“粉玉1號”草莓莖尖組織培養體系及其脫毒效果研究

余 紅,肖文斐,錢麗華,柳愛春,來文國,汪建榮,李曉媛

(杭州市農業科學研究院,杭州,310024)

草莓(Fragaria×ananassa)為薔薇科草莓屬多年生草本植物,素有“水果皇后”的美稱[1]。草莓生產上多以匍匐莖進行無性繁殖,但長期種植匍匐莖苗會引起大量病毒積累。已知感染草莓的病毒有24種,其中草莓皺縮病毒(strawberry crinkle virus,SCV)、草莓斑駁病毒(strawberry mottle virus,SMoV)、草莓輕型黃邊病毒(strawberry mild yellow edge virus ,SMYEV)、草莓鑲脈病毒(strawberry vein banding virus,SVBV)造成的危害較重,嚴重影響草莓產量和品質[2]。目前,對于草莓病毒病尚無有效的治療方法。根據病毒在受侵染植物體內分布不均勻,頂端分生組織一般無病毒或只攜有濃度很低病毒的原理,Morel和Martin(1952)最早通過莖尖培養獲得了大麗花無病毒植株,隨后莖尖培養脫毒技術在馬鈴薯、康乃馨等多種經濟植物上得到廣泛應用[3]。已有報道表明,通過莖尖組織培養脫毒苗是解決草莓病毒積累的有效途徑[4-10],而利用RT-PCR技術可對草莓病毒侵染情況進行檢測[11-14]?！胺塾?號”是由杭州市農業科學研究院通過雜交育種(香野為母本,2012-W-02為父本)方式選育的早熟抗病粉果草莓新品種,其果實香甜可口、品質極佳,且豐產抗病,綜合性狀優,具有廣闊的發展前景。本研究以“粉玉1號”草莓莖尖為材料,通過對消毒、誘導、繼代、生根等培養條件進行探索,篩選適宜的培養基配方及馴化移栽方法,并利用RT-PCR技術對試管苗進行草莓常見病毒檢測,建立“粉玉1號”莖尖培養體系,為該品種草莓工廠化育苗及產業化推廣提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

2022年5月從杭州市農業科學研究院之江基地大棚栽培“粉玉1號”草莓植株上采集匍匐莖芽。

1.2 外植體消毒

將匍匐莖芽用洗潔精液浸泡1 min,清水沖冼3次,然后在超凈工作臺上進行消毒。把清洗過的匍匐莖芽用75%乙醇浸泡30 s,再用0.1%升汞溶液浸泡10 min,最后用無菌水沖洗4次。

1.3 莖尖剝取及接種

在超凈工作臺上,使用Nikon SMZ800雙筒解剖鏡,用尖頭鑷子剝取莖尖。對剝取莖尖進行記錄,并觀察莖尖形態。莖尖剝出后用解剖手術刀片切下大小0.3～0.5 mm的莖尖,莖尖朝上接入初代培養基。

1.4 莖尖初代培養

莖尖初代培養基以MS為基本培養基,分別添加不同濃度(0.1、0.2、0.5 mg/L) 6-芐基腺嘌呤(6-BA),并添加5.5 g/L瓊脂粉和30 g/L蔗糖,pH值調至5.8。各處理每重復接種30個莖尖,重復3次。培養溫度為23 ℃,每天14 h光照,光照強度為2 500 lx。培養40 d后統計莖尖存活率和莖尖萌發率。

1.5 叢生芽繼代培養

莖尖在初代培養基中培養40 d后(長出多片幼葉),轉入繼代培養基。繼代培養基配方為MS+0.1 mg/L 6-BA+5.5 g/L瓊脂粉+30 g/L蔗糖,pH值調至5.8。培養條件同初代培養。

1.6 生根培養及移栽煉苗

莖尖培養形成的叢生芽在繼代培養基上培養3～4代后,轉入生根培養基。生根培養基配方為1/2MS+不同濃度(0、0.10、0.20 mg/L)萘乙酸(NAA)+5.5 g/L瓊脂粉+30 g/L蔗糖,pH值調至5.8。各處理每重復接種30個莖尖,重復3次。生根培養20 d后,在室內光照明亮處開蓋煉苗3 d,再從瓶中取出幼苗,洗凈根部培養基,然后種入盛有基質的穴盤中?；|配方為珍珠巖∶泥炭∶蛭石=1∶1∶1(體積比)。移栽第1周內加蓋塑料薄膜保濕。

1.7 常見病毒檢測

1.7.1 引物設計 根據GenBank數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中草莓皺縮病毒(SCV,AY005146.1)、草莓斑駁病毒(SMoV,AJ311875)、草莓輕型黃邊病毒(SMYEV,D12517)、草莓鑲嵌病毒(SVBV,NC001725)的基因組序列設計特異性引物,并以草莓肌動蛋白基因Actin(AB116565)作為內參(見表1)。

表1 4種草莓病毒及肌動蛋白的特異性引物

1.7.2 總RNA或總DNA制備 SCV、SMoV和SMYEV為RNA病毒,需利用反轉錄·聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)進行檢測,即提取總RNA進行逆轉錄后再進行擴增。對DNA病毒SVBV,則可直接用總DNA為模板進行PCR擴增。

取“粉玉1號”莖尖培養試管苗及大棚栽培苗(杭州市農業科學研究院之江基地,外植體取材群體)嫩葉,轉移至預冷的研缽中,加液氮迅速研磨成粉末。參照文獻[15],采用改進CTAB法提取總DNA。根據AxyPrep總RNA小量制備試劑盒(美國Axygen)說明書進行操作,提取總RNA。取1 μL總DNA或RNA樣品,用紫外分光光度檢測其純度和濃度。另取1 μg用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量。檢測合格的樣品保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.7.3 RNA逆轉錄合成cDNA 試驗步驟根據TransScript? First-Strand cDNA Synthesis SuperMix逆轉錄試劑盒說明書(北京全式金)并進行優化。反應體系組分:Total RNA 5 μL、Anchord oligo(dT)18 (0.5 μg/μL) 0.5μL、Random Primer (N9)(0.1 μg/μL) 0.5 μL、2×TS Reaction Mix 10 μL、TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL、RNase-free Water 3 μL。用置于冰上的200 μL PCR管盛裝反應組分,先將RNA模板、引物與RNase-free Water混勻,65 ℃孵育5 min后,立刻冰浴2 min,然后再加其他反應組分,輕輕混勻后,25 ℃ 孵育10 min,42 ℃孵育30 min,然后85 ℃加熱10 s失活TransScript RT/RI Enzyme,反應結束后將產物放入-20 ℃保存備用。

1.7.4 PCR檢測 將反轉錄產物cDNA作為PCR擴增模板,每一樣品同時進行SCV、SMoV、SMYEV、Actin擴增,而SVBV擴增則直接以總DNA為模板。反應體系為10 μL,其組分分別為模板 1 μL、Primer F 0.5 μL;Primer R 0.5 μL;2×Trans HiFi Mix 5 μL;ddH2O 3 μL。PCR反應條件:94 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s,58或62 ℃(因引物Tm而異,SCV、SVBV和Actin PCR擴增退火溫度為58 ℃,SMoV和SMYEV為62 ℃)退火30 s,72 ℃延伸30 s,循環30次;72 ℃延伸10 min。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 莖尖剝取

完整匍匐莖芽見圖1-A。剝去1片嫩葉和1片幼葉的芽見圖1-B,嫩葉指最外層已轉綠的葉,幼葉指被嫩葉包裹尚未轉綠的葉。剝去7片幼葉后,直至露出光滑、半透明狀的莖尖(見圖1C至圖1I)。

注:A為匍匐莖芽;B為剝去1片嫩葉和1片幼葉,側芽與頂芽分開,左側為側芽,右側為頂芽; C為剝去1片嫩葉、1片幼葉及側芽;D為剝去1片嫩葉、2片幼葉;E為剝去1片嫩葉、3片幼葉;F為剝去1片嫩葉、4片幼葉;G為剝去1片嫩葉、5片幼葉;H為剝去1片嫩葉、6片幼葉;I為剝去1片嫩葉、7片幼葉,露出莖尖(箭頭所示)。

2.2 莖尖初代培養

接種的莖尖培養14 d后,莖尖膨大,長出1片幼葉。培養21 d后,莖尖長出2片幼葉。培養26 d后,莖尖長出2片幼葉,其中1片幼葉展開。培養40 d,莖尖長出多片幼葉(見圖2)。

圖2 草莓‘粉玉1號’莖尖培養過程的形態變化

由表2可見,6-BA對莖尖存活和萌發有較大影響,在0.1～0.5 mg/L濃度范圍內,莖尖存活率和萌發率隨著6-BA濃度增加而提高。即從莖尖存活率和萌發率來看,都是添加0.5 mg/L 6-BA時最高(見表2)。因此,初代培養時宜添加0.5 mg/L 6-BA。

表2 6-BA濃度對“粉玉1號”草莓莖尖存活及萌發的影響

2.4 繼代培養

繼代培養時,為了減少變異,將6-BA濃度降低至0.1 mg/L。試驗結果顯示,將長出多片幼葉的莖尖轉入繼代培養基,繼代培養15 d形成叢生芽(見圖2),叢芽生長健壯,無玻璃化現象,平均繁殖系數為2.6。

2.5 生根培養與移栽練苗

表3顯示,在含有不同濃度NAA的生根培養基中,“粉玉1號”試管苗的生根率均為100%。其中,NAA濃度為0及0.10 mg/L的根數與根長均無顯著差異,當濃度提高到0.20 mg/L時根數與根長均顯著下降,根生長受到抑制。因此,生根培養宜不添加NAA。不加NAA生根培養的幼苗,移栽30 d后成活率達90%以上(見圖3)。

圖3 “粉玉1號”草莓莖尖培養形成的生根苗及練苗移栽后生長情況

表3 不同NAA濃度對“粉玉1號”生根的影響

2.6 常見草莓病毒PCR檢測

利用PCR方法,對莖尖培養苗和其對應的取樣植株進行病毒檢測。由圖4可見,莖尖培養苗樣品均未檢測到SCV、SMoV、SMYEV和SVBV;有1份田間大棚植株樣品檢測出SVBV病毒。

注:M:DL2000 Plus DNA Marker。+:陽性株對照;-:陰性株對照;1-4:莖尖培養苗樣品;5-8:取樣植株樣品;0:不加模板對照。

3 討論

在草莓莖尖培養中,剝取莖尖是一個非常細致、繁鎖的工作,稍不小心就會破壞莖尖。在本研究中觀察發現,草莓匍匐莖芽一般需剝去1片嫩葉和7片幼葉才能剝出莖尖,莖尖在初代培養14 d后開始膨大,培養40 d后可長出多片幼葉。

利用草莓莖尖組培生產脫毒種苗,是草莓良種繁育體系中主要的組成部分,在草莓產業中有著重要的地位[16]。然而,草莓組培由于增殖系數過大、繼代次數過多等因素,“叢生苗”“花而不實”“畸形果增多”等不良變異時有發生,嚴重影響了組培苗在生產中的應用[17]。降低植物生長調節劑總體用量,控制增殖系數是解決草莓組培變異的有效途徑之一[18]。本試驗發現,在初代誘導培養基中添加0.5 mg/L 6-BA,比低濃度更有利于“粉玉1號”莖尖存活及萌發。在繼代培養基中將6-BA添加量降至0.1 mg/L,叢生芽生長健壯且無玻璃化。說明,較低濃度的6-BA已經可以滿足“粉玉1號”組培苗的增殖。在生根培養過程中發現,“粉玉1號“試管苗生根非常容易,在不加植物生長調節調劑的培養基中生根率高,根系生長快,且狀態好。為減少組培苗生產不良變異,推薦“粉玉1號”莖尖初代培養基采用MS + 0.5 mg/L 6-BA,繼代培養基采用MS + 0.1 mg/L 6-BA,生根培養基采用不加植物生長調節劑的1/2 MS。

通過檢測“粉玉1號”大棚栽培苗及莖尖培養苗的病毒感染情況發現,在大棚栽培苗(外植體取材群體)中存在草莓鑲脈病毒(SVBV)感染,通過莖尖組培可以脫除該病毒。草莓皺縮病毒(SCV)、草莓斑駁病毒(SMoV)和草莓輕型黃邊病毒(SMYEV)在本試驗所有樣品中均未檢出,莖尖培養脫除效果這3種病毒的效果還有待進一步驗證。