維甲酸對熱應激小鼠睪丸損傷的保護作用

石一凡,李曉彤,鎖云鵬,劉俊澤,李春梅,李延森

(南京農業大學動物科技學院家畜環境控制與智慧生產研究中心,江蘇 南京 210095)

近年,高度集約化和規?；B殖方式迅速發展,畜禽飼養密度較高,夏季高溫引起的熱應激非常普遍,已成為畜牧業養殖中備受關注的問題之一[1]。雄性家畜,如豬、牛、羊睪丸懸浮在體腔外,環境高溫可直接使其溫度升高,與其他器官相比,睪丸更容易受到熱應激的影響[2]。睪丸溫度過高不利于精子生成,導致精子活力降低,附睪精子和睪丸生精細胞都容易受到熱應激的影響[3]。此外,熱應激還會降低精子的數量和活力[4],以及存活精子的受精能力[5]。

維甲酸(retinoic acid,RA)又稱為視黃酸,是維生素A進入動物體內后的活性代謝物,其異構形式有 9-順式維甲酸、13-順式維甲酸和全反式維甲酸(all-transretinoic acid,ATRA),其中ATRA是睪丸發育過程中的重要啟動物質[6],有抗炎[7]、抗氧化[8]、抑癌[9]和抗纖維化[10]等多重生物學功能。研究表明,ATRA在精原細胞分化、減數分裂起始,血睪屏障(blood-testis barrier,BTB)形成,精子發生和精子形成過程中發揮重要作用[11-14]。另外,ATRA能夠重新調整精子代謝,使其接近獲能狀態,保護精子免受活性氧損傷,提高抗氧化酶活性[15]。然而,目前還沒有關于維甲酸是否能干預環境高溫影響睪丸功能的相關研究。

本試驗以小鼠為研究對象,通過全身熱暴露建立熱應激模型,同時為小鼠灌胃維甲酸,旨在分析維甲酸是否能保護小鼠睪丸組織免受熱應激帶來的損傷,并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與材料

本試驗得到南京農業大學動物倫理委員會批準(審核編號：NJAU.No20220517106)。所有試驗程序均嚴格按照中華人民共和國科技部《實驗動物管理和治療規范》以及《實驗動物管理和治療條例》進行。

試驗共選取40只體重相近的7周齡ICR雄性小鼠(購自南京卡萊斯生物科技有限公司),隨機分為 4組,每組10只,分別為對照組(CON)、熱應激組(HTRA0)、5 mg·kg-1維甲酸處理組(HTRA5)和10 mg·kg-1維甲酸處理組(HTRA10)。試驗期間各組均飼喂基礎飼糧,于清潔級動物房(溫度25 ℃,相對濕度55%～60%)適應性飼養1周后開始正式試驗。維甲酸處理組(HTRA5組和HTRA10組)熱應激前分別灌胃ATRA(純度≥99%,購自上海源葉有限公司,ATRA溶于少量二甲基亞礬并用玉米油稀釋)5 mg·kg-1·d-1和 10 mg·kg-1·d-1,CON組和HTRA0組灌胃等體積玉米油(購自上海源葉有限公司,加入相應體積的二甲基亞礬),連續灌胃7 d。對照組置于25 ℃環境中,其余3組每天灌胃后,置于42 ℃環境中2 h給予全身熱應激。在前期研究中對小鼠連續熱暴露12 d(每天2 h),于第1、2、4、8、12天熱暴露前后檢測小鼠的直腸溫度,均發現小鼠體溫發生顯著變化[16],且不同檢測時間結果一致。說明熱應激第7 天前后小鼠的體溫可以代表小鼠體溫的變化情況,同時為了減少多次直腸溫度測定給小鼠帶來的應激,因此本試驗選擇第 7天,即最后一次高溫處理前后的溫度作為小鼠體溫變化的指標。

1.2 樣品采集

研究表明,熱應激對精子生成的影響會延續到熱應激結束后的一段時間[16],其中熱應激結束時是組織細胞中基因表達等各項指標變異的關鍵時間節點,一旦在這個時間點發生變化將會直接影響睪丸生精微環境,進而引起后續精子生成改變。因此,在本試驗中,在第7天熱應激結束后稱重并處死小鼠,采集小鼠睪丸和附睪,并將左側睪丸和附睪置于4%多聚甲醛中固定,右側睪丸置于凍存管內,液氮迅速冷凍后置于-80 ℃低溫冰柜儲存備用,右側附睪用于精子的采集。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 睪丸指數、附睪指數和睪丸直徑分離睪丸和附睪組織,剔除多余脂肪,稱重。用游標卡尺測定 2個睪丸的長軸長度和短軸長度,2個長軸中較大者設為最大直徑,2個短軸中較短者為最小直徑。睪丸指數和附睪指數的計算公式如下：睪丸指數=睪丸重(g)/體重(g)×100%,附睪指數=附睪重(g)/體重(g)×100%。

1.3.2 精子活力在1.5 mL EP管中加入1 mL PBS預熱,將分離出的一側附睪在含有預熱的PBS玻璃培養皿中除去多余的脂肪,剪去附睪頭,將附睪尾置于EP管中,用眼科剪充分剪碎,于37 ℃、5% CO2條件下孵育30 min,使精子充分游出,獲得精子懸液。將載玻片和蓋玻片置于37 ℃載物臺上預熱,用微量移液槍取10 μL精子懸液,滴于載玻片上,加蓋蓋玻片,立即在顯微鏡下觀察精子,利用計算機輔助精子分析(computer-aided sperm analysis,CASA)(NatureGene,美國)檢測精子密度,并分析精子活力。

1.3.3 睪丸組織抗氧化性能稱取60 mg左右睪丸組織,加入適量生理鹽水制備組織勻漿,離心取上清液測定相關指標。丙二醛(MDA)含量采用TBA法測定,總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性采用羥胺法測定,過氧化氫酶(CAT)活性采用鉬酸銨法測定,谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性采用比色法測定,總抗氧化能力(T-AOC)采用FRAP法測定,試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3.4 睪丸和附睪組織形態學觀察取固定于多聚甲醛中的睪丸和附睪組織,經脫水、透明、透蠟等處理后進行包埋,切取5 μm厚度切片,進行HE染色,中性樹脂封片后用顯微鏡觀察并拍照,根據Shen等[17]方法使用ImageJ軟件測定生精小管的橫截面積、直徑和上皮厚度。

1.3.5 附睪精子形態學觀察和精子畸形率統計取1.3.2節中獲得的精子懸液10 μL,在載玻片上涂片,自然風干,用甲醇固定10 min,干燥后用伊紅染液染色30 s,用流水輕輕沖洗,風干后用中性樹脂封片,顯微鏡下觀察并拍照?；温实挠嬎愎剑壕踊温?畸形精子數/精子總數×100%。

1.3.6 睪丸組織RNA提取和Real-time PCR采用Trizol試劑(諾唯贊生物科技有限公司)從睪丸組織勻漿中提取總RNA,使用分光光度法(NaoDrop 2000)測定RNA濃度及純度,將RNA濃度調至500 ng·μL-1后使用試劑盒將RNA反轉錄為cDNA,采用熒光定量PCR試劑盒(北京擎科新葉生物技術股份有限公司)進行熒光定量PCR。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR所用引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR

1.4 數據處理與統計分析

試驗數據使用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA),用Duncan’] s檢驗進行差異顯著性分析。試驗結果均以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 熱應激前后小鼠直腸溫度變化

如表2所示,熱應激前4個組小鼠直腸溫度之間沒有顯著差異,熱應激后3個熱應激組的直腸溫度與CON組相比均顯著升高(P<0.05);除CON組外的3個組熱應激后的直腸溫度與處理前相比也都顯著升高(P<0.05),說明本試驗中熱應激能使小鼠直腸溫度顯著升高。

表2 最后一次熱應激前后小鼠直腸溫度Table 2 Rectal temperature before and after the last heat stress

2.2 熱應激前后睪丸重、睪丸指數和睪丸直徑變化

如表3所示,HTRA0組小鼠的睪丸重與CON組相比顯著降低(P<0.05),維甲酸處理后得到提高,其中HTRA10組與CON組相比無顯著差異。睪丸指數與睪丸重也是相同的趨勢,但是組間差異不顯著。不同組之間睪丸最大直徑沒有顯著差異,但與CON組相比,HTRA0組睪丸最小直徑顯著降低(P<0.05);與HTRA0組相比,HTRA10組小鼠睪丸最小直徑增加,且與CON組相比沒有顯著差異。

表3 維甲酸對熱應激小鼠睪丸重、指數和直徑的影響Table 3 Effects of retinoic acid on testicular weight,index and diameter in heat-stressed mice

2.3 熱應激前后睪丸組織形態變化

如圖1所示,CON組小鼠睪丸組織生精小管形態正常,各級生精細胞排列整齊,管腔內可見成熟精子。HTRA0組小鼠睪丸生精小管各級生精細胞數量減少,排列紊亂,管腔變大,管腔內成熟精子數量明顯減少。維甲酸處理組有所改善,形態更接近CON組小鼠。

圖1 維甲酸對熱應激小鼠睪丸組織形態的影響Fig.1 Effect of retinoic acid on testicular morphology in heat-stressed mice A. 小鼠睪丸組織HE染色(紅色箭頭指示睪丸間質細胞,藍色箭頭指示生精小管管腔,黃色線段指示生精上皮);B、C、D. 生精小管橫截面積、直徑和上皮厚度。A. HE stained of mouse testicular tissue(red arrows indicate testicular interstitial cells,blue arrows indicate the lumen of spermatogenic tubules,and yellow lines indicate spermatogenic epithelium);B,C,D. Cross setional area,diameter,and height of mouse seminiferous tubule.

對睪丸組織變化進一步量化發現,與CON組相比,HTRA0組小鼠睪丸生精小管的橫截面積、直徑和生精小管上皮厚度都顯著降低(P<0.05);與HTRA0組相比,HTRA5組和HTRA10組小鼠睪丸生精小管橫截面積、直徑和生精小管上皮厚度顯著增加(P<0.05),更接近CON組,其中生精小管直徑和CON組相比無顯著差異。

2.4 熱應激前后附睪組織形態、附睪精子密度和畸形率變化

由圖2可知,與CON組相比,HTRA5組和HTRA10組小鼠附睪重顯著降低(P<0.05),但是不同組之間附睪指數無顯著差異。CON組小鼠附睪管腔內可見大量成熟精子,HTRA0組管腔內精子減少,維甲酸處理后有所改善,更接近CON組。對附睪精子密度統計發現,維甲酸和熱應激對小鼠附睪精子密度沒有產生顯著影響,但與CON組相比,HTRA0組密度略低,維甲酸處理后有升高的趨勢。對小鼠附睪精子進一步分析發現,與CON組相比,HTRA0組小鼠附睪精子畸形率顯著升高(P<0.05);與HTRA0組相比,HTRA5組和HTRA10組小鼠附睪精子畸形率顯著降低(P<0.05)。

圖2 維甲酸對熱應激小鼠附睪、附睪精子密度和畸形率的影響Fig.2 Effects of retinoic acid on epididymal,epididymal sperm density and malformation rate in heat-stressed mice A.小鼠附睪組織HE染色(黑色箭頭指示附睪管腔內的精子);B. 附睪精子伊紅染色(紅色箭頭指示精子頭部,藍色箭頭指示精子尾部,方框表示局部放大);C—F. 附睪重、附睪指數、精子密度和精子畸形率。A. HE stained of mouse epididymal tissue(black arrows indicate sperm in the epididymal lumen);B. Eosin stained of mouse epididymal sperm(red arrows indicate the head of the sperm,blue arrows indicate the tail of the sperm,box represents local magnification);C-F. Weight,index of epididymis,density and malformation rate of sperm.

2.5 熱應激前后附睪精子活力變化

如圖3所示,與CON組相比,HTRA0組小鼠精子的總活力顯著降低(P<0.05),前進運動、快速運動精子比例顯著下降(P<0.05),不運動比例顯著增加(P<0.05)。維甲酸處理后得到改善,其中HTRA10組小鼠精子的總活力、前進運動、快速運動及不運動精子的比例與CON組相比都沒有顯著差異。

圖3 維甲酸對熱應激小鼠附睪精子活力的影響Fig.3 Effect of retinoic acid on epididymal sperm motility in heat-stressed mice

2.6 熱應激前后睪丸抗氧化性能變化

如表4所示,與CON組相比,HTRA0組小鼠睪丸MDA含量顯著升高(P<0.05),T-SOD活性顯著降低(P<0.05);與HTRA0組小鼠相比,HTRA5組和HTRA10組小鼠睪丸MDA含量顯著降低(P<0.05),T-SOD活性顯著升高(P<0.05),與CON相比無顯著差異。不同組間T-AOC和CAT活性、GSH-PX活性無顯著差異。

表4 維甲酸對熱應激小鼠睪丸抗氧化性能指標的影響Table 4 Effect of retinoic acid on the antioxidant activity in the testes of heat-stressed mice

2.7 熱應激前后睪丸抗氧化相關基因表達差異

如圖4所示,與CON組相比,HTRA0組小鼠睪丸nrf2、ho-1、nqo1、sod1和gpx1 mRNA相對表達量都顯著升高(P<0.05)。與HTRA0組相比,HTRA5組和HTRA10組小鼠睪丸nrf2、ho-1、gclc、sod1和gpx1表達量均無顯著差異,但HTRA10組小鼠睪丸ho-1、gclc和sod1表達量有降低趨勢,且gclc和sod1與CON組相比均無顯著差異。HTRA10組小鼠睪丸nqo1基因表達量顯著低于HTRA0組(P<0.05),且與CON組無顯著差異。

圖4 維甲酸對熱應激小鼠睪丸抗氧化 相關基因表達的影響Fig.4 Effect of retinoic acid on the expression of antioxidant-related genes in the testes of heat-stressed mice

2.8 熱應激前后睪丸增殖和凋亡相關基因表達差異

如圖5所示,與CON組相比,HTRA0組bax基因相對表達量顯著升高(P<0.05),bcl-2表達量升高,但差異不顯著;與HTRA0組相比,HTRA10組bax基因相對表達量顯著降低(P<0.05),與CON組差異不顯著,HTRA10組bcl-2與HTRA0組相比顯著降低(P<0.05)且與CON組差異不顯著。不同組別之間bax與bcl-2基因表達量比值差異不顯著。

圖5 維甲酸對熱應激小鼠睪丸增殖凋亡 相關基因表達的影響Fig.5 Effect of retinoic acid on the expression of genes related to proliferation and apoptosis in the testes of heat-stressed mice

2.9 熱應激前后睪丸血睪屏障相關基因表達差異

如圖6所示,與CON組相比,HTRA0組小鼠睪丸occludin、zo-1、n-cadherin和connexin43 mRNA表達量顯著升高(P<0.05)。與HTRA0組相比,HTRA5組小鼠睪丸occludin、zo-1、n-cadherin和connexin43 mRNA表達量無顯著差異,HTRA10組小鼠睪丸zo-1、n-cadherinmRNA表達量顯著降低(P<0.05)。HTRA10組小鼠睪丸zo-1、n-cadherin和connexin43 mRNA表達量與CON組相比無顯著差異。

圖6 維甲酸對熱應激小鼠睪丸血睪屏障 相關基因表達的影響Fig.6 Effect of retinoic acid on the expression of genes related to the blood-testis barrier in the testes of heat-stressed mice

2.10 熱應激前后睪丸精子發生相關基因表達差異

如圖7所示,與CON組相比,HTRA0組小鼠睪丸plzf和c-kitmRNA表達量都顯著升高(P<0.05)。與HTRA0組相比,HTRA5組和HTRA10組小鼠睪丸plzf和c-kitmRNA表達量顯著降低(P<0.05),且c-kit與對照組相比無顯著差異。不同組間stra8和sycp3基因的表達量無顯著差異。

圖7 維甲酸對熱應激小鼠睪丸精子發生 相關基因表達的影響Fig.7 Effect of retinoic acid on the expression of genes related to spermatogenesis in the testes of heat-stressed mice

3 討論

3.1 維甲酸對熱應激小鼠睪丸重、直徑及組織形態的影響

當動物所處的溫度超過其生理范圍和調節能力時,就會發生熱應激;盡管熱應激通常會影響機體的各種功能,但生殖是最容易受到熱應激損害的過程[16]。Lin等[18]研究表明,將雄性小鼠身體的后三分之一給予43 ℃水浴熱處理15 min后,小鼠睪丸指數顯著降低,生精小管損傷嚴重,變性、空泡化嚴重,管腔變大,生精細胞脫落萎縮,睪丸形態異常。劉慧娟等[19]給予小鼠全身熱應激后,小鼠睪丸生精小管的橫截面積和生精小管直徑顯著降低。本試驗結果也表明熱應激使小鼠睪丸組織受到損傷。Zhou等[20]試驗中腹腔注射維甲酸能顯著提高隱睪小鼠的睪丸重和睪丸體積,改善隱睪小鼠睪丸組織形態,提高小鼠附睪精子密度、降低精子畸形率。本試驗結果提示維甲酸能改善熱應激小鼠睪丸形態,這可能與維甲酸能緩解氧化應激,改善生精微環境有關[15,18,21]。

3.2 維甲酸對熱應激小鼠附睪和附睪精子的影響

生精細胞對溫度變化極為敏感,對溫度有嚴格的要求,其中睪丸溫度調節發揮著非常重要的作用。盡管是在小范圍內的陰囊溫度升高,也可能會對精子質量產生負面影響[22]。Yaeram等[5]試驗結果表明,將雄性小鼠連續2 d全身暴露在36 ℃的溫度下12 h后,精子數量減少,睪丸重降低,精子在體內的受精能力較差,附睪精子與透明帶的結合能力和卵細胞穿透能力降低。在另一項研究中,將小鼠連續3 d全身暴露于高溫8 h后其附睪尾部精子數量無顯著變化,但活力較低,此外這些附睪精子還表現出膜性變化,使其更容易發生凋亡[23]。與之相似,本試驗發現,連續7 d給予小鼠全身42 ℃熱處理2 h后精子密度沒有顯著變化,但是精子活力顯著下降,運動性能顯著降低。彭金普[24]通過給隱睪大鼠注射維甲酸發現,維甲酸顯著提高了隱睪大鼠的附睪精子數量,降低附睪精子畸形率,提高隱睪大鼠的生殖功能,可能是因為維甲酸與精子的形成與釋放有關。本試驗結果也表明維甲酸可改善熱應激小鼠精子活力。

3.3 維甲酸對熱應激小鼠睪丸抗氧化功能的影響

一般來說,熱應激導致的生精細胞凋亡和精子活力下降是由氧化應激和細胞凋亡引起的[25-26]。Lin等[18]研究結果表明,給予小鼠睪丸43 ℃熱應激15 min后,睪丸MDA含量顯著升高,睪丸中SOD活性顯著降低。本研究結果與之一致,表明熱應激組小鼠睪丸組織的抗氧化系統已經受到損害。睪丸組織中過多的氧自由基導致了睪丸生精細胞的發育改變和精子生長遲緩。維甲酸具有很強的抗氧化活性和抗氧化作用[15,27]。本試驗中兩種劑量的維甲酸都能顯著提高小鼠睪丸組織的SOD活性,降低熱應激所造成的MDA水平升高。這表明維甲酸能有效地清除氧自由基,抑制脂質過氧化反應,減輕熱處理對生精細胞的損傷。且在2個劑量的處理中,10 mg·kg-1的處理效果更好。

Nrf2作為主要的內源性抗氧化防御系統,在防止睪丸氧化損傷方面起著至關重要的作用。在親電或氧化應激時,Nrf2被激活并轉錄誘導一系列抗氧化防御酶,例如CAT、NQO1、HO-1和谷胱甘肽S-轉移酶等[28]。這些依賴Nrf2的抗氧化劑的上調能促進機體的抗氧化、解毒和抗炎反應。本研究結果表明熱應激激活了小鼠睪丸組織的Nrf2通路,啟動下游基因的轉錄,增加睪丸抗氧化能力,減少氧化損傷。與Li等[16]研究中給予小鼠全身熱應激(42 ℃,2 h,12 d)后小鼠睪丸nrf2、gclc、ho-1和nqo1 mRNA表達上調結果一致。灌胃維甲酸后,這些基因表達下調,更接近對照組水平,推測維甲酸能夠緩解睪丸組織的氧化應激水平,增強睪丸組織的抗氧化能力,保護睪丸組織免受熱應激帶來的氧化應激損傷。

3.4 維甲酸對熱應激小鼠睪丸增殖凋亡基因表達的影響

細胞凋亡的過程需要許多不同的細胞蛋白,例如Bcl-2家族成員。Bcl-2蛋白家族包含促凋亡Bax和抗凋亡Bcl-2成員。Xi等[29]結果表明,給予成年公豬局部睪丸加熱(42 ℃,1 h)后bax和bcl-2的mRNA和蛋白水平升高,導致生精細胞凋亡增加。與之相似,本試驗中給予小鼠全身熱處理7 d后小鼠睪丸組織中bax基因表達量顯著升高,灌胃10 mg·kg-1維甲酸能顯著降低熱應激小鼠bax和bcl-2 mRNA表達量,說明維甲酸對熱應激導致的小鼠睪丸組織細胞凋亡有改善作用。

3.5 維甲酸對熱應激小鼠睪丸血睪屏障基因表達的影響

由幾種類型的細胞連接形成的BTB可以維持精子生成[30]。BTB通過在生精小管的支持細胞之間形成選擇性屏障,將睪丸與循環系統隔離,并維持適宜的生精微環境,能夠使精子持續產生[31]。維持緊密連接功能所必需的蛋白質包括Occludin、Zonula occludens(ZO-1)和N-cadherin。Connexin 43是一種縫隙連接標志物,是正常睪丸發育和精子形成所必需的,并具有調節BTB形成的功能。胡素琴等[32]研究表明,給予大鼠43 ℃恒溫水浴20 min后,大鼠睪丸中ZO-1、Occludin蛋白表達顯著降低,睪丸屏障受損。因此在本研究中對編碼這些關鍵蛋白質的基因表達進行了評估。本試驗結果顯示,熱處理后小鼠睪丸組織中occludin、zo-1、n-cadherin和connexin43 mRNA的表達量顯著升高。這種結果產生的原因可能是長時間的熱處理導致血睪屏障受到損傷,所以需要更多地表達來對這種損傷進行緊急補救。而添加維甲酸后這些基因表達量較熱應激組相比降低,其中10 mg·kg-1維甲酸組顯著降低且與對照組相比沒有顯著差異,提示維甲酸可能通過維持緊密連接和縫隙連接蛋白的功能來調節BTB的完整性,改善生精微環境,進而改善精子活力。

3.6 維甲酸對熱應激小鼠睪丸精子發生基因表達的影響

精子發生是一個復雜的動態變化過程,包括精原細胞增殖分化、減數分裂和精子形成三個階段。在這個過程中,不同時間段受到不同因子的調控[4]。其中C-kit、PLZF對生精細胞的增殖分化不可或缺,Stra8、Sycp3與減數分裂密切相關,是減數分裂標志。C-kit表達于分化的精原細胞,可以作為精原細胞分化的標志物,表明了精原細胞分化程度[33];PLZF作為一種精原細胞特異性轉錄因子,可能在調節干細胞的自我更新和維持分化過程中發揮核心作用[34],是精原細胞和精母細胞增殖相關的重要生物標志物。彭金普[24]研究表明,維甲酸能上調隱睪大鼠生精細胞增殖分化及減數分裂相關蛋白和基因的表達,提示維甲酸能促進隱睪大鼠的生精細胞增殖分化和減數分裂。在本試驗中,熱應激后小鼠睪丸內c-kitmRNA表達上調,而維甲酸處理后其表達下調接近對照組小鼠睪丸,可能是熱應激導致精母細胞分化受阻,而維甲酸維持了精原細胞分化。熱應激組小鼠睪丸plzf基因表達水平的增加也表明熱應激組小鼠睪丸精原細胞和精母細胞的增殖出現異常,維甲酸處理后表達下調,說明維甲酸可能對熱應激小鼠精原細胞的分化和增殖產生積極影響,以維持正常精子發生過程。

綜上所述,本試驗采用小鼠全身熱應激模型測定了維甲酸對熱應激小鼠睪丸組織損傷的影響,結果表明：維甲酸能夠改善熱應激小鼠的睪丸重、睪丸組織形態和附睪精子活力,使之更接近對照組水平;這種保護作用可能是通過增加小鼠睪丸抗氧化能力,減少生精細胞凋亡,增強血睪屏障,改善生精微環境,維持精子發生實現的。在本試驗中,10 mg·kg-1的維甲酸處理效果更好。