基于單細胞測序和芯片數據分析強直性脊柱炎合并克羅恩病的腸黏膜免疫浸潤和炎癥微環境

羅錫慶, 古潔若

中山大學附屬第三醫院風濕免疫科、廣東省免疫疾病臨床醫學研究中心(廣東廣州 510630)

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一種常見的以附著點炎癥、新骨形成為特征的主要侵犯脊柱和骨盆骶髂關節的炎癥性風濕免疫疾病[1]。約60%的AS患者存在無癥狀的腸道炎癥,行腸鏡檢查發現多見于近端結腸和回腸末端部位的微小炎性病灶存在[2],或宏基因組測序結果顯示腸道菌群失調[3],不僅對炎癥因子表達產生了影響,還引發腸黏膜免疫細胞浸潤狀態產生改變[4],但患者無明顯胃腸道不適的主訴,處于亞臨床腸炎的狀態尚未達到炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的診斷標準。隨著病程的進展,引起腸道易激惹的癥狀,如大便次數增加、腹瀉,有約7%～10%[5-6]的嚴重患者可能演變為具有臨床表現的腸炎,發展為IBD如典型的克羅恩病(Crohn′s disease, CD)或潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)[7],目前以累及回盲部的CD最為常見。根據在鏡下觀察的病理特點可以把具有臨床表現的腸炎進一步分為急性和慢性兩種表型,其中,急性炎癥表型以中性粒細胞浸潤為主;而慢性炎癥表型則以單核、淋巴細胞浸潤為主,同時具有病理結構破壞且類似于CD的表現。腸黏膜免疫細胞的變化在IBD的發生和發展過程中是一個重要的方面,腸黏膜免疫細胞相互作用導致了腸道炎癥的進一步發展和加重[8]。因此,在IBD的治療過程中,免疫調節劑、生物制劑等治療方法都致力于控制這些免疫細胞的數量和活性,從而減輕炎癥反應,控制腸道炎癥。同時,腸道和外周血免疫細胞的變化也可以作為IBD的臨床診療當中的重要參考指標之一,通過檢測免疫細胞的類型和數量來判斷IBD的病情嚴重程度和預后等信息[9]。成人和兒童IBD患者的外周血和腸黏膜中都發現了活化的CD4+和CD8+T細胞[10]。在AS合并IBD的病理生理過程中,CD8+T細胞可能發揮關鍵作用。首先,CD8+T細胞在腸道黏膜屏障的維持和病原體清除中具有重要功能[11]。在IBD中,腸道黏膜屏障受損,導致腸道細菌穿越黏膜進入組織,進一步加重炎癥。CD8+T細胞的異常激活可能導致腸道黏膜屏障損傷,加劇炎癥反應[12]。其次,CD8+T細胞分泌多種炎癥性細胞因子,如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和γ-干擾素(IFN-γ),參與炎癥反應的調節[13]。在AS和 IBD的病理過程中,這些炎癥性細胞因子可能導致組織損傷和炎癥。此外,CD8+T細胞與其他免疫細胞如Th17和Treg細胞以及抗原呈遞細胞如樹突狀細胞和巨噬細胞[14]存在相互作用,參與AS合并IBD的病理過程。細胞毒性CD8+T細胞和產生白細胞介素(IL)-17的CD8+細胞(又稱Tc17細胞)參與IBD的發病機制[14]。CD8+T細胞在AS合并 IBD的發病機制中可能扮演著重要角色。它們參與腸道黏膜屏障的損傷和修復過程、炎癥性細胞因子的產生以及與其他免疫細胞的相互作用,共同促進炎癥反應的持續和加重[15-18]。深入研究CD8+T細胞在這些疾病中的作用和相互關系,有助于揭示病因學,并為開發針對特異性T細胞亞群的治療策略提供理論依據。因此,為了解析AS患者合并腸炎機制,本研究使用GEO數據庫中的芯片數據初探AS合并亞臨床腸炎、AS合并CD的腸組織中免疫細胞浸潤情況及主要炎癥信號通路激活情況,并使用AS合并腸炎的腸黏膜及外周血的單細胞測序數據集進行分析驗證腸炎中的主要炎癥信號通路活性,為AS關節外并發癥監測、后續治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 主要數據 為了獲取AS患者的腸黏膜組織的基因表達芯片、測序與其臨床數據,使用關鍵詞為“脊柱關節炎、強直性脊柱炎”和“腸炎”,在美國國立生物技術信息中心 (National Center for Biotechnology Information,NCBI)的GEO數據庫中進行檢索。檢索公式具體如下: (Ankylosing spondylitis OR spondyloarhtritis OR Spondylarthropathy) AND (inflammatory bowel disease OR Crohn′s disease OR ulcerative colitis OR colitis),共獲得4個GSE數據集,分別為GSE163314、GSE92472、GSE14442、GSE10080,其中GSE92472為全血組織來源且樣本量少沒有設定生物學重復,GSE10080為從健康人群中提取PBMC細胞并使用IL-23刺激相互對照的數據集,均為非腸道組織數據予以排除,GSE163314為單細胞測序包含AS的腸黏膜數據,GSE14442為AS合并CD的腸黏膜芯片數據。最終納入GSE14442、GSE163314為主要研究數據。臨床數據主要通過以下方式獲得:(1)通過作者上傳的基因表達matrix文件中提取。(2)通過數據集相對應文獻的全文及補充材料獲得。見表1。

1.2 芯片數據處理分析流程

1.2.1 芯片數據處理 從GEO平臺下載雙色芯片GSE14442 表達矩陣,該數據為CD患者和包括AS的脊椎關節炎患者腸道活檢中的基因芯片數據。根據作者數據處理說明,選擇Channel 1熒光標記為Cy5作為背景矯正,Channel 2熒光標記為Cy3作為檢測值并進行數據預處理后獲取表達矩陣,通過提供的平臺文件將基因探針注釋為基因官方名。

1.2.2 免疫細胞的評估 CIBERSORT是一種基于去卷積的工具,它使用支持向量回歸方法來分析基因表達數據,以推斷混合細胞類型樣本中每種細胞類型的比例。該工具基于標準化的基因表達數據,能夠評估22種類型免疫細胞浸潤的比例。利用CIBERSORT 算法評估浸潤免疫細胞的類型及豐度,選擇 CIBERSORT中P≤0.05的結果進行下一步分析。

1.2.3 基因集富集分析驗證炎癥相關通路 使用基因集富集分析GSEA揭示AS合并CD組與AS組之間的基因集在INTERFERON_GAMMA_RESPONSE、INFLAMMATORY_RESPONSE、TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB等的AS炎癥相關的基因數據集中富集情況。

1.3 單細胞數據分析流程

1.3.1 使用Seurat對單細胞數據進行質控預處理 通過read10X加載GEO數據庫下載的基因表達數據,創建Seurat對象。每個單細胞中檢測到的不同基因的數量設定>200且<4 000,單細胞中所有基因的表達量之和設定為<10 000以選擇非零表達基因的細胞,并對線粒體基因比例>10%的細胞進行去除,以獲得可靠穩健的分析結果。隨后對全部的數據表達量進行NormalizeData標準化、ScaleData歸一化。使用FindIntegrationAnchors進行多個樣本整合,并去除干擾因素。

1.3.2 細胞降維以及聚類 Findmarkers 方法用于計算每個樣本中最顯著的2 000個高度可變基因,將其視為關鍵基因,以便在后續的主成分分析(principal component analysis,PCA)中進行降維處理。在此過程中,主成分的數量設定為30個,同時為每個測試數據集生成彎頭圖。根據彎頭圖的結果,綜合判斷采用前20個主成分對細胞進行分類和聚類預測。為了實現單細胞聚類的二維平面可視化,采用了 t-SNE 和 UMAP降維算法直觀地展示細胞聚類的結果。

1.3.3 使用參考標記基因進行重新聚類并細胞類型注釋 使用singleR注釋工具的免疫細胞參考數據集MonacoImmuneData進行初步的細胞亞群分類,并參照Cellmarker數據庫中不同細胞類型的標志性基因,分析其在聚類結果的表達來進行手動細胞類型注釋。

1.3.4 差異基因計算 通過應用 Seurat 軟件包中的FindAllMarkers函數,計算各種細胞類型之間的差異表達基因(logfc.threshold=0.25, min.pct=0.1)。

1.3.5 單細胞基因集打分 單細胞基因集打分(single-cell gene set scoring)是一種專門針對單細胞轉錄組測序數據設計的分析方法,旨在量化特定基因集在單細胞層面上的表達水平或活性。這一策略利用一組預先確定的基因集,與特定的生物過程、信號傳導途徑或細胞功能緊密相關,進而對單細胞數據進行評估。借助單細胞基因集打分,能夠在單細胞分辨率上深入探討各種細胞亞群之間在功能上的差異,揭示細胞狀態的動態演變以及在疾病進展過程中所發揮的分子機制,有助于解析細胞間的異質性以及病理生理過程。本研究使用irGSEA(integrated rank-based gene set enrichment analysis)整合性方法對標記好細胞類型的亞群利用基于單個樣本的基因表達排名的基因集分析方法 “AUCell”“UCell”“singscore”“ssgsea”四種算法進行基因集打分,從而在降低批次效應影響的同時,計算每個細胞在基因集上的表達水平、活性評分,更為有效地挖掘穩定可靠的基因集。隨后綜合全部算法的結果并進行可視化分析,揭示細胞之間在功能水平上的差異和相關性。

1.3.6 炎癥信號通路相關基因表達情況 從分子特征數據庫(Molecular Signatures Database,MSigDB)中獲取相關炎癥信號通路的gmt文件制作炎癥信號通路相關基因表格。使用FindMarkers函數對單細胞數據集的AS合并CD組以及AS不合并CD組進行差異基因分析獲取差異基因列表。對炎癥信號通路相關基因表格以及差異基因列表進行合并查看相關炎癥信號通路中主要基因的表達差異。

2 結果

2.1 基本情況

2.1.1 芯片數據分組 在分析中,首先對患者進行篩選,選擇具有臨床表現的SpA樣本,根據臨床信息中組織學檢查包括正常腸黏膜、急性炎癥、慢性炎癥以及CD特征性的病理特點如狹窄(stricturing)、潰瘍(penetrating)分為脊柱關節炎不合并腸炎(SpA)、脊柱關節炎合并亞臨床腸炎(SpA-subCD)、脊柱關節炎合并臨床腸炎CD(SpA&CD),其中脊柱關節炎不合并腸炎根據是否累及中軸關節分為中軸型SpA(SpA-A)和外周型SpA(SpA-P)兩種情況。見表2。

表2 納入分析芯片數據基本信息表

2.1.2 單細胞測序數據分組情況 從GEO數據集GSE163314中選取SpA(該研究中全部為中軸型,即AS)有無合并CD的樣本,包括外周血和腸黏膜的數據,共有4例患者,其中2例為SpA合并CD定義為SpA&CD,兩例為SpA不合并CD定義為SpA,具體分組如表3所示。

分區裝表計量法（District Meter Area，簡稱DMA），其工作原理是將檢測管網分成多個區域，利用每個區段安裝的水表計量區段用水量，在夜間無居民用水或用水量非常少時，這個時候的用水量可以作為該區段的漏水量。通過關閉區段內的閥門，對比用水量變化即可確定漏水管段。當漏水管段確定后再用聽音法即可確定漏水具體位置。

表3 納入分析單細胞測序數據基本信息表

2.2 芯片數據分析 采用 CIBERSORT 反卷積法進行計算,輸出每個樣本中不同免疫細胞亞群的百分比,圖1展示了22種免疫細胞在各個樣本中的含量豐度。以P<0.05為篩選條件對芯片進行篩選,CD8+T淋巴細胞、未活化的記憶 CD4+T細胞、靜息狀態下CD4+T記憶細胞含量在AS腸黏膜組織中不同程度增加。見圖2。

通過箱線圖(圖3)直觀地比較SpA患者發生亞臨床腸炎、臨床腸炎的腸組織免疫細胞亞群的差異。中軸型及外周型SpA患者CD4+、CD8+T淋巴亞群在未發生腸炎時,CD4+、CD8+T淋巴亞群占比較低。但當發生腸炎時,隨著病情的進展,未活化的記憶 CD4+T細胞、靜息狀態下CD4+T記憶細胞、CD8+T淋巴細胞含量逐漸增加。在巨噬細胞、單核細胞、B淋巴細胞、NK細胞亞群中無明顯差異變化。

使用GSEA算法驗證在AS合并CD的患者以及AS腸黏膜芯片基因表達矩陣中INTERFERON_GAMMA_RESPONSE、INFLAMMATORY_RESPONSE、TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB這三個與炎癥相關的信號通路的富集情況(圖4)發現, INTERFERON_GAMMA_RESPONSE、INFLAMMATORY_RESPONSE、TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB均能在GSEA分析中明顯富集(矯正后P<0.05),而IL17-PATHWAY則無明顯富集(矯正后P>0.05)。

圖1 22種免疫細胞在SpA合并腸炎的芯片數據中的浸潤豐度情況

圖2 AS腸黏膜組織芯片中T淋巴細胞異常浸潤免疫細胞的類型

圖3 箱線圖比較不同類型SpA發生腸炎的腸黏膜細胞浸潤比例

2.3 單細胞測序數據分析 通過對單細胞測序數據質控,獲得了外周血數據集有18 404個免疫細胞,腸黏膜有4 412個免疫細胞,共22 816個高質量免疫細胞的數據。通過對單細胞測序數據進行降維和聚類,得到可視化腸黏膜、外周血免疫細胞的 t-SNE聚類圖和UMAP聚類圖(圖5、6),可見細胞總共分為若干Cluster細胞亞群,腸黏膜數據被分為7群細胞,而外周血數據被分為10群細胞。腸黏膜數據每一個Cluster的細胞數量分別為1453(0)、822(1)、643(2)、616(3)、416(4)、385(5)、75(6)。外周血數據每一個Cluster的細胞數量分別為3727(0)、3080(1)、2890(2)、2637(3)、1809(4)、1763(5)、934(6)、732(7)、675(8)、157(9)。

注:A-綠色:INTERFERON_GAMMA_RESPONSE;A-紅色:INFLAMMATORY_RESPONSE;A-藍色:TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB;B-黑色:IL17-PATHWAY

使用SingleR中的MonacoImmuneData作為對比參考數據,結合淋巴細胞的特異性標記物在數據集中的表達情況(圖7、8),腸黏膜的單細胞數據的Cluster1、Cluster5高表達CD3E、CD8A,鑒定為腸黏膜CD8+的T淋巴細胞亞群并進行提取標記用于后續單細胞基因集打分。同理,對比圖5、6,外周血的單細胞數據的Cluster2、Cluster8同時高表達CD3E、CD8A,鑒定為外周血CD8+的T淋巴細胞亞群并進行提取標記用于后續單細胞基因集打分。

注:A:使用t-SNE降維后的細胞分布圖;B:根據樣品分組的細胞分布圖;C:使用UMAP降維后的細胞分布圖;D:根據樣品分組的細胞分布圖。圖例中,0～6表示聚類的7個亞群,C表示腸黏膜樣本

注:A:使用t-SNE降維后的細胞分布圖; B:根據樣品分組的細胞分布圖;C:使用UMAP降維后的細胞分布圖;D:根據樣品分組的細胞分布圖。圖例中,0～9表示聚類的10個亞群,B表示外周血樣本

對提取CD8+T細胞的外周血、腸黏膜不同疾病組(SpA、SpA&CD)中進行CD8+T細胞的占比情況分析。發現在外周血中CD8+T細胞中SpA&CD的平均占比為21%,高于SpA平均占比18%;而在腸黏膜中CD8+T細胞SpA的平均占比為30%,高于SpA&CD平均占比23%,鑒于該數據的腸黏膜提取免疫細胞獲取的細胞數較外周血樣本明顯較少,仍有待更多的數據進行驗證:腸黏膜SpA01 為359個免疫細胞,SpA02 為2 964個免疫細胞,SpA&CD01為846個免疫細胞,SpA&CD02為1 482個免疫細胞;外周血SpA01 為6 098個免疫細胞,SpA02 為6 041個免疫細胞,SpA&CD01為4 988個免疫細胞,SpA&CD02為3 974個免疫細胞。

圖7 小提琴圖展示常見免疫細胞特征表達標記物在腸黏膜樣本中不同Cluster中的表達情況

圖8 小提琴圖展示常見免疫細胞特征表達標記物在外周血樣本中不同Cluster中的表達情況

對提取的腸黏膜和外周血的CD8+T淋巴細胞進行單細胞基因集富集評分(圖9),綜合四種算法的結果,發現TNF-α信號通路、IFN-γ信號通路、以及炎癥反應信號通路在AS合并CD的患者中較AS無 CD的患者的通路活性均有不同程度的升高,其中在腸黏膜的分布更加明顯。然而,IL-17信號通路在腸黏膜中無明顯升高,而在外周血中則與TNF-α信號通路、IFN-γ信號通路類似具有升高的趨勢,提示TNF-α信號通路、IFN-γ信號通路、IL-17A信號通路在外周血CD8+T細胞中活躍。而在腸黏膜中,主要是TNF-α信號通路、IFN-γ信號通路可能參與了AS合并腸炎的發生、發展進程。

注:縱坐標表示富集的分數,圖例中不同的顏色表示P值,富集程度越高顏色越紅

表4 腸黏膜單細胞數據集中相關炎癥信號通路中差異基因

表5 外周血單細胞數據集中相關炎癥信號通路中差異基因

3 討論

AS作為一種常見的自身免疫病,其發病機制目前尚不明確。其中,多種免疫細胞的功能紊亂和數量比例異常是AS發生關節外并發癥如腸炎的發病重要因素[19-20]。既往研究大多集中在骶髂關節的關節炎癥部位,且主要基于RNA測序或基因芯片技術,研究AS關節組織整體基因表達模式改變,極少對關節外并發癥之一的腸炎的腸組織轉錄組進行闡述。在細胞亞群研究方面,既往研究多關注于AS外周血免疫細胞比例及功能,而對腸黏膜中免疫細胞的研究較少。Yang等[21]發現,與健康對照組相比,活動期AS的免疫細胞的中央記憶和幼稚CD4+T細胞、CD8+T細胞比例增加,并且給予TNF-α拮抗劑治療后,可以負調節CD4+T細胞比例,但對CD8+T細胞無明顯改善。Jiang等[22]研究發現AS患者的免疫細胞外周血分布中,在CD4+T亞群中,幼稚CD4+T細胞、中樞記憶CD4+T淋巴細胞和衰竭CD4+T細胞核的比例顯著增加,但終末分化CD4+T和效應記憶CD4+T細胞的水平在AS中顯著降低;AS患者的幼稚CD8+T細胞、中樞記憶性CD8+T淋巴細胞、效應記憶性CD8+T細胞和耗盡的CD8+T細胞水平升高,但相對而言,終末分化的CD8+T細胞水平降低。Hanson等[23]對外周血的CD4+T細胞、CD8+T細胞進行T細胞受體免疫測序,發現AS患者相對于健康對照組的CD4+T細胞、CD8+T細胞具有更高的TCR多樣性。Komech等[24]具有特征性T細胞受體β鏈基序的CD8+T細胞在AS患者的血液和滑膜液中存在,并在滑膜液中擴增。Qaiyum等[18]也發現成熟的CD8+T細胞在AS滑膜液中富集,具有表達整合素相關基因β7、CD103、CD29、CD49a。Gracey等[16]研究AS患者中CD8+T細胞的毒性特征發現,在AS患者的外周血中相對于健康對照組,CD8+T細胞比例下降卻在關節滑膜液中比例增加,在刺激情況下會釋放更多的細胞毒素,包括Perforin、Granzyme B和Granulysin,對目標細胞的殺傷作用更強。這些發現提示CD8+T細胞亞群可能在AS的病理過程中發揮關鍵作用。Xu等[25]通過單細胞RNA-seq和ATAC-seq分析發現參與AS進展的致病基因NF-κB起源于CD8+T細胞,CD8+T細胞中的NF-κB、FOS、JUN和JUNB在AS組中存在差異。

在GEO公共數據的GSE163314原研究中,作者研究了外周血中表達顆粒酶B的成熟T細胞在識別AS合并CD、AS和CD之間的差異性。研究中的顆粒酶B是一種由NK細胞和CD8+T細胞釋放的具有毒性作用的分子,在炎癥和自身免疫性疾病中發揮著關鍵作用。通過對患者血液樣本進行分析,作者發現AS合并CD患者中循環顆粒酶B陽性的CD4+T細胞、CD8+T細胞的數量明顯高于AS和CD患者。此外,與研究中的健康對照組相比,作者發現所有疾病組中CD4和CD8譜系的PD-1+T細胞都有增加的趨勢,有一部分個體的終末耗竭T細胞增加,提出CD4+和CD8+細胞毒性T細胞都可能參與AS合并 CD的發病機制。這些發現提示循環顆粒酶B+T細胞水平可作為一種潛在的生物標志物,有助于區別AS合并CD與 AS和 CD。該研究還探索了IFN-γ信號通路在CD8+T細胞中富集情況,但尚未對與AS發生、發展密切相關的TNF-α信號通路、IL-17信號通路的活性進行研究。

為了驗證CD8+T細胞數量比例在監測、診斷AS合并腸炎的作用。本研究選取了具有臨床信息的腸黏膜芯片數據,使用了CIBERSORT的反卷積算法進行腸黏膜免疫細胞的“數字流式”分析。通過免疫浸潤中的細胞比例對比分析發現CD8+T淋巴細胞在腸黏膜中浸潤是 SpA合并CD最顯著特征。并且在腸炎的炎癥程度方面與免疫浸潤的程度相關。我們從初步的比例分析發現了SpA合并CD 多種免疫細胞類型的改變,包括CD4+記憶T淋巴細胞的亞群、CD8+T淋巴細胞亞群。在正常的機體內,記憶性T細胞對抵抗病原微生物再次入侵、發生高效迅速的免疫應答具有重要作用,如記憶CD4+T淋巴細胞在體內呈現緩慢逐步的減少,而CD8+記憶T淋巴細胞則能在體內保持穩定的數目。推測在AS合并腸炎中,CD4+的記憶T細胞可能會受到腸道菌群紊亂、失衡,組織內慢性炎癥的影響而出現數量的異常[26]。而在激活的CD4+記憶T細胞亞群的數量則呈現緩慢減少的趨勢。而AS患者組織中如腸黏膜、葡萄膜等部位的CD8+T細胞的浸潤分布及激活炎癥信號通路活性的目前研究較少。在IBD的研究中發現,結腸固有層含有大量組織駐留的CD8+T細胞,這些細胞可能導致IBD的組織損傷[12]。Rosati等[27]發現一類新型非常規T細胞亞群在CD患者的腸道組織中顯著增加,表現出與CD8+T細胞的亞群有關的獨特轉錄特征,提示這些細胞可能在CD的發病機制中發揮作用。

隨后,本研究使用芯片數據在AS合并CD以及AS之間進行GSEA分析發現TNF-α信號通路、IFN-γ信號通路相關通路在AS合并CD的腸黏膜組織中均明顯富集,IL-17A信號通路則無明顯富集。單細胞測序數據的基因集活性評分發現CD8+T細胞的TNF-α信號通路、IFN-γ信號通路、IL-17A信號通路的通路活性在AS合并CD的患者中較AS無合并 CD的患者在外周血中均有不同程度的升高。而在腸黏膜中IL-17A信號通路激活并不明顯。單細胞測序數據的基因集活性評分驗證了芯片數據中GSEA評分的結果。 TNF-α信號通路、IFN-γ信號通路參與了AS合并腸炎的發生、發展進程,而IL-17A作為腸黏膜屏障的保護性因子僅起到輔助作用。隨后我們對炎癥信號通路中主要基因進行差異分析,發現一些參與抗原結合呈遞的人類白細胞抗原(HLA)如HLA-DQA1、HLA-DRB1、HLA-DMA等基因在腸黏膜中上調,提示腸黏膜中可能存在了抗原性物質如自身抗原導致T細胞和B細胞的免疫識別和活化;參與信號傳導、轉錄調節和細胞因子產生的分子如CD74、CD83、IRF8、REL、NR4A1、DUSP2等基因在腸黏膜中上調,參與調節細胞因子、趨化因子與細胞功能。參與化學趨化性和細胞遷移的分子如SELL在腸黏膜中上調, CCR7基因在外周血中表達上調與白細胞的定向運動和組織定位有關。其中,BANK1在AS合并CD組較AS無合并CD組中腸黏膜與外周血免疫細胞中表達上調。BANK1是一種參與B細胞受體信號傳導的蛋白質,影響B細胞的活化、分化、抗體產生和記憶細胞形成,調節自身免疫反應,研究發現BANK1的基因多態性與系統性紅斑狼瘡(SLE)[28]、類風濕關節炎(RA)[29]和干燥綜合征(SS)[30-31]等疾病的遺傳易感性有關。然而,有研究對BANK1的三個易感SNP包括rs10516487、rs17266594、rs3733197進行炎癥性腸病的關聯分析,但未觀察到 BANK1基因具有顯著關聯[32]。但AS合并CD的發病機制與典型的CD之間目前認為不完全相同,仍需更多的研究對BANK1基因與AS合并CD的關系進行深入研究。

然而,本研究存在以下不足:(1)用于數據分析的AS合并腸炎的相關數據集數量及樣本量較少;(2)沒有收集臨床樣本對CD8+T細胞進行流式細胞術檢測細胞亞群數量及功能驗證。未來研究將會通過腸鏡檢查納入AS合并腸炎和AS無腸炎的患者進行流式細胞檢測T細胞分群,對CD8+T淋巴細胞進行分選后鑒定相關炎癥通路的核心基因、蛋白的表達情況進行驗證。

總的來說,CD8+T細胞增多作為判斷AS合并CD的參考指標值得進一步研究,或許可用于評估AS患者腸道病變的情況?；蚣钚源蚍址治鲲@示在AS合并CD的患者中腸黏膜組織中TNF-α信號通路、IFN-γ信號通路活性升高,但在IL-17信號通路激活并不明顯。

利益相關聲明:所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻說明:羅錫慶負責完成數據分析、論文撰寫;古潔若為項目構思、指導論文修改。