不同包被緩釋尿素的瘤胃緩釋效果的評價

曹力文,馮春燕,溫世寶,鄭文金,申軍士*,毛勝勇,朱偉云

(1.國家動物消化道營養國際聯合研究中心/南京農業大學動物科技學院消化道微生物研究室,江蘇 南京 210095; 2.上海美農生物科技股份有限公司,上海 201807)

隨著我國畜牧業的快速發展,優質飼料資源長期短缺,特別是蛋白質飼料資源短缺成為制約我國畜牧業發展的瓶頸。對于反芻動物來說,瘤胃微生物可以利用非蛋白氮作為氮源合成微生物蛋白,微生物蛋白在進入消化道后被消化、吸收,滿足反芻動物機體的生長或生產需要[1-2]。因此,在反芻動物日糧中添加部分非蛋白氮可以達到減少對優質蛋白質飼料原料依賴的目的。尿素因其含氮量高、價格低廉、易于制取等優勢,成為非蛋白氮飼料中的主導品種[3]。但尿素進入瘤胃后很快就會在瘤胃微生物所分泌脲酶的作用下水解為氨和二氧化碳,當日糧中尿素水平過高時,會使產氨的速度超過瘤胃微生物利用氨的速率,造成瘤胃內氨的積累[4-5]。多余的氨通過瘤胃上皮吸收入血到達肝臟,在肝臟尿素循環的作用下重新轉化為尿素,最終大部分隨尿液排出體外,造成尿素氮的浪費和對環境的污染[6-7]。緩釋尿素技術可以減緩氨的釋放速度,使能氮的釋放更加趨于同步,提高瘤胃微生物對尿素氮的利用效率[8]。包被緩釋尿素是目前最新的尿素緩釋技術,多使用天然聚合物對尿素進行包被,具有緩釋性佳、安全性高、適口性好等優點[9]。目前市售包被緩釋尿素產品眾多,但其質量良莠不齊,緩釋效果不一。本研究通過體外發酵、體內瘤胃灌注和持續動態人工瘤胃模擬3個試驗,逐步模擬真實生產中的瘤胃環境,探究緩釋尿素在不同場景中的緩釋效果及其對瘤胃氨濃度、發酵參數和微生物蛋白合成的影響,旨在為緩釋尿素產品的有效利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 體外發酵試驗

1.1.1 試驗動物及材料選取市面常見的1種常規飼料級普通尿素和4種商業包被緩釋尿素(A、B、C、D),使用凱氏定氮法測定其含氮量。具體尿素含氮量見表1。發酵底物為4 g全混合飼料(青貯玉米,20%;花生秧,20%;玉米,27%;豆粕,13%;干酒槽及其可溶物(DDGS),11%;麩皮,5%;碳酸氫鈉,1%;預混料,3%,以上均為質量分數)。瘤胃液供體為南京農業大學實驗動物中心4只體況良好、體重相近(平均25.0 kg)的安裝有瘤胃瘺管的公湖羊,日糧為精粗比60∶40(質量比)的全混合日糧(日糧組成與發酵底物相同),每日08：00和18：00飼喂,自由飲水。

表1 普通尿素和各緩釋尿素的含氮量及添加量Table 1 Nitrogen content and urea supplementation dose of common urea and slow-release urea

1.1.2 試驗設計采用單因素試驗設計,共分為5個組,每組4個重復。在1 000 mL發酵瓶中分別添加等氮含量的普通尿素和緩釋尿素A、B、C、D。具體尿素添加量見表1。

1.1.4 樣品采集分別在發酵0、1、3、6、9、12、24 h時采集2 mL發酵液,保存于-20 ℃冰箱用于氨氮濃度的測定。

1.2 瘤胃灌注試驗

1.2.1 試驗動物及材料試驗原料為體外發酵試驗所用普通尿素和4種緩釋尿素中緩釋效果最好的包被尿素(緩釋尿素A)。灌注對象為12只體況良好、體重相近[(27.6±2.37)kg]的安裝有瘤胃瘺管的公湖羊,隨機平均分為2組,分別灌注普通尿素和緩釋尿素。湖羊日糧為精粗比60∶40(質量比)的全混合日糧(日糧組成與體外發酵試驗的發酵底物相同),每日08：00和18：00飼喂,自由飲水。

1.2.2 試驗設計采用單因素試驗設計,試驗分為2個處理,分別灌注普通尿素(普通尿素組)和緩釋尿素A(緩釋尿素組)。普通尿素灌注劑量為湖羊日均干物質采食量的0.5%(統計試驗前7 d動物的采食量來計算確定尿素灌注量)。灌注劑量見表2。普通尿素和緩釋尿素灌注劑量計算公式如下：

表2 育肥湖羊日均采食量和尿素灌注劑量Table 2 Dry matter intake and urea infusion dose of fattening Hu sheep

普通尿素組：灌注劑量(g)=日均干物質采食量(kg)×1 000×0.5%;

緩釋尿素組：灌注劑量(g)=普通尿素組灌注劑量(g)×45.46%(普通尿素含氮量)/41.5%(緩釋尿素A含氮量)。

1.2.3 尿素灌注和樣品采集晨飼后2 h(10：00)通過瘤胃瘺管將尿素顆粒直接投入瘤胃內,并將尿素顆粒和瘤胃內容物充分混勻。在灌注前0 h和灌注后1、3、6 h分別采集50 mL 瘤胃液,用pH計測定pH值后保存于-20 ℃冰箱,用于氨氮濃度的測定。

1.3 人工瘤胃試驗

1.3.1 人工瘤胃裝置運行參數本研究所用持續動態人工瘤胃系統由沈維軍等[11]在2012年研制的基礎上改進而來,包括發酵裝置、溢流裝置、液體供應組件、數據檢測組件和主控機構5部分。參照伍夢楠等[12]的方法設置運行參數。

1.3.2 瘤胃液來源及材料試驗原料為體外發酵試驗所用普通尿素和4種緩釋尿素中緩釋效果最好的包被尿素(緩釋尿素A)。瘤胃液采自北京畜牧獸醫所昌平基地內3只體況良好的荷斯坦奶牛。奶牛日糧為精粗比50∶50(質量比)的全混合日糧(青貯玉米,50%;豆粕,9.5%;棉籽,4.5%;菜粕,2%;DDGS,5%;噴漿玉米皮,2.4%;玉米粉,22.5%;石粉,0.7%;食鹽,0.5%;氧化鎂,0.3%;磷酸氫鈣,0.3%;脂肪粉,1%;小蘇打,0.8%;預混料,0.5%,以上均為質量分數)。每日09：00和21：00兩次添加日糧作為發酵底物。

1.3.3 試驗設計試驗共分為3個發酵處理組,分別為：基礎日糧+豆粕(普通日糧組)、基礎日糧+普通尿素(普通尿素組)和基礎日糧+緩釋尿素(緩釋尿素組),使用玉米補充普通尿素和緩釋尿素組能量的缺乏。試驗共重復進行3次,每次發酵持續7 d,前4 d為適應期,后3 d為采樣期。試驗日糧配方見表3。發酵過程始終保持在39 ℃恒溫下進行,緩沖液以60 mL·h-1的恒定速率流入發酵罐內,每日09：00和21：00向發酵罐中加入20 g飼料。

表3 試驗日糧原料組成和營養組成Table 3 Ingredient and nutrient composition of the experimental diets %

1.3.4 瘤胃液接種試驗開始前24 h將機器調試完好并在每個發酵罐中放入500 mL發酵緩沖液并預熱,發酵緩沖液參照McDougall[13]經典配方配制。晨飼后2 h通過瘤胃瘺管采集瘤胃液,使用4層紗布過濾后倒入保溫壺進行保溫并迅速帶回實驗室接種。向每個發酵罐中加入500 mL過濾后的瘤胃液,接種完成后立即加入20 g飼料。

1.3.5 樣品采集采樣期每日09：00加料前后選擇不同時間點進行采樣。在加料前(0 h)和加料后1、2、4、7、12 h分別采集發酵液20 mL,用pH計測定pH值后保存于-20 ℃冰箱,用于氨氮濃度的測定。于加料前(0 h)和加料后4 h額外采集20 mL發酵液,保存于-20 ℃冰箱,用于揮發性脂肪酸濃度的測定。于加料前(0 h)和加料后12 h分別采集10 mL溢流液,保存于-20 ℃冰箱,用于微生物蛋白濃度的測定。

1.4 發酵參數的測定

尿素含氮量的測定：參照張麗英[14]的方法,取適量尿素加入10 mL濃硫酸,420 ℃消煮3 h后使用凱氏定氮儀測定樣品含氮量。飼料常規成分的測定：將飼料樣在65 ℃環境下烘干,粉碎后過40目篩,參照張麗英[14]的方法,在(105±2)℃烘箱中將飼料樣烘干至恒重,以測定飼料中水分含量;取適量飼料樣進行消煮后使用凱氏定氮儀測定飼料中粗蛋白含量;采用索氏脂肪提出器用乙醚抽提飼料樣以測定飼料中粗脂肪含量;將飼料樣放入馬弗爐中經550 ℃灼燒以測定飼料中粗灰分含量;分別將中性洗滌劑和酸性洗滌劑加入纖維分析儀中測定飼料中中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量。氨態氮濃度的測定：取發酵液樣品流水解凍,參照Chaney等[15]的方法,以氯化銨為標準品,用比色法進行氨態氮濃度的測定。揮發性脂肪酸的測定：參照秦為琳[16]的方法進行揮發性脂肪酸的測定。取待測樣品,經流水解凍后,4 ℃,12 000 r·min-1離心10 min,上清液經0.22 μm針式過濾器過濾后使用氣相色譜儀(島津GC-2014C)進行測定,其中柱溫130 ℃,汽化溫度180 ℃,檢測溫度180 ℃,壓力為60 kPa,氫氣壓力為50 kPa,氧氣壓力50 kPa。

1.5 數據處理與分析

體外發酵試驗數據使用SPSS 23.0軟件進行分析,因時間和處理的交互作用顯著,通過單因素方差分析(ANOVA)檢驗比較每個時間點的組間差異,再使用LSD法進行多重比較。瘤胃灌注試驗數據使用SPSS 23.0軟件進行分析,因時間和處理的交互作用顯著,通過獨立樣本t檢驗比較每個時間點兩組間的差異。人工瘤胃試驗的數據采用SAS 9.4軟件混合模型進行分析,處理、采樣時間和采樣時間與處理的交互作用作為固定效應。P≤0.05表示差異顯著,0.05

2 結果與分析

2.1 不同緩釋尿素在體外發酵中的氨釋放速率

由圖1可知：在體外發酵的前12 h,不同處理組的氨釋放速率不同。在發酵3 h時,緩釋尿素A組和緩釋尿素C組的氨態氮濃度均顯著低于普通尿素組(P<0.05)。在發酵的9、12 h,緩釋尿素A組和緩釋尿素D組的氨態氮濃度均顯著低于其他3組(P<0.05),且緩釋尿素A組的氨態氮濃度顯著低于緩釋尿素D組(P<0.05)。

圖1 不同處理對體外發酵氨態氮濃度動態變化的影響Fig.1 Effects of different treatments on dynamic change of ammonia concentration in the in vitro cultures*P<0.05. The same as follows.

2.2 尿素灌注對湖羊瘤胃氨態氮濃度和pH值的影響

如圖2-a所示：向瘤胃灌注尿素后,2組的氨態氮濃度均呈現先升高后降低的趨勢,相比于普通尿素組,緩釋尿素組的氨態氮濃度變化曲線較為平緩。灌注后1 h時,普通尿素組的氨態氮濃度達到最高且顯著高于緩釋尿素組(P<0.05)。灌注后3 h時,緩釋尿素組的氨態氮濃度達到最高且數值上高于普通尿素組,但差異不顯著(P>0.05)。

圖2 尿素灌注對育肥湖羊瘤胃氨態氮濃度(a)和pH值(b)動態變化的影響Fig.2 Effects of urea infusion on the dynamic change of rumen ammonia concentration(a) and pH value(b)in fattening Hu sheep

如圖2-b所示：灌注尿素后普通尿素組的pH值呈現先升高后降低的趨勢,而緩釋尿素組的pH值升高后保持在相對穩定的范圍內。灌注1 h時普通尿素組的pH值達到最高,顯著高于緩釋尿素組(P<0.05),灌注6 h時普通尿素組pH值降至最低且顯著低于緩釋尿素組(P<0.05)。

2.3 不同處理對持續動態人工瘤胃發酵參數的影響

如圖3-a所示：3個處理組的氨態氮濃度在09：00投料后均有先升高后降低的變化趨勢。相比于普通日糧組,普通尿素組和緩釋尿素組發酵罐內的氨態氮濃度均提高,但差異不顯著(P>0.05)。3個處理組的氨態氮濃度均在發酵1 h時達到最高,在發酵7 h時降至最低。不同的是,在0～12 h時相比于普通日糧組和普通尿素組,緩釋尿素組的氨氮濃度變化幅度較小。

圖3 不同處理對持續動態人工瘤胃模擬系統氨態氮濃度(a)和pH值(b)動態變化的影響Fig.3 Effects of the different treatments on dynamic change of ammonia concentration(a) and pH value(b)in continuous artificial rumen simulation systemPT、Pt、PT×t分別為各處理組、時間點和處理與時間交互作用的P值。下同。PT,Pt,PT×t represent the P-value of treatment,time,and the interaction between treatment and time,respectively. The same below.

如圖3-b所示：不同處理組的pH值變化趨勢基本相同,隨著發酵時間的延長,pH值先下降后升高。3個處理的pH值均在發酵4 h時降至最低,隨后緩慢升高,在12 h時升至最高。如表4所示：經過7 d的發酵,普通尿素組的pH值顯著高于緩釋尿素組(P<0.05)。

表4 緩釋尿素添加對持續動態人工瘤胃模擬系統發酵參數動態變化的影響Table 4 Effects of slow-release urea supplementation on dynamic change of fermentation characteristics in continuous artificial rumen simulation system

如表4所示：相比于普通日糧組和普通尿素組,緩釋尿素組的微生物蛋白和丙酸濃度顯著升高(P<0.05),總揮發性脂肪酸和丁酸的濃度有提高,但差異不顯著(P>0.05)。3組間乙酸、異丁酸、戊酸、異戊酸的濃度差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

尿素在瘤胃微生物分泌脲酶的作用下,進入瘤胃后首先分解為氨,隨后被瘤胃微生物利用合成微生物蛋白,因此直接測定發酵體系內的氨態氮濃度即可體現尿素分解程度,評估其緩釋效果。體外發酵試驗周期短,樣本容量大,且之前的研究發現體外培養法評估緩釋尿素的緩釋效果具有較高的準確性[17]。不過由于產物抑制、揮發性脂肪酸積累導致pH值下降等原因,經一定時間培養后會有微生物的活力下降、組成變化等問題,故體外發酵不能完全代表反芻動物瘤胃內發酵的情況。因此本研究首先通過體外發酵法評估了幾種不同緩釋尿素,并篩選出緩釋效果最好的緩釋尿素產品,隨后通過瘤胃灌注法,將緩釋尿素投注到育肥湖羊瘤胃內,評估其在瘤胃環境中的緩釋效果。相比于普通尿素,緩釋尿素能夠降低瘤胃內氨態氮濃度,瘤胃內環境的改變會影響瘤胃內菌群結構[18-19],瘤胃菌群結構的變化又會導致微生物發酵產物的差異[20]。而短期發酵難以體現添加尿素對瘤胃發酵的影響,因此在體外發酵試驗和瘤胃灌注試驗中僅針對氨態氮濃度進行了測定。持續動態人工瘤胃裝置可以滿足長期發酵要求,能夠實現發酵底物和緩沖液的連續進入和排出,且發酵參數接近活體反芻動物瘤胃內發酵狀況[11]。因此本研究通過持續動態人工瘤胃裝置探究日糧添加緩釋尿素對微生物蛋白合成和瘤胃發酵的影響。

維持瘤胃內適宜的氨態氮濃度能夠改善瘤胃發酵,促進微生物蛋白的合成,提高動物機體對尿素氮的利用效率,減少糞尿中氮排泄引起的環境污染[21]。體外發酵試驗結果顯示在體外發酵3、9和12 h的氨態氮濃度具有顯著差異,說明4種緩釋尿素在體外發酵前12 h的緩釋效果不同。其中緩釋尿素A具有最好的緩釋效果,部分緩釋尿素的尿素分解速度與普通尿素相近,可能是緩釋尿素包被材料和包被技術的不同導致其緩釋效果的差異。每100 mL瘤胃液或100 g內容物每小時可以將 80～100 mg尿素轉化為氨[22],這一速率遠高于本研究中的尿素水解速率,在本研究中所有處理組的尿素完全水解都需要24 h。這可能與瘤胃液接種量較少有關,初始微生物數量較少,因此需要更長的時間來分解高劑量的尿素。此外本研究添加尿素劑量超過實際生產中所添加的濃度,大量尿素分解產生的高氨濃度會抑制尿素酶的活性[23],這也可能在一定程度上降低了尿素的分解速度。最終根據體外發酵過程中分解產氨速度,本研究篩選出緩釋尿素A進行后續試驗。

本研究瘤胃灌注試驗結果與預期相符,相比于普通尿素,緩釋尿素降低了瘤胃內的尿素分解速度,這與Sinclair等[23]在山羊的瘤胃原位降解試驗中得出的結果一致,說明緩釋尿素能夠同步氨與可發酵碳水中能量的釋放,以提高尿素氮的利用效率。灌注后普通尿素組的最大氨態氮濃度超過最佳瘤胃細菌生長值(19.32 mg·dL-1)的2倍[25],雖然仍低于氨中毒的標準[26],但會導致大量的氨來不及被瘤胃微生物利用就隨糞尿排出體外,造成尿素氮的浪費。此外,本研究發現相比于普通尿素,緩釋尿素維持了瘤胃內pH值的穩定,這是由于緩釋尿素能夠持續分解產氨,尿素分解產生的氨為弱堿性且可以中和瘤胃發酵產生的酸,從而緩解瘤胃pH值的降低的問題[27]。普通尿素在瘤胃內快速分解產氨使瘤胃pH值在短時間內快速升高,而pH值的升高會促進瘤胃內游離氨濃度的升高和瘤胃上皮對氨的吸收,增加反芻動物氨中毒的風險[28-29]。以上結果說明,相比于普通尿素,緩釋尿素能夠維持瘤胃內氨態氮濃度和pH值的穩定,這與前人關于緩釋尿素研究得出的結果一致[23]。

在前面2個試驗結果的基礎上,本研究又通過體外持續動態人工瘤胃裝置模擬真實瘤胃環境,探究緩釋尿素的緩釋效果和對瘤胃發酵參數、微生物蛋白合成的影響。由于持續動態人工瘤胃裝置采用了1 000 mL的發酵罐,瘤胃液和緩沖液的接種比例為1∶1,所需瘤胃液劑量較大,因此本試驗采取奶牛為瘤胃液供體。本研究發現,雖然不同試驗組在發酵過程中的總氨態氮濃度沒有顯著差異,但緩釋尿素組的氨態氮濃度在早晨投料后的2～4 h間略有上升,說明緩釋尿素延緩了尿素的分解時間,表現出了一定的緩釋效果。前人研究發現,適宜的氨態氮濃度有利于瘤胃微生物的生長,提高微生物蛋白的合成效率[30]。此外,瘤胃中適宜的能氮比可以使微生物獲取的能氮更加平緩,充分發揮微生物發酵效率,促進揮發性脂肪酸的合成[31]。在本研究中,緩釋尿素維持了氮的同步釋放,促進了微生物的生長,從而提高了微生物蛋白和丙酸的產量。此外,緩釋尿素維持了氨態氮濃度的穩定,這可能促進了初級產丙酸菌的增殖,進而導致丙酸濃度的升高[32]。微生物蛋白和揮發性脂肪酸分別是反芻動物的主要蛋白來源和能量來源[2,33],其中丙酸作為主要的糖異生前體物,在瘤胃內的利用效率最高[34]。由此可見,在日糧中添加等氮含量的緩釋尿素更有利于獲得維持生命和生產所需的能量。健康的反芻動物瘤胃pH值為6.1～6.8,保持動態平衡,以維持瘤胃功能的正常運轉[29]。在本研究中,日糧添加不同類型尿素沒有顯著影響發酵液pH值,但采樣期所有試驗組發酵液的pH值均降至5.8以下,低于正常的瘤胃pH值范圍。發酵液的pH值受到碳水化合物發酵產酸、微生物對揮發性脂肪酸的吸收利用和食糜隨溢流液外流的影響,當揮發性脂肪酸的產量超過微生物的利用能力時,會有一部分揮發性脂肪酸留在發酵罐內,造成發酵罐內揮發性脂肪酸的積累,從而降低發酵液pH值[35]。

綜上,本研究選用3種方法全面評價了包被緩釋尿素在不同環境中的緩釋效果,其中體外批次發酵適用于多種緩釋尿素產品的緩釋效果的初步篩選,瘤胃灌注能準確反映緩釋尿素在瘤胃內的緩釋效果,持續動態人工瘤胃能一定程度體現緩釋尿素對瘤胃發酵的影響。結果顯示,不同緩釋尿素產品在體外發酵中的緩釋效果具有顯著差異,包被尿素A緩釋效果最好;體外發酵篩選出的緩釋尿素在體內灌注試驗條件下同樣具有良好的緩釋效果,且能夠維持瘤胃內氨態氮濃度和pH值的穩定;持續人工動態瘤胃裝置試驗發現緩釋尿素能夠改善瘤胃發酵,促進微生物蛋白的合成?？偟膩碚f,緩釋尿素能夠降低尿素分解速度,維持適宜的瘤胃氨態氮濃度和pH值,提高尿素氮的利用效率,但對生長性能和瘤胃菌群的影響仍需動物飼養試驗做進一步的驗證。