BAIAP2L2在肝癌中的表達及與預后的關系

袁克榮, 戈英男, 潘紅艷, 龔達, 莫佳業, 鄧雪松△

1深圳大學第一附屬醫院、深圳市第二人民醫院肝膽胰外科(廣東深圳 518035); 2華中科技大學協和深圳醫院消化內科(廣東深圳 518052)

原發性肝癌屬于高度惡性腫瘤,其組織類型以肝細胞癌(liver hepatocellular carcinoma, LIHC)占絕大多數,被喻為我國癌癥中的第二號殺手[1]。我國腫瘤登記中心最新統計數據表明,LIHC每年新發病例約38.88萬,位居全國惡性腫瘤發病的第4位,發病率為28.12/10萬;LIHC每年死亡病例約33.64萬,位居全國惡性腫瘤死亡的第2位,死亡率為24.33/10萬[1]。目前,臨床上LIHC的主要治療手段有手術切除、肝臟移植、放療、化療、栓塞、局部治療和分子靶向藥物治療等。盡管LIHC治療手段多,但是治療后極易復發與轉移,遠期存活率并未得到明顯提高[2-3]。隨著研究的深入,越來越多的腫瘤基因,及其參與腫瘤發生、發展的作用和分子機制逐漸得到認識[4-11]。因此,進一步探討LIHC的分子調控機制,尋找特異、高敏感的分子標志物,對指導LIHC早診早治、評估預后和監測復發轉移具有重要意義。腦組織特異性血管生成抑制因子1關聯蛋白2同類基因2(brain-specific angiogenesis inhibitor 1-associated protein 2-like 2, BAIAP2L2)定位于人染色體22q13.1,CDS區域 1590bp,含530個氨基酸,分子量大約58kD[12],主要位于細胞膜、細胞核、細胞質和線粒體,可與磷酸肌醇4,5二磷酸結合,具有促進平面或彎曲細胞膜結構形成的作用[13]。新近研究表明,BAIAP2L2在基因調控和轉錄后蛋白編碼過程中表現“腳手架”調控的作用,受胰島素受體和胰島素相關生長因子受體酪氨酸磷酸化激活,調控亞細胞結構的基質膜形成、肌動蛋白移行和偽足形成,參與多種實體腫瘤細胞的發育、分化、增殖、侵襲和遷移等分子生物行為[14-19]。然而,國內外關于BAIAP2L2在LIHC中的相關研究報道較少。近年來,僅有2篇采用生物信息學方法對BAIAP2L2在LIHC表達、作用和潛在調節機制的報道,但未通過臨床病例和細胞功能學實驗進行驗證[20-21]。因此,本研究在生物信息分析的基礎上,結合臨床病例探討BAIAP2L2在LIHC的表達與臨床特征的相關性,為揭示LIHC的發病機制和預測預后提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 數據來源 從TCGA和GTEx數據庫(https://TCGAData.nci.nih.gov/TCGA/))獲取33種腫瘤[注:腎上腺皮質癌(ACC);膀胱癌(BLCA);乳腺癌(BRCA);宮頸鱗癌和腺癌(CESC);膽管癌(CHOL);結腸癌(COAD);彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBC);食管癌(ESCA);腦膠質瘤(GBM);頭頸癌(HNSC);腎嫌色細胞癌(KICH);腎透明細胞癌(KIRC);腎乳頭狀細胞癌(KIRP);急性髓性白血病(LAML);低級別腦膠質瘤(LGG);肝細胞癌(LIHC);肺腺癌(LUAD);肺鱗癌(LUSC);間皮瘤(MESO);卵巢癌(OV);胰腺癌(PAAD);嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤(PCPG);前列腺癌(PRAD);直腸腺癌(READ);肉瘤(SARC);黑色素瘤(SKCM);胃癌(STAD);睪丸癌(TGCT);甲狀腺癌(THCA);胸腺癌(THYM);子宮內膜癌(UCEC);子宮肉瘤(UCS);葡萄膜黑色素瘤(UVM)。]的BAIAP2L2表達的相關數據,計算基因表達的FPKM水平(fragments per kilobase million)用于后續的比較分析;公共數據庫GEPIA(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)和TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)計算差異表達分析,采用秩和檢驗的方法進行比較(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。GEO數據集的基因表達分析使用BEST網站(https://rookieutopia.com/app_direct/BEST/#PageHomeAnalysisModuleSelection)的臨床信息相關性分析功能進行統計分析。

1.2 預后分析 為了探討BAIAP2L2表達對腫瘤預后的影響,每種腫瘤患者以BAIAP2L2表達的中位數為界值分成兩組(高表達組和低表達組),本研究通過單因素COX比例回歸風險模型分析了BAIAP2L2表達與總體生存率(overall survival, OS)的相關性,使用Forestplot包繪制森林圖;Kaplan-Meier方法分析BAIAP2L2高表達組和低表達組的無瘤生存期(disease free survival, DFS)差異,在GEPIA數據庫(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)進行Kaplan-Meier生存曲線作圖。

1.3 腫瘤突變負荷(tumor mutational burden, TMB)和微衛星含量(microsatellite instability, MSI)分析 基于來自TCGA數據庫(https://portal.gdc.com)的RNA-seq數據,按既往文獻的方法計算33種腫瘤的TMB[22]和MSI水平[23],分析BAIAP2L2表達水平與各腫瘤的TMB、MSI的相關性,以P<0.05且|r|>0.2認為顯著相關。

1.4 信號通路的富集分析 收集105個腫瘤明星信號通路的基因集合[24]并通過R包GSVA的method=′ssgsea′功能實現ssGSEA算法[25],基于ssGSEA算法計算LIHC中105個腫瘤明星信號通路,探討其與BAIAP2L2基因表達的Spearman相關性。分析BAIAP2L2表達與信號通路的相關性,以P<0.05且|r|≥0.3認為顯著相關。通過Pearson相關性分析確定TCGA數據庫LIHC與BAIAP2L2表達正相關前300的基因,通過WEB-based GEne SeT Analysis Tookit (http://www.webgestalt.org/)工具實現KEGG通路富集分析,設定最小基因數為5,同種類型的通路用同樣顏色標記,校準P<0.05、標準化富集分數絕對值(normalized enrichment score, |NES|>1)和錯誤發現率(false discovery rate, FDR q<0.025)的信號通路被認為是顯著富集的通路。

1.5 臨床病例資料 2020年1月至2022年6月在我院首次行LIHC根治術的患者55例,術前未接受放、化療等輔助治療,術后病理確診為LIHC;以及同期因肝外傷、肝良性病變接受手術的患者10例。留取LIHC組織、癌旁組織(距腫瘤邊緣>1 cm)和正常肝組織標本,存于-80℃冰箱中備用。手術當天開始計算生存時間和無瘤生存時間。對LIHC患者進行術后隨訪,建立隨訪檔案,所有統計信息截至2023年3月。本研究已獲我院臨床科研倫理委員會批準(20190724),所有組織標本的收集均取得患者的知情同意。

1.6 組織標本的免疫組織化學檢測與結果判讀 常溫下解凍組織標本,經甲醛固定,脫水、石蠟包埋,切片,厚度為3 μm,依次按步驟進行烤片、脫蠟、抗原修復、內源性過氧化物酶滅活和封閉,孵育一抗(1∶100稀釋Anti-Pinkbar;品牌:abcam/艾博抗,廣州巴本生物科技有限公司),4℃冰箱封閉過夜,TBST浸洗切片4次(5 min/次),孵育二抗,37℃恒溫箱孵育30min,TBST浸洗切片4次(5 min/次),DAB顯色,再次脫水,脫酒精,最后封片、晾干。

BAIAP2L2表達的蛋白分布于細胞核外,彌散在細胞質中,因此將細胞質染棕色定義為陽性。制備好的組織切片采用玻片掃描影像系統(型號:SQS-40P;深圳市生強科技有限公司)進行掃描成像,經過放大80倍視野并截取圖像,每一切片圖像隨機選取3個視野以.tiff格式進行保存,通過image J軟件(型號:2.15.0 WIN;美國National Institutes of Health)對于圖像的積分光密度值(integrated optical density, IOD)進行統計分析,取3個視野的平均值作為最后結果,計算積分光密度值,即得出標本的染色強度,代表BAIAP2L2的表達量。

2 結果

2.1 BAIAP2L2在泛癌中的表達 采用TCGA和GTEx數據庫分析BAIAP2L2在33種腫瘤組織、癌旁組織和正常組織的表達水平,利用limma方法進行差異表達的檢驗,結果表明:BAIAP2L2在BLCA、CHOL、COAD、ESCA、HNSC、KICH、KIRC、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、STAD、THCA等13種腫瘤組織的表達顯著高于對應的癌旁組織,在SKCM原發癌組織的表達顯著高于轉移癌組織(圖1A);BAIAP2L2在BLCA、CHOL、ESCA、HNSC、KIRC、LIHC、LUAD、LUSC、STAD等9種腫瘤組織的表達顯著高于對應的正常組織,在PRAD腫瘤組織的表達與對應的正常組織比較無明顯差異(圖1B)。GEO數據庫分析結果顯示,BAIAP2L2在LIHC組織中的表達顯著高于正常肝組織(圖1C)。

注:A: 癌組織與癌旁組織的比較;B: 癌組織與對應正常組織的比較;C: BAIAP2L2在LIHC組織與正常肝組織的比較(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001)

2.2 BAIAP2L2表達在泛癌中預后評估的價值 DFS森林圖結果顯示,BAIAP2L2高表達是ACC、LGG、MESO、PRAD、SKCM、UCEC和UVM等7種腫瘤的危險因素(圖2A)。生存分析結果表明,BAIAP2L2表達與ACC、LGG、SKCM、和UVM等4種腫瘤的DFS相關(P<0.05)(圖2B), 與LIHC的DFS沒有明顯相關;BAIAP2L2表達與ACC、LIHC、MESO、UVM、PRAD、SKCM和LUAD等7種腫瘤的OS相關(P<0.05)(圖2C)。

2.3 BAIAP2L2表達對泛癌中基因組不穩定性的影響 分析結果顯示,BAIAP2L2表達水平與ESCA、PAAD、UCEC的TMB顯著正相關(P<0.05,r>0.2),與LIHC的TMB無明顯相關性(-0.20.2),與READ的MSI呈負相關(P<0.05,r<-0.2),與LIHC的MSI無明顯相關性(0

注:A: DFS森林圖;B: BAIAP2L2表達與4種腫瘤DFS的相關性; C: BAIAP2L2表達與7種腫瘤OS的相關性

2.4 BAIAP2L2在LIHC潛在調控的信號通路 采用ssGSEA方法,分析105條腫瘤明星信號通路在LIHC發生、發展中的作用與相關性,結果顯示BAIAP2L2表達水平與16條潛在調控信號通路顯著相關(圖4和表1)。其中,BAIAP2L2表達參與的正性調控的信號通路有鞘糖脂生物合成/新乳糖合成、G2/M期檢查點、腫瘤增殖、鞘脂代謝和糖胺聚糖生物合成硫酸角蛋白等5條通路;參與的負性調控的信號通路有脂肪酸降解、初級膽汁酸生物合成、β-丙氨酸代謝、生物素代謝、丁酸代謝、賴氨酸降解、D-精氨酸/D-鳥氨酸的代謝、硒化合物代謝、纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸的降解、色氨酸代謝和咖啡因代謝等11條通路。

注:A:BAIAP2L2與TMB的相關性;B:BAIAP2L2與MSI的相關性

圖4 BAIAP2L2表達與腫瘤明星信號通路的相關性

表1 BAIAP2L2表達與腫瘤明星通路的相關性

基于Pearson相關分析,計算各腫瘤與BAIAP2L2最相關的前300個基因,并進行KEGG生物學通路富集分析。結果表明,BAIAP2L2參與了LIHC的組氨酸代謝、β-丙氨酸代謝、GnRH、VEGF等信號通路的調節。見圖5。

圖5 LIHC中與BAIAP2L2表達最相關的前300個基因富集的KEGG通路圖

2.5 臨床病例中BAIAP2L2在LIHC組織的表達明顯增高 BAIAP2L2在LIHC表達的IOD(0.32±0.12)水平顯著高于對應的癌旁組織(0.23±0.08)(P=1.09e-05,95%CI:-0.10362～-0.046545)和正常肝組織(0.25±0.05)(P=0.003 6,95%CI:-0.10867～-0.021028) (圖6、7),與TCGA數據庫LIHC數據的結果一致。

圖6 LIHC組織、癌旁組織和正常肝組織BAIAP2L2的表達(×80)

注:A: LIHC與癌旁組織BAIAP2L2表達的比較;B: LIHC與正常組織BAIAP2L2表達的比較

2.6 在LIHC病例中,BAIAP2L2的表達水平與臨床病理特征的相關性 根據組織標本的免疫組織化學結果,以LIHC組織IOD值的中位數為參考界值,將LIHC病例分為BAIAP2L2高表達組(n=28)與低表達組(n=27)。相關性分析結果顯示,BAIAP2L2表達水平與腫瘤數目、直徑和分化程度密切相關(均P<0.05),而與患者性別、年齡、HBV感染、脂肪肝、肝硬化、AFP等其他臨床病理特征無明顯相關(均P>0.05)(表2)。BAIAP2L2高表達組中位生存期15個月,低表達組中位生存期21個月,兩組比較的差異具有統計學意義(P=0.0182)。進一步單因素COX分析,結果顯示BAIAP2L2表達水平與LIHC患者生存預后相關(P=0.03,HR0.281, 95%CI: 0.089～0.884)。

3 討論

BAIAP2L2表達蛋白又名為Pinkbar蛋白,含有Bin-Amphipysin-RVS(BAR)結構域,是一個反向平行的全螺旋二聚體,具有形似香蕉的彎曲外形,通過其帶正電荷的凹面與細胞膜結合,通過靜電相互作用結合富含磷脂膜,并在體外誘導肌醇磷脂聚集,從而產生正膜曲率的外力,主要在細胞膜的形成、細胞膜的內吞、細胞的運動和細胞整體的形態發生變化等過程中發揮關鍵作用,參與多種實體腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移等多種生物行為[14, 15, 27-29]。近年來的研究表明,BAIAP2L2在多種不同類型的腫瘤組織均有表達,如LUAD、STAD、骨肉瘤和PRAD等[16-19]。Xu等[16]報道,BAIAP2L2在LUAD組織和多種LUAD細胞株的表達上調,在體外實驗顯示,下調BAIAP2L2的表達可導致LUAD細胞株A549和H1299細胞存活、克隆形成能力下降,促進細胞的凋亡,通過抑制雌激素介導的細胞進入S期,進而抑制腫瘤細胞的增殖。Liu等[17]研究表明,BAIAP2L2在STAD組織中呈現高表達,與腫瘤直徑、T分期、pTNM分期和淋巴結轉移顯著相關;進一步機制研究表明,BAIAP2L2通過激活AKT/mTOR通路促進STAD細胞的增殖、遷移和侵襲。Guo等[18]研究顯示,BAIAP2L2在骨肉瘤組織和細胞株MG-63、U2OS的表達顯著上調,與腫瘤直徑密切相關,通過介導Wnt3a/β-catenin通路的激活促進了骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。Song等[19]研究表明,BAIAP2L2在PRAD組織和細胞株LNCaP和PC-3的表達上調,通過調控VEGF通路關鍵蛋白VEGFA、VEGFR和FAK的表達,促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

表2 LIHC患者的BAIAP2L2表達水平與臨床特征的相關性 例

本研究中,我們采用生物信息學分析的方法,通過TCGA和GTEx數據庫分析BAIAP2L2在33種腫瘤、對應的癌旁組織和正常組織的表達水平,結果發現BAIAP2L2在泛癌組織普遍呈現高表達,具體表現在BLCA、CHOL、COAD、ESCA、HNSC、KICH、KIRC、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、STAD、THCA等13種腫瘤組織的BAIAP2L2表達顯著高于對應的癌旁組織,在BLCA、CHOL、ESCA、HNSC、KIRC、LIHC、LUAD、LUSC、STAD等9種腫瘤組織的BAIAP2L2表達顯著高于對應的正常組織。為了進一步探討BAIAP2L2高表達對腫瘤預后的影響,我們以每種腫瘤患者BAIAP2L2表達的中位數為界值分成兩組(高表達組和低表達組)進行預后分析。DFS森林圖結果顯示,BAIAP2L2高表達是ACC、LGG、MESO、PRAD、SKCM、UCEC和UVM等7種腫瘤的危險因素。生存分析結果表明,BAIAP2L2表達與ACC、LGG、SKCM、和UVM等4種腫瘤的DFS相關,與LIHC的DFS沒有明顯相關。BAIAP2L2表達與LIHC、ACC、LGG、SKCM、UVM、MESO和PRAD等7種腫瘤的OS相關。上述結果表明,BAIAP2L2在癌組織的高表達,提示患者OS和DFS較差,是促進腫瘤進展和導致不良預后的重要因素,有可能成為預后腫瘤預測的潛在分子標志物,與文獻報道的一致[16-19]。

眾多研究表明,腫瘤的發生、發展是一個多因素、多基因、多步驟、多階段的復雜過程,所涉及的調控因素、基因和信號通路繁多,常常與miRNA異常表達、基因缺失/突變/表達異常、關鍵功能蛋白活性改變和多種信號通路的失調密切相關[4-11, 16-23]。既然BAIAP2L2異常表達參與腫瘤的發生發展,但是其潛在的生物學功能、分子機制和相關調控通路仍有待于進一步發掘。為此,我們進一步提取TCGA數據庫RNA-seq數據,分析泛癌中33種腫瘤的TMB和MSI水平,采用ssGSEA方法從105個腫瘤明星信號通路中去分析BAIAP2L2高、低表達與信號通路的富集差異,通過Pearson相關性分析,計算BAIAP2L2表達與各腫瘤最相關的前300個基因,并進行KEGG功能通路富集分析。TMB是腫瘤基因組中除種系突變外的體細胞突變的數量[22]。MSI反映了腫瘤細胞中缺陷DNA錯配修復的程度[23]。較高的TMB和MSI則表示腫瘤細胞可以產生更多的新抗原,此類新抗原可被免疫細胞識別為非自身抗原并觸發抗腫瘤免疫反應[30]。因此,我們評估了33種腫瘤中BAIAP2L2表達與TMB、MSI的相關性。分析結果顯示,BAIAP2L2表達水平與3種預后相關腫瘤ESCA、PAAD、UCEC的TMB顯著正相關,與4種預后相關腫瘤CHOL、DLBC、UVM和LGG的MSI正相關,與READ的MSI呈負相關。由此,我們推測BAIAP2L2可能通過調節腫瘤免疫細胞水平和狀況,在促進腫瘤的進展和影響的預后等方面具有一定的潛在作用。ssGSEA分析結果表明,BAIAP2L2表達水平與16條LIHC潛在調控信號通路顯著相關,BAIAP2L2表達參與的負性調控的信號通路有脂肪酸降解、初級膽汁酸生物合成、β-丙氨酸代謝、生物素代謝、丁酸代謝、賴氨酸降解、D-精氨酸/D-鳥氨酸的代謝、硒化合物代謝、纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸的降解、色氨酸代謝和咖啡因代謝等11條通路;參與的正性調控的信號通路有鞘糖脂生物合成/新乳糖合成、G2/M期檢查點、腫瘤增殖、鞘脂代謝和糖胺聚糖生物合成硫酸角蛋白等5條通路。由此可見,BAIAP2L2基因的表達上調有可能導致氨基酸的代謝和降解的抑制,引起重要化合物與關鍵功能蛋白的合成障礙、癌信號通路的調控異常,進而促進腫瘤的發生和發展。KEGG生物學通路富集分析表明,大部分腫瘤主要富集在代謝、細胞周期和凋亡調控等相關的信號通路。其中,BAIAP2L2參與了LIHC的組氨酸代謝、β-丙氨酸代謝、GnRH、VEGF等信號通路的調節,表現促癌的生物學功能。上述研究結果,為進一步揭示BAIAP2L2異常表達在泛癌中的促癌作用、可能的分子機制和相關調控通路提供了理論基礎。

為了在臨床病例中進一步探討BAIAP2L2在LIHC表達情況與臨床特征的相關性,本研究對收集了55例接受根治術LIHC患者的癌組織、癌旁組織標本,以及10例正常肝組織標本,采用免疫組織化學方法檢測BAIAP2L2表達水平,LIHC患者均得到術后隨訪,最后結合臨床資料進行統計分析。研究結果表明,BAIAP2L2在LIHC表達水平顯著高于對應的癌旁組織和正常肝組織,與TCGA數據庫LIHC數據的結果一致。相關性分析結果顯示,BAIAP2L2表達水平與腫瘤數目、直徑和分化程度密切相關;BAIAP2L2高表達組中位生存期明顯低于低表達組中位生存期;BAIAP2L2表達水平與LIHC患者生存預后相關。上述臨床研究結果表明,BAIAP2L2在LIHC高表達是促進腫瘤進展和導致不良預后的重要因素,提示BAIAP2L2高表達有可能作為預測LIHC預后的分子標記物,與其在泛癌數據分析結果一致。BAIAP2L2在LIHC異常表達與呈現的作用,與其在新近文獻報道的LUAD、STAD、骨肉瘤和PRAD所起的生物學功能相類似[16-19]。

本研究尚存在一定的局限性:(1)本研究主要基于公共數據庫的數據,以及55例患者隨訪39月的資料,下一步需要擴大臨床樣本量和延長術后隨訪時間,去驗證BAIAP2L2異常表達對LIHC患者預后的影響;(2)需要進一步深入研究確定BAIAP2L2表達在LIHC細胞株和動物模型的生物學功能、以及相關調控分子機制。

綜上所述,本研究利用TCGA和GTEx數據進行生物信息學分析,發現BAIAP2L2在泛癌組織中普遍高表達,通過影響TMB和MSI水平、調控相關的信號通路參與腫瘤的發生、發展。進一步臨床數據研究表明,BAIAP2L2在LIHC表達水平顯著高于對應的癌旁組織和正常肝組織,與腫瘤數目、直徑和分化程度密切相關,是促進腫瘤進展和導致不良預后的重要因素,有助于為闡明HCC的發病機制和預測預后提供新的線索。

利益相關聲明:所有作者共同認可論文無利益沖突。

作者貢獻說明:袁克榮負責數據統計分析、論文撰寫;戈英男負責研究方案執行與實施和數據整理;潘紅艷負責實驗結果作圖和分析;龔達負責患者組織標本的收集和術后隨訪;莫佳業負責組織標本存取和免疫組織化學檢測;鄧雪松負責研究設計、全過程管理、論文審校和修改。