低氧條件下HIF-1α對骨生理中成骨和破骨的影響

范智博，魏綿興，李勝鴻 綜述 徐曉梅 審校

1.西南醫科大學附屬口腔醫院正畸科（瀘州646000）；2.四川大學華西口腔醫院唇腭裂外科（成都 610041）

【關鍵字】低氧；缺氧誘導因子-1α；成骨；破骨

諸多研究表明缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）在機體中扮演著重要角色，除了參與了糖代謝[1]、腫瘤的發展[2]、免疫反應[3]等，還與成骨和破骨有著密切的聯系[4]。正常生理狀態下成骨與破骨事件一直處于動態平衡的狀態，但當機體環境發生變化或者受外部刺激的影響而使其中一方呈現優勢時，便會導致骨質的增生或者吸收。這種不對等的狀態在骨的發育、骨折的愈合、正畸牙的移動（圖1）以及腫瘤的轉移中均有體現，且在這些事件中均可觀察到低氧條件存在的蹤跡。而作為低氧標志物的HIF-1α也被證明在這些成骨及破骨過程中發揮著重要的作用。本文將從HIF-1α 的角度出發，分析低氧條件下HIF-1α對骨生理中成骨和破骨的影響。

圖1 骨發育、骨折愈合以及正畸牙移動中的低氧區域Figure 1 Hypoxic areas in bone development,fracture healing,and orthodontic tooth movement

1 不同氧濃度與低氧時間下HIF-1α的特性

研究表明，HIF 家族主要包括了3 個亞型：HIF-1、HIF-2和HIF-3[5]。它們是由β亞基和氧敏感α亞基組成的異源二聚體轉錄因子[6]。HIF-1 是目前HIF 家族中研究較多的因子，其α 亞基中包含一個基本的DNA結合域(C-TAD)和一個保守的NH2端結構域(N-TAD)。而在HIF-1 α亞基上的N-TAD區域還含有一個氧依賴結構域（oxygen-dependent degradation,ODD），它是位于PAS（Per ARNT Sim）結構域羧基末端的200 個氨基酸(人類HIF-1α 蛋白的826 個氨基酸中400～600 個殘基)的功能域，并介導了HIF-1α 蛋白降解的O2依賴降解途徑[7-8]。由于HIF-1α 結構的特點導致HIF-1α在不同的氧濃度下會展現出不同的特性。

1.1 不同氧濃度下HIF-1α的特性

當細胞處于常氧狀態時HIF-1α會降解，這一特性也使得HIF-1α 成為了低氧的標志物。在常氧狀態下HIF-1α主要是通過C-TAD的羥基化及ODD的乙?；土u基化而進一步誘導其活性的降低甚至降解。在常氧狀態時，HIF-1α C-TAD內的一個保守的天冬酰胺殘基會在缺氧誘導因子-1 抑制因子（factor inhibiting HIF-1,FIH-1）和氧的共同作用下發生羥基化，導致CTAD 活性降低從而影響HIF-1α α 亞基的活性。而由于HIF-1α 的C-TAD 比HIF-2α 對FIH-1 的抵抗力更低[9]，這使得HIF-1α 相較于其他亞型在常氧狀態下的活性更容易受到影響。除此之外，在常氧條件下HIF-1α 的ODD 中的脯氨酸殘基在脯氨酸羥化酶（pyruvatedehydrogenase,PHD）的作用下還會被選擇性地羥化，并且其多肽段內賴氨酸還會發生乙?；?。而羥化和乙?；蟮腍IF-1α 會以Fe3+、O2、α-酮戊二酸和抗壞血酸等作為底物[10-11]，使腫瘤抑制蛋白(von-Hippel-Lindau tumor suppressor protein,pVHL)能夠結合α 亞基上的ODD。而VHL 作為E3 泛素連接酶復合體的底物識別成分[12]，會通過與延伸蛋白C結合，再進一步與E3泛素連接酶的延伸蛋白B、結構蛋白CUL2（cullin 2 polypeptide）及亞基RBX1（Ring-box protein 1）結合進而誘導HIF-1α 發生泛素化并使HIF-1α 通過泛素-蛋白酶體(26S)途徑被26S蛋白酶體降解[8,13]。正由于在常氧狀態時存在著這種降解途徑，故HIF-1α在常氧的狀態下降解非常迅速，其半衰期只有5 min[10]（圖2A）。

圖2 HIF-1α在不同氧濃度下的狀態Figure 2 HIF-1α state at different oxygen concentrations

而在中度低氧時由于HIF-1α 在細胞內的降解減少，使HIF-1α 在細胞內能穩定存在，其還可以通過與下游基因的HRE（hypoxia response element）區域結合而進一步發揮調控作用。中度低氧時HIF-1α 的降解減少主要是因為N-乙?；D移酶(N-acetyltransferase2,NAT2)的表達減少，從而使HIF-1α 的乙?；瘻p少。此外，磷酸化后的HIF-1α 還會通過與HIF-1β 結合從而轉位至胞核內再與CREB（cAMP-response element binding protein）結合蛋白(CBP)/p300 相互作用，從而形成有活性的HIF。而HIF-1α 只在核內表達也證實了HIF-1α 存在著核內轉位這一特點[14]。與此同時HIF-1β還會促進HIF-1α的磷酸化[6-7]。有活性的HIF-1生成后即會與靶基因上的特定區域結合從而發揮作用，這個特定的區域被稱為缺氧響應元件(hypoxia response elements,HRE)[15-16]。常見的與骨生理有關的靶基因包括了葡萄糖轉運體1（glucose transporter-1,GLUT-1）、骨保護素（osteoclastogenesis inhibitory factor,OPG）、血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)等[5]。

研究表明靶基因的HRE 區域通常為增強子，當HIF-1α 與靶基因的HRE 區域結合后可以通過順式相互作用調控其相鄰的啟動子的表達[17]，且在靶基因的HIF-1α 結合區域與靶基因啟動子之間還存在長期相互作用（圖2B）[18]。在這種中度低氧條件下HIF-1α 通過與靶基因HRE 區域結合的調控方式參與了機體的多種生理活動，如在椎間盤內、組織損傷處及腫瘤內部均存在缺氧區域，而HIF-1α參與了椎間盤內穩態的維持[19]、組織損傷的修復[20]及腫瘤的發展[21]。

當細胞處于重度低氧時HIF-1α 對下游基因的調控作用便會被抑制。這主要是因為重度低氧的狀態會使HIF-1α去磷酸化并使p53穩定，從而誘導Bcl2相關蛋白X（BCL-2-associated X protein，Bax）介導的細胞色素c 從線粒體釋放并進一步激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(cystine-containing aspirate-specific proteases，caspases），而被激活的caspases 便會引起HIF-1β的裂解，且其還可以促進HIF-1α 的去磷酸化（圖2C）[7]。HIF-1β 的裂解會導致有活性的HIF-1 的產生被抑制從而間接抑制了HIF-1α 對其它基因的調控作用。

1.2 不同低氧時間下HIF-1α的特性

除了低氧濃度外，低氧時間也影響著HIF-1α的特性。從缺氧的持續時間上來說，在急性缺氧時HIF-1α會高表達。但當細胞處于長期的低氧狀態時HIF會發生亞型轉化，表現為細胞內HIF-1α 表達降低而HIF-2α、HIF-3α 的表達增高[5]，故在適應高海拔環境時HIF-2α發揮著更重要的作用[6]。MARCIN 等認為出現這樣的亞型轉化，一方面可能是由于在持續性低氧條件下T細胞識別的鱗狀細胞癌抗原1(squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells，SART1)及熱休克蛋白70/熱休克蛋白70 羧基端相互作用蛋白（heat shock protein70/carboxyl terminus of the hsc70-interacting protein，Hsp70/CHIP）會選擇性作用于HIF-1α 從而使其降解。且HIF-1 到HIF-2 信號轉導過程還會通過促進RACK1 的表達從而促進HIF-1α 的PHD/VHL 非依賴性蛋白酶體降解；另一方面，他們認為非編碼RNA中的microRNA（miR-429、miR-155 和miR-200b）在此種亞型的轉化過程中也發揮了重要的調控作用[22]。除microRNA 外，反義的非編碼RNA 如HIF1A-AS1 也被證實了參與這個過程[23]。細胞內的調節是一個復雜的過程，由多種因素共同參與完成，但以上的研究都只單獨談論了一種因素對HIF-1α的影響，故目前相關機制研究還未完全將這種亞型轉化的機制闡明，需要更進一步研究。

2 低氧狀態下HIF-1α參與成骨事件

2.1 低氧下HIF-1α促進成骨反應的調控機制

HIF-1α 一方面可以通過促進成骨相關因子的表達從而直接促進成骨，另一方面還可以通過促進糖酵解以及血管的形成[24]從而間接促進成骨反應。在體外實驗中，學者們通過研究HIF-1α和VHL的表達對小鼠模型骨量的影響，發現HIF-1α 缺失會導致骨量減少，而當VHL 缺失或者PHD1、PHD2 和PHD3 等引起HIF分解的因子聯合缺失時都會導致骨量的增加[25]，這說明HIF-1α 對于骨生成有著重要的作用。這是因為在低氧時被激活的HIF-1 會與成骨相關基因VEGF、OPG、Runt相關轉錄因子（Runt-related transcription factor 2，Runx2）及Ⅰ型膠原蛋白(collagen type Ⅰ，Col1aⅠ)等的HRE區域結合從而促進這些成骨因子的表達。KOVáCS等進一步的研究發現成骨相關因子OPG還能抑制破骨細胞的生成[26]。除此之外，HIF-1還可以促進糖酵解相關基因的表達，使細胞在低氧下仍能維持成骨所需的能量從而間接促進骨的形成[27-28]（圖3）。HIF-1α 還可以通過影響成血管過程進而參與骨的發育以及骨再生過程[24]。

圖3 低氧下HIF-1α對成骨與破骨細胞及糖酵解的調控Figure 3 HIF-1α regulates osteoblasts，osteoclast and glycolysis under hypoxia

2.2 HIF-1α參與的成骨相關事件

2.2.1 HIF-1α通過促進成骨參與骨的發育 由于VEGF、OPG 及Col-1 等成骨相關因子均存在HRE 區域，故在適宜的低氧條件下機體能通過促進HIF-1α 與下游因子的HRE 區域結合進而刺激骨及血管的形成，這對早期骨的形成有著重要的意義。骨形成的早期，胎兒生長板及胎芽的間充質細胞聚集區域處于缺氧的狀態，在此區域HIF-1α表達增高并生成大量有活性的HIF-1，隨即與VEGF、Runx2 及Col-1 的HRE 區域結合并促進其表達，通過此種方式HIF-1α可促進骨的形成。研究表明若細胞HIF-1α 缺失將會使間充質細胞的成軟骨分化和軟骨細胞的最終分化時間延長[29-30]，這可能與依賴HIF-1α 的關鍵軟骨轉錄因子SOX9（SRYrelated high mobility group-box gene9）的調控有關。HIF-1α除了促進軟骨的分化外，對于維持軟骨細胞的存活也有著重要的意義，若HIF-1α受抑制將導致該區域細胞的死亡[29]。除此之外，HIF-1α還可以通過促進糖酵解，增加氧氣和營養物質的輸送從而維持軟骨細胞的活性[31-32]。另外，有研究發現HIF-1 還可以通過調控H型血管的形成從而影響骨發育的過程[33]。當然過高水平的HIF-1α 也會對骨骼的發育產生不良的影響，會引起骨代謝失調從而限制軟骨細胞增殖和縱向骨生長導致骨骼發育不良[34]。

在骨發育不斷成熟的過程中，骨髓腔和骨骺生長板的骨內膜區也都存在著缺氧的區域，機體可通過HIF-1α 調控這些區域的軟骨細胞和成骨細胞的功能從而影響骨的進一步發育[35]。

在骨發育成熟后，HIF-1α依然發揮著對骨功能的調節作用。HIF-1α 可以通過促進局部分泌骨生理的調控因子血清骨硬化蛋白(sclerostin)、VEGF、OPG 和EPO 等從而間接影響骨髓內皮細胞、破骨細胞和造血細胞的功能。通過此種方式HIF-1α 實現了在骨發育成熟后對骨生理的調控作用[36]。

2.2.2 HIF-1α 通過促進成骨參與骨折愈合 HIF-1α在骨折愈合中也發揮著重要的作用。當骨折發生時，骨折處的血管破裂會造成局部的缺氧，會使成骨細胞的氧氣攝入不足，導致HIF-1α表達增高進而誘導骨的生成[37]。為探究HIF-1α在骨折愈合過程中作用，學者們通過人為制造SD大鼠脛骨的骨折，再通過腹腔注入CoCl2使骨折部位HIF-1α 水平增加，結果發現骨折部位的Runx2等成骨標志物表達與HIF-1α的表達一致，且骨折部位的X線片提示，HIF-1α增高組脛骨骨折的愈合速度較對照組明顯增快[38-39]。

2.2.3 HIF-1α 通過促進成骨參與成牙槽骨 HIF-1α除了能促進脛骨的成骨外，在促進成牙槽骨方面也有著重要作用。研究發現低氧培養牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）或者利用CoCl2建立PDLSCs 低氧模型后，在前6 h ALP、Runx2 等成骨標志物表達水平逐漸升高，之后其表達水平逐漸降低，這提示處于低氧最初時間可以刺激PDLSCs 的成骨分化能力。在這其中HIF-1α與PDLSCs的成骨標志物表達趨勢一致。且當抑制了HIF-1α 表達后，PDLSCs 的成骨能力也出現明顯的下降趨勢[23,40]。由此可見低氧環境中HIF-1α可促進PDLSCs中的成骨分化。

綜上所述，HIF-1α在骨的發育、骨折的愈合、促進成牙槽骨等多方面發揮著重要的調控作用。

3 低氧狀態下HIF-1α參與破骨事件

低氧狀態所產生的HIF-1α 不僅能刺激成骨還能刺激破骨事件的發生，且兩個事件調控的機制具有諸多共通點。

3.1 低氧狀態下HIF-1α促進破骨反應的調控機制

HIF-1α 對于破骨細胞的存活及激活均有著重要的意義。骨表面結構較為致密，此處氧含量較低，而這也正是破骨細胞的棲息之地，在該處破骨細胞中也能檢測到了HIF-1α 的表達[41]。且研究發現在低氧條件下破骨事件會活躍發生，這是由于HIF-1α一方面可以通過與促破骨細胞因子直接結合而促進破骨，另一方面還可以通過促進糖酵解導致微環境的酸化從而間接促進破骨的發生。在低氧環境下，細胞為適應環境的變化會增加其糖酵解能力[42]，低氧環境中糖酵解的增強不僅對成骨細胞能量代謝的維持有著重要意義，并且其對破骨細胞的激活及低氧環境中能量的提供也起著重要的作用。低氧環境下在破骨細胞中被激活的HIF-1會增加GLUT等大量糖酵解基因的表達，從而刺激葡萄糖轉運體和糖酵解酶的增加。除此之外，被激活的HIF-1 還可以通過調控磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）從而增加糖酵解途徑通量[43-44]。通過這些途徑，細胞即使處在缺氧條件下也能產生足夠的ATP 及ROS 維持骨的吸收[45-46]。眾所周知，細胞代謝的方式主要是通過氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）或者糖酵解來實現的，一般來說生物體內95%的ATP 來自于OXPHOS，但在低氧的條件下由于氧供給不足導致細胞代謝會以糖酵解為主[47]，故微環境中代謝的酸性物質會不斷累積，且隨著時間的延長會引起酸中毒，而酸中毒又可以進一步刺激促破骨細胞因子（RANKL、VEGF、IGF-2和GDF-15）及OPG的生成從而促進破骨細胞的形成，且RANKL、VEGF等促破骨細胞因子同時也受HIF-1α的調控[33,48]（圖3）。

此外，除上述兩種主要機制外，低氧環境下HIF-1α還可以通過激活自噬進而調控破骨反應[49]。一方面HIF-1α 可以通過誘導B 淋巴細胞瘤-2 基因/腺病毒E1819KD 相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovims E1819KD interacting protein3,BNIP3)的產生從而使自噬相關蛋白Beclin-1 從Bcl-2 中釋放出來從而直接引發自噬[49]。另一方面HIF-1α 還可以通過促進糖酵解過程誘導酸性代謝產物的累積使局部PH 下降從而間接促進自噬的表達，雖然PH降低引發的自噬對成骨細胞呈現出一定的保護作用，但當局部PH 低于6.0時，最終還是會觸發成骨細胞凋亡[50]。除此之外，低氧誘導的自噬還會抑制細胞成骨分化[34]（圖3），這表明在低氧環境下自噬雖然對成骨細胞存活有著重要意義但也會抑制成骨。雖然在低氧環境中HIF-1α可以促進自噬的表達，但當隨著微環境中的酸性產物堆積過多導致PH值過低時，HIF-1α 更多的是以促進成骨細胞的凋亡進而增加骨吸收的發生為主。

低氧狀態下除了HIF-1α 對破骨的直接調控外，HIF-1α 依賴的調控因子也影響著破骨的發生，如與HIF分解有關的重要因子PDH2和作為HIF-1α拮抗劑的雌激素缺乏時都會引起HIF-1α 蛋白在破骨細胞中積累，從而導致破骨細胞活化和骨丟失[51-52]。

3.2 HIF-1α參與的破骨相關臨床事件

3.2.1 HIF-1α通過促進破骨參與骨腫瘤的轉移 HIF-1 信號通路對破骨細胞的刺激對骨腫瘤中的轉移有著不可或缺的作用。當腫瘤體積不斷增大，而營養物質及氧氣供給又出現不足時，腫瘤內部會出現缺血缺氧的情況。這種低氧條件會刺激HIF-1α 的產生并激活HIF-1，被激活的HIF-1會促進破骨細胞的形成[53]并通過調控VEGF 促進腫瘤內血管的形成從而進一步促進腫瘤的轉移。低氧條件下HIF-1α 會通過調控糖酵解相關基因從而增加糖酵解量，導致乳酸大量產生，在腫瘤微環境中也是如此，在腫瘤細胞中隨著乳酸陰離子及氫離子移到細胞外，會引起腫瘤微環境（tumor micro-environment，TME）的酸化。研究表明這種酸化的微環境將會促進腫瘤的轉移，而乳酸的存在也可以通過抑制PDH從而更進一步的穩定HIF-1α的存在[54]。SCOTT 等認為抑制HIF 的降解在破骨過程中尤為重要[55]。因此科學家們也旨在通過研發抑制HIF-1α 生成的藥物從而抑制腫瘤的進展，目前已有相關藥物得到了臨床印證如二硫代哌嗪、反義寡核苷酸EZN-2968等[56]。

3.2.2 HIF-1α 通過促進破骨參與正畸牙的移動HIF-1α 在正畸牙移動過程中的壓力側牙槽骨骨吸收過程中也發揮著重要的作用。在正畸力作用下，受到壓力的一側會出現缺血缺氧的情況，隨之發生骨的吸收及改建。研究表明在正畸力的作用下氧張力降低側會導致局部HIF-1α 的表達增加[57]。在牙周膜干細胞的相關實驗中也證實了持續性壓應力作用下HIF-1α可以穩定存在[58],且RANKL 與VEGF 作為其下游調控因子，表達也會增加。這也進一步刺激了破骨細胞的形成進而引發壓力側的骨吸收[59-60]。作為HIF-1 拮抗劑的雌激素也側面證實了HIF-1α 在正畸牙的移動過程中發揮的調控作用，研究表明雌激素水平與牙移動速度成反比[61]，而降低的雌激素主要通過減輕對HIF-1的抑制作用從而導致骨吸收增加。

4 小結與啟示

在骨微環境中，骨生理是由破骨細胞和成骨細胞共同調控所決定，而低氧刺激下的骨轉化過程中HIF-1α發揮著重要的作用。它一方面可以通過調控成骨及糖酵解相關基因參與骨的發育、形成以及骨折的修復等成骨現象；另一方面還可以通過調控破骨及糖酵解相關基因從而參與正畸牙移動及腫瘤的轉移中的破骨現象。研究表明低氧環境中糖酵解代謝對破骨細胞激活尤為重要[62-63]，隨著低氧時間的延長會引起酸的不斷堆積，從而更有力地刺激破骨。而對于低氧狀態會產生成骨或破骨哪種現象，可能是由低氧的程度和持續的時間所共同決定的[64-65]。

作為低氧下的關鍵調控因子的HIF-1α 在不同氧濃度以及持續時間下也展現出不同的特性，那么能否合理利用這一特性通過對調控低氧濃度以及時間進而使HIF-1α對成骨的作用發揮到極致，這是一個值得思考的問題。在心血管研究方面，已將這種交替低氧的模式應用于低氧治療心血管疾病[66]。而這種模式在骨缺損方面的調控卻還缺乏證據，這是未來可以深入探究的方向。除此之外，在機制方面，持續性低氧的狀態下HIF-1α 的表達會出現先升高后降低的趨勢，而HIF-2α 會逐漸增加，對于HIF 出現的這一亞型變化的相關研究也還較少，這也是未來值得我們去探索HIF相關調控機制的新方向。