日糧精粗比對舍飼育肥牦牛瘤胃菌群結構、揮發性脂肪酸及其轉運載體表達量的影響

徐俊杰,王瑩,丁寧,馬向花,劉塔,周天賜,李濤,袁朝海,張威,蔡亞非*

(1.南京農業大學動物科技學院,江蘇 南京 210095;2.江蘇省奶牛生產性能測定中心,江蘇 南京 210095;3.廣州海關技術中心,廣東 廣州 510623;4.青海省海南州科技局,青海 海南813000)

牦牛作為多經濟用途的高原特種牛種,其養殖業是青海省的特色優勢產業。舍飼育肥是青海省在牦牛產業化養殖發展大環境下進行積極探索總結的技術。牛的瘤胃代謝對維持機體正常運轉至關重要。作為與宿主互利共生的瘤胃微生物,它們幫助宿主消化降解粗纖維飼料、蛋白飼料、能量飼料和脂肪飼料,并為機體提供營養物質[1-2]。在反芻動物瘤胃中,各菌群之間相互依存又相互制約,維持瘤胃內環境的穩態。動物品種、年齡、性別、日糧結構和健康狀況等都可影響動物瘤胃發酵狀況,其中日糧結構作為穩定可控的因素一直是研究熱點之一。研究表明,反芻動物瘤胃微生物菌群結構和瘤胃發酵類型受日糧結構因素調節,合適的日糧精粗(質量)比可改善動物機體瘤胃代謝水平,提高生產性能[3]。但由于牦牛特殊的日糧結構組成,目前舍飼育肥牦牛尚無專門化日糧飼喂體系。同時,舍飼條件下如何提高育肥牦牛日糧能量利用效率和優化瘤胃發酵的機制尚不明確。近年來調控日糧結構對舍飼育肥牦牛瘤胃代謝影響的相關研究較少,所以,本試驗給舍飼育肥牦牛飼喂精粗比(質量比)為3∶7、5∶5、7∶3的全混合日糧,通過測定瘤胃液細菌菌群結構、瘤胃液VFA含量、瘤胃上皮細胞中VFA轉運載體表達量以及生產性能,探究適合舍飼育肥牦牛飼喂的日糧結構組成。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物試驗在青海省海南藏族自治州共和縣下梅村興隆牦牛養殖合作社(E100.62°,N36.28°,平均海拔3 200 m)進行。預飼期為7 d,正式飼喂時間為90 d。試驗選取15 頭健康閹牦牛,年齡2～3 歲,平均體重約130.4 kg。

1.1.2 飼養管理將牦牛分為A、B、C 3組,日糧精粗(質量)比分別為3∶7、5∶5、7∶3,每組5 頭,每個試驗組牦牛飼養在不同的單獨圈舍,自由飲水。依據預飼期牦牛采食規律,每日上午10：00飼喂1次,按照每頭牛平均5 kg日糧進行飼喂,次日早上收集剩余料。

1.1.3 試驗日糧精料組成參照青海省地方標準《出欄牦牛適度補飼技術：DB 63/T 1787—2020》中“出欄牦牛適度補飼精料配方及養分含量”。精料組成及營養水平見表1。粗料組成：短芒老麥芒、玉米秸稈和苜蓿草按 1∶1∶1(質量比)配制。

表1 精飼料組成及營養水平Table 1 Composition and nutritional level of concentrate

1.2 樣品采集

正式試驗結束,將試驗牦牛禁食12 h后進行屠宰。瘤胃液采集：取出瘤胃切口,持滅菌的一次性10 mL注射器吸取瘤胃液若干,置于10 mL滅菌離心管中,迅速放入液氮凍存,轉移至-80 ℃冰箱保存備用。瘤胃液細菌菌群結構測定;將10 mL離心管中瘤胃液4 ℃、12 000 r·min-1離心5 min,將上清液分裝轉移至新的5 mL離心管中,-80 ℃保存,用于測定瘤胃發酵參數。

瘤胃上皮組織采集：打開瘤胃,剪取瘤胃上皮(背囊、腹囊、背盲囊和腹盲囊)若干,用1×PBS將組織沖洗干凈,撕去肌肉層,將瘤胃上皮修剪為大約4 cm2塊狀并放入2 mL凍存管中,立即置于液氮中速凍,保存在-80 ℃冰箱中,用于RNA和蛋白提取。

1.3 試劑與方法

1.3.1 瘤胃菌群測定細菌DNA的提取參照D4015糞便DNA提取試劑盒(D4015 Stool DNA Kit)進行。采用ABI GeneAmp?9700 型PCR儀進行PCR試驗。設計16S v3-v4區特定引物擴增特異區域,引物名稱341F：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′/806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR 采用 2×Phanta Master Mix,30 μL 反應體系：2×Phanta Master Mix 15 μL、Bar-PCR primer F(10 μmol·L-1)1 μL、Primer R(10 μmol·L-1)1 μL、Genomic DNA 10～20 ng,補 ddH2O 至 30 μL。PCR 反應參數：95 ℃預變性5 min;27個循環：95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s;熔解曲線：72 ℃ 10 s,10 ℃ ∞。電泳驗證并進行引入 Illumina 橋式 PCR 兼容引物的擴增。擴增結束后對產物進行瓊脂糖電泳檢測。檢測參數：膠濃度 20 g·L-1、電壓80 V、電泳時間40 min。剪切并回收目的條帶,使用Thermo Scientific公司GeneJET膠回收試劑盒回收純化產物。樣品的 16S rDNA 檢測由南京集思慧遠生物科技有限公司完成。

1.3.2 瘤胃發酵參數測定瘤胃pH值測定：取出舍飼育肥牦牛瘤胃液,紗布過濾后收集到5 mL試管中,用pH計(賽多利斯,型號：PB-10)測定。取出低溫保存的瘤胃液樣品,放到4 ℃冰箱緩慢解凍,解凍后 8 000 r·min-1離心10 min。量取10 mL瘤胃液上清液,倒入離心管中,加入3 mL體積比為1∶1的25%偏磷酸去蛋白溶液和0.6% 2-乙基丁酸混合液,放入-20 ℃冰箱中,以備VFA含量測定。VFA含量參照曹慶云等[4]的方法測定,氣相色譜儀使用島津GC-2014。

1.3.3 瘤胃上皮VFA轉運載體基因表達量測定利用Trizol裂解組織、氯仿分相、異丙醇沉淀、乙醇洗滌,得到純凈的總RNA。采用TaKaRa反轉錄試劑盒進行cDNA的合成,所得cDNA保存于-20 ℃冰箱。RT-qPCR引物均購自上海生工生物工程有限公司,引物序列見表2。利用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix檢測揮發性脂肪酸轉運載體基因mRNA的表達水平,反應產物經熔解曲線檢測特異性。以GAPDH為內參并以A組為對照組采用2-ΔΔCT法計算目的基因mRNA相對表達水平。

表2 實時熒光定量PCR的引物序列Table 2 Primer sequence of real-time fluorescent quantitative PCR

1.3.4 瘤胃上皮VFA轉運載體蛋白表達量測定使用蛋白抽提試劑盒提取各組牦牛肝臟組織總蛋白,蛋白提取過程中按1%比例加入蛋白酶抑制劑PMSF和磷酸酶抑制劑。測定提取的蛋白濃度(碧云天BCA試劑盒)。均一化蛋白濃度后經變性轉到PVDF膜上,50 g·L-1BSA封閉1.5 h,添加一抗4 ℃搖床孵育過夜,再用TBST洗3 次,每次15 min,加二抗孵育1.5 h,TBST洗3 次,每次10 min,用ECL化學發光試劑盒進行顯影。所用抗體稀釋比例見表3。

表3 抗體稀釋比例Table 3 Antibody dilution ratio

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 日糧精粗比對牦牛瘤胃微生物多樣性的影響

2.1.1 牦牛瘤胃微生物16S rRNA測序基本數據如表4所示：A組測序產生的可見物種數量略高于B組和C組。隨著日糧精料比例升高,舍飼育肥牦牛瘤胃微生物Chao1、ACE、Shannon和Simpson多樣性指數均有升高趨勢(P>0.05);C組細菌覆蓋率略高于A組和B組。

表4 牦牛瘤胃微生物16S rRNA測序基本數據Table 4 Basic data of 16S rRNA sequencing of yak rumen microorganisms

由圖1可知,3組共有OTU個數為2 032。其中A組和B組之間共有239個OTU,A組和C組之間共有198 個,B組和C組間共有213 個。A、B、C 3組特有的OTU個數分別為619、195、149。

圖1 3組牦牛瘤胃微生物OTU聚類分析Fig.1 OTU cluster analysis of yak rumen microorganisms in three groups

2.1.2 日糧精粗比對牦牛瘤胃細菌相對豐度(門、屬水平)的影響由表5可知,日糧精粗比顯著影響舍飼育肥牦牛瘤胃細菌菌群在門和屬水平的組成。在門水平上的舍飼育肥牦牛瘤胃細菌中,Firmicutes和Bacteroidetes相對豐度之和比例達80%～90%,是絕對優勢菌群。日糧精粗比水平對牦牛瘤胃細菌中Firmicutes、Bacteroidetes、Spirochaetes、Tenericutes和Lentisphaerae影響顯著(P<0.05)。隨著精料比例升高,Bacteroidetes、Spirochaetes和Lentisphaerae相對豐度顯著上升(P<0.05),Firmicutes和Tenericutes相對豐度顯著下降(P<0.05)。在屬水平上,Prevotella、RikenellaceaeRC9gutgroup和ChristensenellaceaeR7group相對豐度較高。隨著精料比例升高,瘤胃中相對豐度前10的菌屬除了Ruminococcus、Pseudobutyrivibrio和Bacteroides下降外,其余均升高。

表5 日糧精粗比對牦牛瘤胃細菌門和屬水平組成的影響

2.2 日糧精粗比對牦牛瘤胃發酵參數的影響

如表6所示,隨日糧精料比例升高瘤胃pH值顯著下調(P<0.05),乙酸濃度和乙酸濃度/丙酸濃度值顯著下降(P<0.05),丙酸、戊酸和總VFA濃度顯著增加(P<0.05),異戊酸濃度有上升趨勢(P>0.05)。C組丁酸和異丁酸濃度顯著高于A、B組(P<0.05)。

表6 日糧精粗比對牦牛瘤胃VFA含量的影響Table 6 Effect of dietary concentrate to roughage ratio on rumen VFA content of yak

2.3 日糧精粗比對牦牛瘤胃上皮VFA轉運載體基因表達的影響

如圖2所示,日糧精粗比顯著影響舍飼育肥牦牛瘤胃上皮VFA轉運載體mRNA表達量,其中DRA、PAT1、MCT1表達量顯著上升(P<0.05),A組MCT4 mRNA表達量顯著低于B組和C組(P<0.05),而AE2表達量顯著降低(P<0.05)。

圖2 日糧精粗比對牦牛瘤胃上皮VFA轉運載體mRNA相對表達量的影響Fig.2 Effect of dietary concentrate to roughage ratio on relative mRNA expression level of volatile fatty acid transporter in yak rumen epithelium不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Values with different letter mean significant difference(P<0.05). The same below.

2.4 日糧精粗比對牦牛瘤胃上皮VFA轉運載體蛋白表達的影響

如圖3所示,隨著日糧精料比例增加,牦牛瘤胃上皮VFA轉運載體蛋白DRA、PAT1、MCT1、MCT4表達量顯著升高(P<0.05),AE2的表達量顯著降低(P<0.05)。蛋白表達趨勢與mRNA的一致。

圖3 日糧精粗比對牦牛瘤胃上皮VFA轉運載體蛋白相對表達量的影響Fig.3 Effect of dietary concentrate to roughage ratio on relative expression of volatile fatty acid transporter protein in yak rumen epithelium

2.5 日糧精粗比對牦牛生產性能的影響

如圖4所示,隨著日糧精料比升高牦牛的平均日增重、飼料轉化率與屠宰率顯著提高,且A、B、C組間差異顯著(P<0.05)。

圖4 日糧精粗比對牦牛生產性能的影響Fig.4 The effect of d dietary concentrate to roughage ratio on the production performance of yaks

3 討論

3.1 日糧精粗比對牦牛瘤胃微生物多樣性的影響

影響瘤胃微生物區系的因素很多,日糧作為穩定可控的因素被廣泛研究。瘤胃優勢菌群隨日糧結構變動而改變,當粗料比例較高時,纖維降解菌豐度增加;精料比例較高時,淀粉降解菌豐度增加[5]。隨著湖羊精料比例下降,湖羊瘤胃菌群的香濃指數和辛普森指數顯著降低,ACE和Chao1指數也有下降趨勢[6]。本研究中,隨著日糧精料水平的增加,瘤胃菌群多樣性Chao1、ACE、香濃指數以及辛普森指數趨于升高,菌群檢測覆蓋率也升高,與上述研究結果一致。日糧中添加精料會導致犢牦牛Firmicutes和Bacteroidetes相對豐度降低,Proteobacteria相對豐度升高[7]。本試驗中,精料比例升高會導致Bacteroidetes相對豐度升高,推測是因為年齡或日糧結構不同所致。研究發現,隨著日糧能量水平的提高,舍飼牦牛的Spirochaetes相對豐度顯著提高[8];荷斯坦奶牛瘤胃Lentisphaerae的16S rRNA相對豐度隨日糧中蛋白和能量水平的升高而升高,且受異丁酸、戊酸和異戊酸的影響顯著[9];隨著日糧中能量飼料的升高,肉牛瘤胃Tenericutes的相對豐度顯著降低[10]。本試驗中,隨著日糧精料比例升高,舍飼育肥牦牛瘤胃內Firmicutes和Tenericutes相對豐度顯著降低,Bacteroidetes、Spirochaetes和Lentisphaerae的相對豐度顯著升高,與上述研究結論相一致。

本試驗中舍飼育肥牦牛瘤胃Prevotella、RikenellaceaeRC9gutgroup和ChristensenellaceaeR7group相對豐度占前三。Prevotella是一種具有多種代謝功能的菌,隨著日糧含氮化合物水平的提高,黃牛瘤胃Prevotella所占比例顯著增加[11]。本試驗中,隨著精料比例升高,Prevotella相對豐度顯著升高,RikenellaceaeRC9gutgroup和ChristensenellaceaeR7group在3組牦牛瘤胃中都占整個細菌菌屬5%～10%。研究表明,Succiniclasticum對淀粉和糖類的降解具有重要作用[12-13];瘤胃中可溶性碳水化合物可被Treponema降解[14]。本試驗中,隨著日糧精料比例升高,C組牦牛瘤胃中RikenellaceaeRC9gutgroup、ChristensenellaceaeR7group、Saccharofermentans、Succiniclasticum、Treponema相對豐度顯著高于A組。研究表明,Bacteroides和Ruminococcus的主要功能是降解日糧中的半纖維素和纖維素[15],Pseudobutyrivibrio的主要功能是降解碳水化合物[16]。本試驗中,C組舍飼育肥牦牛瘤胃中Bacteroides、Pseudobutyrivibrio和Ruminococcus相對豐度顯著低于A組,與上述文獻結論一致。

3.2 日糧精粗比對牦牛瘤胃發酵參數的影響

崔安等[17]研究發現,隨著日糧精料比例升高,秦川肉牛公牛、閹牛和母牛的瘤胃液pH值為6.22～6.80,且pH值隨日糧精粗比的提高顯著下降。孫光明等[20]研究報道,分別給西藏牦牛飼喂低精料(精粗比為40∶60)和高精料(精粗比為60∶40)日糧,各組瘤胃液的pH值為6.0～6.3,略低于正常區間,推測可能是因為日糧精料過高所致。本試驗中,舍飼育肥牦牛瘤胃pH值為6.20～6.90,處于正常區間,說明日糧精粗比對舍飼育肥牦牛瘤胃發酵環境沒有負面影響,且pH值隨著精料比例提高顯著下降。

VFA為機體生長發育提供底物,乙酸/丙酸值可反映瘤胃發酵狀況[19]。反芻動物日糧中精料比例高,瘤胃發酵傾向丙酸發酵,反之則傾向乙酸發酵[20]。郭盼盼等[21]對延邊黃牛的研究結果表明,隨著精料比例升高,黃牛瘤胃中乙酸和乙酸/丙酸比值顯著下降,丙酸和TVFA濃度顯著上升,本研究結果與之一致。孫光明等[18]研究發現,提高西藏牦牛日糧精料水平瘤胃TVFA含量顯著增加,但異丁酸和異戊酸在TVFA的比例顯著降低,乙酸、丙酸、丁酸、戊酸比例不受日糧精粗比影響。本試驗中,增加精料比例,丁酸和異丁酸含量提高,但異戊酸含量對日糧精粗比變化沒有響應,這與前人研究結果不一致,推測可能與海拔和日糧組成差異有關。

3.3 日糧精粗比對牦牛瘤胃上皮VFA轉運載體表達量的影響

對反芻動物瘤胃上皮在高谷物日糧飼喂中的適應機制研究發現,提高日糧精料水平,瘤胃上皮DRA和MCT1 mRNA及其蛋白表達量成倍增加[22-23],藏綿羊瘤胃上皮DRA和MCT1的mRNA表達量顯著提高[24];高能組奶牛瘤胃上皮的DRAmRNA表達量相比低能組提高了約60%,而AE2表達量則下降了30%[25];飼喂35%精料組山羊瘤胃上皮的DRA、PAT1、AE2、MCT1和MCT4 mRNA表達量均顯著高于飼喂10%精料組[26];奶牛瘤胃液pH值降低時,瘤胃上皮MCT1表達量上升,而AE2表達量下降[27]。本試驗中,隨著日糧精料比例的升高,舍飼育肥牦牛瘤胃上皮DRA、PAT1、MCT1和MCT4的基因和蛋白表達量均顯著上升,AE2表達量顯著下降。隨著飼料中精料的比例增加,總VFA含量升高,其相應的VFA轉運載體表達發生變化,與VFA的變化趨向一致。

3.4 日糧精粗比對牦牛生產性能的影響

隨著日糧中精料比例逐漸增加,其對于牦牛的生產性能有顯著影響。趙占強等[28]研究表明,飼喂精粗比為67.1∶32.9的飼料,牛育肥效果優于精粗比為57.0∶43.0和45.7∶54.3,日增重顯著升高。楊超[8]研究結果表明,當牦牛日糧能量水平升高時,飼料轉化率也隨之升高。本試驗結果證明牦牛在日糧精粗比為 7∶3 時平均日增重和飼料轉化率最高,這與前人研究結果一致。本試驗中,隨著精料比例升高,育肥牦牛的屠宰率也顯著升高,與姚延琴等[29]對黑山羊屠宰性能的研究結果相一致。

綜上所述,在本試驗條件下,當精粗比為7∶3時,牦牛生產性能提高,瘤胃產生的揮發性脂肪酸含量最高,瘤胃上皮組織中揮發性脂肪酸轉運載體表達量最高,可以最大程度將揮發性脂肪酸轉運入血液,為下一步機體的脂肪沉積提供底物,即育肥效果更好。