纖維表觀消化率與腸道長度、周長進行了相關性分析,探究蘇淮豬腸道發育與纖維消化能力之間的關系。并使用real-time PCR技術,研究7、8月齡高、低纖維消化率蘇淮豬盲腸和結腸內白化瘤胃球菌和柔嫩梭菌2種常見纖維分解菌的豐度差異。本研究為探究7、8月齡蘇淮豬纖維消化能力提供數據,為改良蘇淮豬日糧配方,降低養殖成本提供理論依據,為我國地方豬種及含地方豬種血緣的培育豬種育肥后期的耐粗飼特性研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

在江蘇省淮安市淮陰種豬場選取82頭出生條件相似的蘇淮豬,隨機分為2組,在相同飼養環境下飼養,在7、8月齡時分別進行屠宰。采集結腸后端內容物樣品,保留2管微生物樣品,其余制成風干樣待檢,測定不同月齡豬結腸后段各營養成分的表觀消化率。測定不同月齡豬腸道(大腸、小腸及腸道總長)長度、周長,進行消化率與腸道長度、周長的相關性分析。再根據結腸后段纖維的表觀消化率,分別在7、8月齡豬中選取高纖維消化率組和低纖維消化率組各5頭進行盲腸、結腸內容物微生物Real-time PCR測定。飼養試驗在江蘇省淮安市淮陰種豬場進行。飼料均未添加抗生素。

1.2 試驗動物飼養管理

試驗豬每日飼喂2次,時間分別為08：30—09：30和14：30—15：30。試驗過程采用干料飼喂,飼喂時間段自由飲食,全天自由飲水,日常管理與防疫按照場內生產常規進行,試驗豬只屠宰前2個月均未使用抗生素治療。試驗日糧成分如表1所示。

表1 試驗日糧原料組成和營養組成Table 1 Ingredient composition and nutrient composition of the experimental diet %

1.3 屠宰試驗

將2組豬只飼養至7月齡(210±7)d和8月齡(240±7)d,禁食12 h后運送至淮安蘇食肉品有限公司進行屠宰,期間允許自由飲水。采用宰前電擊暈法及頸部大血管放血法進行屠宰。所有試驗程序、動物飼養和屠宰均按照南京農業大學動物福利與倫理委員會制定的《實驗動物飼養與使用指南》[認證號：SYXK(蘇)2017-0007]進行。

1.4 營養成分表觀消化率的測定

豬只屠宰后,采集結腸后端內容物樣品,每200 g內容物加入15 mL 10%硫酸溶液混合均勻,-20 ℃儲存。將內容物樣品65 ℃烘干后用粉碎機粉碎過40目篩,105 ℃烘干至恒重后進行各營養物質的表觀消化率測定。采用《飼料中鹽酸不溶灰分的測定：GB/T 23742—2009》的方法測定鹽酸不溶灰分(acid insoluble ash,AIA)含量;采用Kjeltec8400 FOSS全自動凱氏定氮儀測定粗蛋白(crude protein,CP)含量;采用《食品中脂肪的測定：GB/T 5009.6—2003》的索氏抽提法測定粗脂肪(ether extract,EE)含量。采用《動物飲料和寵物食品中的(粗)纖維：AOAC 962.09》的方法測定粗纖維(crude fiber,CF)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber,NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber,ADF)含量。消煮器為ANKOM A200i半自動纖維分析儀。營養成分(CP、EE、CF、NDF、ADF)表觀消化率(%)=100×[1-(飼料中AIA的含量×糞便中的該營養成分含量)/(糞便中AIA的含量×飼料中的該營養成分含量)]。

1.5 腸道指標的測定

豬屠宰后迅速剖開腹腔,取出完整胃腸道,保留其中內容物,將各腸段分界處雙結扎,腸段分段,分離出小腸(含十二指腸、空腸、回腸)、盲腸、結腸,在自然伸展狀態下,用皮尺測量小腸、大腸的絕對長度。雙手平托盲腸使其處于自然狀態,選擇盲腸最寬處,使用軟繩緊貼腸道環繞1周,再測量軟繩長度即為盲腸周長。在測量大腸長度時確定大腸中間點,雙手平托中間點周圍結腸使其處于自然狀態,使用軟繩緊貼腸道環繞1周,再測量軟繩長度即為結腸周長。

1.6 腸道纖維分解菌數量測定

根據結腸后段纖維的表觀消化率結果,分別從7、8月齡豬中選取高纖維消化率組和低纖維消化率組各5頭進行盲腸、結腸內容物腸道纖維分解菌豐度測定。使用TIANamp Stool DNA Kit(DP328)提取盲腸、結腸內容物DNA。白化瘤胃球菌和柔嫩梭菌的引物序列、擴增片段長度及來源文獻見表2。

表2 PCR引物及相關參數Table 2 PCR primer and parameters

根據上述特異性引物以及最適退火溫度對于不同細菌進行PCR擴增。利用PCR產物片段純化試劑盒對擴增產物進行回收純化后進行Vector載體連接與目的片段的克隆。使用質粒提取試劑盒提取含有目的片段的質粒。PCR產物經12 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段長度,然后經過DNA產物純化試劑盒純化后測定PCR產物的濃度?？截悢涤嬎愎剑?/p>

拷貝數=c×10-9×6.02×1023/(660×X)

(1)

式中：c為DNA濃度(ng·μL-1);X為目的片段長度。再利用ABI 7300 Real-time PCR儀對結腸內容物中總細菌及相關微生物數量進行定量分析。

將2種細菌的標準樣品和待測樣品同時進行PCR反應,繪制標準曲線。以不同拷貝數的陽性模板的對數為縱坐標,以PCR反應過程中出現熒光信號的初始循環數(CT)為橫坐標繪制標準曲線。待測樣品和標準曲線進行比較,獲得各樣品中2種細菌的絕對數量。

1.7 數據處理與分析

試驗數據采用Excel 2010軟件進行初步整理,用SPSS 19.0軟件包ANOVA進行單因素方差分析,并進行相關性分析。試驗結果以平均數±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 不同月齡蘇淮豬營養物質表觀消化率指標差異分析

如圖1所示,8月齡蘇淮豬的CP、EE、CF、NDF、ADF的表觀消化率均顯著高于7月齡(P<0.05)。

圖1 7月齡(n=42)和8月齡(n=40)蘇淮豬營養成分表觀消化率的差異比較Fig.1 Comparison of nutrient digestibility of Suhuai pigs at 7 months(n=42)and 8 months age(n=40) CP：Crude protein;EE：Ether extract;CF：Crude fiber;NDF：Neutral detergent fiber;ADF：Acid detergent fiber. *P<0.05;**P<0.01. The same as follow.

2.2 不同月齡蘇淮豬腸道指標差異分析

如圖2-A所示,蘇淮豬7、8月齡大腸(盲腸與結腸)長度、小腸(十二指腸、空腸、回腸、盲腸)長度及腸總長指標均無顯著差異。蘇淮豬7、8月齡盲腸周長及結腸周長指標均無顯著差異(圖2-B)。

圖2 蘇淮豬腸道長度(A)和周長(B)在7、8月齡之間的差異比較(n=42)Fig.2 Comparison of the intestinal length(A)and circumference(B)of Suhuai pig between 7 months and 8 months age(n=42)

2.3 腸道指標與營養成分表觀消化率相關性分析

由表3可知,盲腸周長與EE、CF、和ADF的表觀消化率顯著正相關(P<0.05)。其他腸道指標與EE、CF、和ADF的表觀消化率均無顯著相關性。

表3 腸道指標與腸道中營養成分消化率的相關系數(n=82)Table 3 Correlation coefficient between intestinal index and nutrient digestibility of intestinal tract(n=82)

2.4 7和8月齡高、低纖維消化率組的盲腸和結腸微生物豐度差異性分析

由2.1節結果可知,日齡對蘇淮豬結腸后段纖維消化率影響顯著,而且日齡對腸道微生物有影響。因此,為排除日齡的影響,根據結腸后段纖維的表觀消化率,分別在7、8月齡豬中選取NDF表觀消化率最高和最低的蘇淮豬各5頭,進行盲腸、結腸內容物常見纖維分解菌豐度測定。結果如表4可知：7月齡與 8月齡高纖維消化率組的各營養成分表觀消化率均極顯著高于低纖維消化率組(P<0.01);在高纖維消化組中,8月齡的NDF、ADF消化率顯著高于7月齡,而低纖維消化組中7、8月齡間表觀消化率無顯著差異。由圖3可知,7月齡和8月齡高、低纖維消化率蘇淮豬組間的盲腸、結腸中白化瘤胃球菌和柔嫩梭菌的豐度均無顯著差異。7月齡蘇淮豬的結腸柔嫩梭菌豐度在高、低纖維消化率組均顯著高于盲腸(P<0.05)。低纖維消化率組蘇淮豬的結腸柔嫩梭菌豐度在8月齡時顯著低于7月齡(P<0.05)。

圖3 7和8月齡高、低纖維消化率組蘇淮豬的盲腸和結腸微生物豐度(n=5)Fig.3 The bacterial abundance of different fiber digestibility groups at 7 months and 8 months age of Suhuai pig(n=5)

表4 高、低纖維消化率組蘇淮豬的結腸營養成分的表觀消化率(n=5)Table 4 The nutrient digestibility of high and low NDF digestibility groups of Suhuai pig(n=5) %

3 討論

3.1 營養成分表觀消化率指標分析

本試驗中8月齡蘇淮豬對粗蛋白、粗脂肪、粗纖維的表觀消化顯著高于7月齡。豬是單胃雜食動物,對不同飼料同一營養物質消化率不同,不同生長階段豬消化道的結構、功能、長度和容積的變化對飼料的消化力也不一樣。隨著年齡的增長,豬消化器官和機能發育日趨完善,對飼料蛋白質、脂肪、粗纖維的消化率也隨之上升,尤以粗纖維最為明顯[15]。研究表明,油脂的利用率隨動物年齡的變化而變化,動物越小,對脂肪的利用率越低[16]。由于幼齡動物的消化系統仍處于生長完善過程中,其與油脂消化相關的膽汁分泌、消化酶分泌及活性都不足,因而對日糧脂肪的消化吸收率也較低。研究證實,豬日齡越大,利用纖維的能力越強。Renteria-Flores[17]發現由于后備母豬沒有達到它們的成熟年齡,一方面胃腸道容積小于經產母豬,另一方面與經產母豬相比,胃腸道菌群發育還不夠完善,因此經產母豬對纖維的消化率高于后備母豬;Noblet等[18]發現成年豬對纖維性飼料的消化率遠高于生長豬;Fernndez等[19-20]也證實成年母豬后腸微生物活性高于生長豬;Le Goff等[21]也證實母豬消化發酵纖維的能力比生長豬強。下一步試驗可以從腸道形態、微生物方面考慮,進一步探究產生這一變化的原因。

3.2 腸道指標與表觀消化率相關性分析

大腸,特別盲腸是豬主要的發酵器官[22],Bach-Knudsen等[23]研究表明,盲腸及結腸對碳水化合物的發酵量占大腸總發酵量的92%,可見豬大腸的微生物發酵主要集中在大腸的前部。豬大腸的消化細菌主要分布在盲腸,淀粉分解菌和纖維分解菌占主要的優勢。小腸對纖維的消化率較低(低于25%),纖維進入大腸后的消化率高(大于85%),因此,豬盲腸中纖維分解菌對進入大腸的消化殘渣有十分重要的消化作用[24]。不同生理階段的豬對纖維利用率差異主要取決于腸道容積大小及大腸微生物的發酵能力,而腸道的發育與腸道微生物也有密切的關系。從相關文獻的一些數據可以看出,一個品種或品系的消化性能往往與其消化道的形態結構存在聯系[4,12]。本試驗中盲腸周長與粗纖維、ADF的表觀消化率呈顯著正相關。關于盲腸長度與粗纖維消化率之間的相關性研究并不多,秦貴信等[25]認為一般消化道較重、較長或容積較大者,食糜在體內存留的時間較長,飼料養分的消化率也較高。在消化道結構上,品種間的差異在大腸上表現較明顯。因為豬飼料粗纖維的主要消化吸收部位是后段消化道,因此,在養分消化率方面,品種間的差異在粗纖維上表現最大。豬種間消化性能差異在消化道形態結構和生理機能上也表現出一致性。推測試驗中導致這一結果的原因可能是盲腸容積增加使纖維分解菌定殖增加,導致消化率升高。但盲腸長度也是一個重要的因素,本試驗沒有單獨測量盲腸長度,無法說明這一點。

3.3 蘇淮豬7、8月齡高、低纖維消化率組腸道纖維分解菌差異

豬通過大腸中微生物的發酵作用消化日糧纖維,這些微生物在豬盲腸和結腸中數量最多,纖維類物質被多種纖維降解菌產生的纖維降解酶降解。豬腸道內纖維降解菌主要有黃化瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)、白化瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)和產琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)等[26-27]。研究表明,纖維類型對豬后腸中白化瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)數量變化無顯著影響,對黃化瘤胃球菌(Rumincoccusflavefaciens)、產琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)和梭菌Ⅳ群(ClostridiumclusterⅣ)的數量變化存在顯著影響[28],且不同腸段間也有一定差異。

不同細菌具有的基因拷貝數不同,而目前對于腸道中各種細菌基因組基因拷貝數的認識有限[29]。因此,對于不同菌株構成的某類細菌群體的準確數量目前難以測定,一般用其基因拷貝數來估算[30]。本試驗進一步以等梯度稀釋的標準品為模板,用作定量分析,標準品擴增值與目標細菌的拷貝數間呈線性相關。所有豬飼喂同一種日糧并飼養于同一環境,這樣可減少遺傳背景、日糧和環境等對試驗的影響。在對相關纖維分解菌的定量研究中,7月齡和8月齡高、低纖維消化率蘇淮豬組間的盲腸、結腸白化瘤胃球菌和柔嫩梭菌的豐度均無顯著差異。造成定量結果無差異的原因可能是其他未知的纖維分解菌與蘇淮豬耐粗特性相關,同時也有可能是受試驗樣本數較少的影響。下一步需要尋找其他未知的與蘇淮豬纖維表觀消化率相關的纖維分解菌。