腎虛三證大鼠模型子宮血管構筑的比較研究*

蘇先芝,陸 華,黎欣韻,強玲俠,楊 茜

(1. 成都中醫藥大學附屬醫院,成都 610015;2. 成都中醫藥大學,成都 610015;3.電子科技大學醫學院附屬婦女兒童醫院·成都市婦女兒童中心醫院,成都 611731)

近年來,受生活節奏加快、自然環境污染等多種因素影響[1],不孕不育的發生率呈現快速上升趨勢[2]。中醫認為,腎藏精,主生殖,為先天之本、生殖之源。腎充則天癸至,任通沖盛,可以孕育子嗣;反之,腎虛則胞宮難以攝精成孕而發為不孕癥。腎藏精,化為陰陽,腎虛證臨床以腎陽虧虛、腎陰虧虛和腎精不足為主。研究腎虛證型對生殖器官的影響有助于解決女性不孕問題。同時,合適的動物模型及對動物模型的準確認識對研究中醫腎虛證候及治療機制具有重要意義。子宮血管與女性生育能力關系密切,子宮內膜血管化意味著有足夠的子宮內膜容受性,而子宮內膜和子宮內膜下血流不足與妊娠率的顯著下降有關[3]。因此,本文針對目前常用的三種腎虛造模方法:反復超促排致腎精虧虛法、甲狀腺素聯合利血平灌胃致腎陰虧虛法、4 ℃羥基脲灌胃致腎陽虧虛法進行對比性研究,觀察腎虛諸證對雌性大鼠子宮血管灌注的影響,為臨床和實驗研究提供參考。本研究已通過成都中醫藥大學附屬醫院實驗動物倫理委員會審查,批件編號:2021DL-002。

1 材料

1.1 動物

50只SPF級雌性SD大鼠,6～8周齡,體質量180～220 g,購于成都達碩實驗動物有限公司,動物許可證號:SCXK(川)2020-030。動物飼喂于成都中醫藥大學臨床醫學院實驗動物中心,環境通風良好,溫度20～24 ℃,相對濕度40%～79%,光照周期為12 h明/12 h暗,動物自由攝食攝水。

1.2 藥物

復方利血平片,批號:201066,國藥準字:H14023613,購自亞寶藥業集團股份有限公司;甲狀腺片,批號:200803,規格:40 mg,國藥準字:H37020075,購自山東省惠諾藥業有限公司;注射用絨促性素(human choionic gonadotophin,HCG),批號:201203,規格:2 000單位,國藥準字:H44020673,購自麗珠集團麗珠制藥廠;羥基脲片,批號:0E0413005,規格:0.5 g,國藥準字:H37021289,由齊魯制藥有限公司提供。

1.3 主要試劑

孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)購自北京索萊寶科技有限公司,貨號:20210329;大鼠血清促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)ELISA試劑盒(貨號:MM-70867R1)、抗謬勒管激素(follicle-stimulating hormone,AMH)ELISA試劑盒(貨號:MM-0575R11)、雌二醇(estrogen,E2)ELISA試劑盒(貨號:MM-0551R)、孕酮(progesterone,P)ELISA試劑盒(貨號:MM-0219R1),均購自江蘇酶免實業有限公司;硫酸鋇粉末購自德國Sachleben公司,貨號:7727-43-7;醫用明膠購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,貨號:9000-70-8。

1.4 主要儀器

Skyscan 1276 X射線顯微斷層成像儀,德國Bruker公司;95-1恒溫磁力攪拌器,上海安亭電子儀器廠;TH212智能數字測溫儀,北京鴻鷗成運儀器設備有限公司;RT-6100酶標分析儀,深圳雷杜生命科學股份有限公司。

2 方法

2.1 分組

大鼠適應性喂養后,每日早8:00起進行陰道脫落細胞學檢測,連續1周光鏡下觀察,篩選出有規律動情周期的健康雌性大鼠48只進入正式實驗。按隨機數字表法分為4組:對照組、腎精虧虛組、腎陰虛組、腎陽虛組,每組12只。

2.2 腎虛三證大鼠模型的建立與取材

干預當天設為0 d,對照組大鼠予2 mL 0.9 %氯化鈉溶液每日灌胃,連續21日;腎精虧虛組大鼠于0 d下午4時腹腔注射PMSG 40 IU/200 g,48 h后腹腔注射HCG 40 IU/200 g,間隔72 h重復1次,連續5次;腎陰虛組大鼠予甲狀腺片和利血平灌胃,每日灌胃劑量分別為150 mg/kg與0.25 mg/kg,連續21日;腎陽虛組大鼠予4 ℃羥基脲混懸液以350 mg/kg劑量灌胃,連續21日。第22日起各組停止造模及給藥,觀察15日。36 d起將處于動情后期的大鼠麻醉后取材并處死,無動情周期大鼠選擇非動情期取材。每組隨機選取4只進行血管灌注,備微計算機斷層掃描(microcomputed tomography,Micro-CT)檢測,剩余大鼠腹主動脈取血并處死,取大鼠子宮,0.9%氯化鈉溶液清洗后擦干、稱重,置于4%多聚甲醛中固定。

2.3 觀測指標

2.3.1 大鼠一般狀況觀察 觀察并記錄大鼠皮毛、活動情況、大小便和體質量等改變。自0 d起,每日晨8:00進行陰道脫落細胞涂片,觀察動情周期,每3日測量肛溫。

2.3.2 腎虛表征采集及檢測 每2周觀察并記錄1次宏觀表征,并根據《中醫臨床診療術語證候部分》[4],結合文獻擬定腎虛癥狀、體征量化評分表進行評分[5],見表 1。

表1 大鼠腎虛表征采集量表

2.3.3 大鼠血液指標檢測 血液標本離心后取上清液,嚴格按照試劑盒說明書操作,ELISA法測定血清FSH、AMH、E2、P水平。

2.3.4 子宮組織形態學觀察 稱重后將子宮分組浸入4%多聚甲醛中固定,常規石蠟切片與蘇木精-伊紅 ( hematoxylin-eosin staining, HE )法染色,光學顯微鏡下閱片,測量子宮內膜厚度、計數腺體數。

2.3.5 子宮血管灌注 參照文獻方法制備硫酸鋇-明膠混合對比劑[6]:將0.9 %氯化鈉溶液、硫酸鋇粉末、醫用明膠按照20∶5∶1混合,置于37 ℃恒溫磁力攪拌器中持續攪拌,直到約2 h后明膠完全溶解且均勻混合。大鼠麻醉后開腹,暴露腹主動脈,絲線結扎腹主動脈近心端,使用眼科剪由遠心端在血管壁上剪一“V”形小口,將動脈套管尖端緊貼血管壁置入腹主動脈內,均勻壓力灌注入37 ℃肝素溶液進行沖管,當血管內流動液體清亮,且推注過程無明顯阻力增加,即代表沖管成功。沖管成功后灌注37 ℃硫酸鋇-明膠混合對比劑,待子宮、腸壁血管完全呈白色后,即代表灌注成功,可停止操作。將灌注后的大鼠置于4 ℃冰箱中過夜,取子宮組織置于Micro-CT中,參數設定為球管電壓55 kV,球管電流200 μA,曝光517 ms,層厚為10 μm。在大鼠左側子宮距宮頸約1 cm處選取約1 cm3的興趣區(region of interest, ROI),計算ROI內血管體積/組織體積比、各直徑血管體積百分比、各級血管數和平均直徑。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 一般情況及腎虛表征評分

如表2所示,各組大鼠初始體質量差異無統計學意義(P>0.05),造模后(21 d)及造模結束后15 d(36 d),腎精虧虛組大鼠體質量較對照組顯著升高,腎陰虛組大鼠體質量顯著降低(P<0.01)。如圖1所示,造模期間,腎虛三證模型大鼠均出現動情周期逐漸紊亂,以腎精虧虛和腎陽虛組最為顯著。 3 d起腎陰虛組大鼠肛溫即出現顯著升高,此后持續走高至39 ℃,21 d后肛溫有所下降,但仍顯著高于對照組;6 d起腎陽虛組大鼠肛溫顯著下降,此后持續偏低,21 d后有所回升但仍較對照組低;腎精虧虛組大鼠肛溫與對照組比較差異未見統計學意義。造模后,腎精虧虛組大鼠攝食增多、反應遲鈍、毛發枯槁、皮肉松軟、缺乏彈性;腎陰虛組大鼠攝食減少、煩躁易怒、大便形小色黑,小便色黃赤,分散而臥,眼鼻、陰道出血;腎陽虛組大鼠攝食減少、毛發無光澤、弓背蜷縮、四肢及尾部發涼、耳部皮膚色蒼白。

注:▲為造模干預起始日,↑為造模結束日圖1 大鼠一般狀況比較

表2 各組大鼠體質量比較

3.2 血清ELISA檢測結果

如表3所示,與對照組比較,三模型組大鼠FSH顯著升高,E2、P、AMH值均顯著下降(P<0.05),與腎精虧虛組和腎陰虛組比較,腎陽虛組大鼠AMH值降低更顯著(P<0.05)。

表3 大鼠血清ELISA檢測結果比較

3.3 大鼠子宮組織形態學變化

如圖2所示,對照組大鼠子宮內膜組織內可見豐富血管,腺上皮細胞核大、圓,形態無異常,腺體數目多、腺腔大。腎精虧虛組大鼠子宮內膜變薄,肌層肌纖維排列紊亂;腎陰虛組大鼠子宮內膜排列紊亂,皺襞明顯增多,宮腔出血,子宮內膜腺體排列稀疏,固有層間質內存在炎性細胞浸潤;腎陽虛組大鼠子宮內膜薄,腺體減少。如表4所示,與對照組比較,腎精虧虛組與腎陽虛組大鼠子宮內膜厚度均明顯降低(P<0.05),子宮內膜腺體數顯著減少(P<0.01);腎陰虛組大鼠子宮內膜厚度與子宮內膜腺體數雖較對照組有所降低,但差異無統計學意義(P>0.05)。

A.對照組; B.腎精虧虛組; C.腎陰虛組; D.腎陽虛組圖2 各組大鼠子宮HE染色結果(×40)

表4 各組大鼠子宮內膜厚度與腺體數比較

3.4 大鼠子宮血管構筑結果

3.4.1 血管體積/組織體積比及各直徑血管體積百分比 各組大鼠子宮血管三維重建見圖3。如圖4所示,與對照組比較,腎虛三證模型組大鼠血管體積占比均下降(P<0.05),以腎陰虛組最為顯著(P<0.01);腎精虧虛組大鼠子宮組織<0.05 mm直徑血管體積百分比顯著下降(P<0.01);腎陰虛組大鼠<0.05 mm和0.05～0.10 mm直徑血管體積百分比升高(P<0.01),而>0.10 mm直徑血管體積百分比顯著下降(P<0.01);腎陽虛組大鼠<0.05 mm直徑血管體積百分比顯著升高(P<0.01),而>0.10 mm直徑血管體積百分比顯著下降(P<0.05)。

A.對照組; B.腎精虧虛組; C.腎陰虛組; D.腎陽虛組圖3 各組大鼠子宮血管三維重建圖

圖4 大鼠子宮血管體積/組織體積比及各直徑血管體積百分比(n=4)

圖5 大鼠子宮各級血管平均直徑(n=4)

3.4.2 各級血管平均直徑 如圖 5所示,與對照組比較,腎陰虛組大鼠一級、二級血管平均直徑減少(P<0.05);腎陽虛組大鼠各級血管平均直徑均減少(P<0.05);腎精虧虛組大鼠各級血管平均直徑差異均未見統計學意義(P>0.05)。

3.4.3 各級血管數 如圖6所示,與對照組比較,腎精虧虛組二、三、四級血管數均顯著減少(P<0.01);腎陰虛組二、三、四級血管數亦顯著減少(P<0.05);腎陽虛組各級血管數差異均未見統計學意義(P>0.05)。

圖6 大鼠子宮各級血管數(n=4)

4 討論

容受性高的子宮內膜是胚胎種植成功的必要條件之一,子宮內膜在雌孕激素的作用下發生一系列形態結構改變,包括內膜增厚、腺體增生、血液供應增加等,構成良好的著床微環境,胚泡才能夠順利著床[7]。證候是中醫藥理論體系的核心部分,能夠反映疾病過程中某一階段的病機,是對當前疾病狀態的總結[8]。腎虛在中醫學中被認為是不孕不育的常見原因,故中醫腎虛證候動物模型對研究中藥提高子宮內膜容受性的作用機制具有重要意義。腎主生殖,藏先后天之精,腎精化生腎氣,主一身之陰陽,為天癸之源,腎氣盛實方能攝納胚胎[9]。腎氣的強盛與否主要取決于兩方面:一是腎精素稟是否充盛,二是腎精內部陰陽是否協調平衡[10]。因此腎虛者通常表現為腎精、腎陰或腎陽的虛衰。建立不同類型的腎虛證動物模型,觀察其對生殖系統的影響,能夠解析不孕癥發生的生理病理機制并有助于預防和治療藥物的研發[11]。本文選取了目前應用較多也較具代表性的三種腎虛造模方法(反復超促排法[12]、甲狀腺素聯合利血平灌胃法[13]、冰羥基脲灌胃法[14]),以腎精虧虛、腎陰虛、腎陽虛證作為研究對象,觀察此腎虛三證對大鼠生殖及子宮血管構筑的影響。

“腎主藏精”是中醫藏象理論的重要內容之一,腎中所藏先天之精為腎主生殖的基礎?！熬础?腎精虛損必然導致血液化生不足。有研究認為,促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)可能是腎精的物質基礎[15],表明腎精虧虛很可能導致生殖相關血管及血供的改變。外源性激素誘導反復超促排卵廣泛用于輔助生殖技術,研究表明反復超促排卵會影響卵母細胞的質量[16]。本團隊前期采用PMSG聯合HCG反復超促排卵的方法成功構建了腎精虧虛型生育力低下的雌鼠模型[17]。本研究發現,腎精虧虛組大鼠腎虛證候評分顯著升高,90 %以上大鼠出現動情周期紊亂,FSH升高,AMH、E2、P顯著降低,子宮內膜厚度減小,腺體數減少,表明該造模法同時造成了子宮內膜容受性的改變。進一步發現腎精虧虛組大鼠子宮血管構筑也發生了變化,這種變化主要表現在血管占比減少和二、三、四級血管數量減少,而并未對各級血管直徑產生影響。

腎陰虛指因腎陰虧損、失于滋養、虛熱內生而表現出的證候[18],研究表明腎陰虛患者微血管數增多,可能為其原發病不良預后的原因之一[19]。甲狀腺素聯合利血平造?？赡M體溫升高、多汗等類似腎陰虛的現象[20],是目前腎陰虛證應用最廣的造模方法[21]。本研究中,腎陰虛組大鼠出現了煩躁易怒、消瘦、便干溲赤、陰道出血、肛溫升高等改變,同時大鼠出現動情周期紊亂,FSH升高,AMH、E2、P降低,子宮內膜組織形態學發生變化,表明該造模方法除引起腎陰虛表征證候改變外,還造成了雌鼠生殖系統的功能異常。本研究中腎陰虛組大鼠子宮一、二級大血管管徑減少、二級血管數量減少,微血管體積占比相對增大而數量減少,提示終末微血管管徑較正常增粗,子宮組織血供減少而毛細血管擴張,引起子宮出血。

腎中陽氣具有溫煦、推動、蒸騰、氣化的作用,“諸寒收引,皆屬于腎”(《素問·至真要大論篇》),若腎陽不足,陰寒內盛,筋脈收引而攣急,血絡凝滯不暢,則會引起血管收縮而使組織器官血供不足。羥基脲可抑制核苷酸的代謝與DNA的合成,模擬下丘腦-垂體-靶腺軸受抑制的病理狀態,使動物表現出毛發枯槁、精神萎靡,蜷縮、消瘦等“腎陽虛”的癥狀[22],冰羥基脲灌胃法是本課題組在前期研究基礎上優化后的腎陽虛造模方法,可以更敏銳地建立腎陽虛證不孕的動物模型[14, 23]。本研究中,腎陽虛組大鼠出現弓背蜷縮、肛溫下降、動情周期紊亂等腎陽虛證候,血清FSH顯著升高,AMH、E2、P顯著降低,子宮內膜變薄,腺體數顯著下降,表明該造模方法引起了雌性大鼠生殖系統的顯著改變,與前期結果一致[14]。本研究還發現該腎陽虛不孕雌鼠模型子宮大血管體積占比顯著下降,各級血管數量未有顯著變化而直徑均顯著下降。腎陽不足則虛寒內生,腎陽的溫煦、推動作用減弱,且寒主收引,故出現各級血管管徑減小,子宮組織血供減少可導致子宮內膜變薄、腺體減少,致使胞宮難以攝精成孕。

腎中精氣可化生血液,以灌充血脈,氣血為人體陰陽之基礎[24]?！端貑枴て娌≌撈吩弧鞍j者系于腎”。胞脈即為胞宮的血脈,胞絡實際是胞宮上的脈絡,是腎中精氣輸注于胞宮的道路[25]。胞宮、胞脈、胞絡正常運行并且相互作用,才能使子宮內膜易于受胎。若胞絡失暢、胞脈不充,則胞宮失司難以攝精成孕。本研究中,三種腎虛模型大鼠均表現出腎虛證候,出現血清性激素改變、動情周期紊亂等,表明腎精、腎陰或腎陽任一的虛損均可導致卵巢功能的下降。但子宮組織形態學卻產生了不同的改變,腎精虧虛證大鼠子宮內膜腺體減少,血管數量減少;腎陰虛證大鼠子宮出血,大血管管徑減小而微血管增粗;腎陽虛證大鼠子宮內膜變薄,各級血管管徑減小。本研究結果表明子宮血管的變化可能是雌鼠生殖功能、子宮內膜容受性下降的原因之一,可為中醫藥“同病異治”及改善不同證型的子宮血管血供提供研究基礎。