卵巢儲備功能減退和卵巢早衰模型小鼠的差異蛋白質組學研究

李曉榮, 仲佳雯, 秦嶺, 高婷, 羅玉雪, 馬小紅△

1寧夏醫科大學總醫院生殖醫學中心(寧夏銀川 750004); 2寧夏醫科大學中醫學院(寧夏銀川 750004); 3寧夏醫科大學銀川市中醫醫院(750003)

卵巢儲備功能減退(decrease ovarian reserve, DOR)以及卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)都屬于卵巢功能下降。DOR是指卵巢內卵母細胞數量減少和(或)質量下降,同時伴有抗苗勒管激素水平降低、竇卵泡數減少、FSH水平升高[1],患者生育能力受損,嚴重者可進一步發展為卵巢早衰。卵巢早衰是是指40歲之前的女性,由于遺傳、醫源性、自身免疫、環境等因素,卵泡發育停止或過早卵巢功能不全,導致卵巢功能喪失[2]。根據調查顯示,POF作為一種常見的婦科疾病,在我國的發病率為1%～3%[3],而且每年都在增加。POF患者會出現不孕、更年期綜合癥、骨質疏松、心腦血管、神經等系統疾病和增加的死亡風險[4],嚴重影響女性的身心健康。如今人口老齡化趨勢日漸嚴重,出生率日漸降低,國家大力推廣“三胎政策”提高生育需求,但是女性生殖能力較前卻有所下降且呈現年輕化趨勢。因此,生育需求與生育能力的矛盾日漸突出。DOR和POF是引起生育能力降低的重要因素,二者病因比較復雜而且發病機制尚不清楚。蛋白質的改變是生命功能障礙的直接因素。因此,蛋白質是一系列生理病理發生的最終執行者,那么對相關疾病進行蛋白質層面的研究,有助于揭示其發病的機制并為治療提供相應的分子靶點。目前蛋白組學已經廣泛應用于各個學科中,2019年6—10月我們從蛋白質組學方面來找到與疾病相關的關鍵因素,進一步研究其病理機制,揭示關鍵因素的調控機制,全面了解疾病的發生和發展。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 環磷酰胺、碘代乙酰胺、二硫蘇糖醇、尿素、三乙基碳酸氫銨(Sigma);白消安(APExBIO);蛋白酶抑制劑(Calbiochem);胰酶(Promega);乙腈、超純水(Fisher Chemical);三氟乙酸(Sigma-Aldrich);甲酸(Fluka);BCA試劑盒(碧云天);TMT標記試劑盒(Thermo);雙目正置熒光顯微鏡(德國徠卡)。

1.2 實驗動物 選取SPF級6周齡動情周期正常的C57BL/6雌性小鼠36 只,體重18～25 g,由北京維通利華實驗動物有限公司提供(實驗動物許可證號:SCXK(京)2016-0011)。在寧夏醫科大學實驗動物中心動物屏障環境內飼養。本實驗經寧夏醫科大學實驗動物中心實驗動物福利倫理審查委員會審查同意倫理編號為(IACUC-NYLAC-2022-038)。

1.3 模型構建 所有小鼠均經過一周的適應性飼養,然后通過陰道涂片法觀察其動情周期,選取具有正常動情周期的36只雌性小鼠按隨機數字表法分為對照組12只(A組)、DOR組12 只(D組)、POF組12只(B1組)。POF組采用一次性腹腔注射120 mg/kg的環磷酰胺+12 mg/kg的白消安,DOR組一次性腹腔注射60 mg/kg的環磷酰胺+6 mg/kg白消安,對照組給予同等劑量的生理鹽水,給藥后持續觀察動情周期7 d,以動情周期紊亂為造模成功。陰道涂片方法參考文獻[5]。小鼠的動情周期包括動情前期、動情期、動情后期和間期,正常周期為4、5 d,各期判斷標準:動情前期:大量橢圓形的有核上皮細胞;動情期:大量片狀無核角化上皮細胞;動情后期:可見白細胞、有核上皮細胞和無核角化上皮細胞;動情間期:出現大量白細胞,體積相對較小。具體見圖1。

圖1 光學顯微鏡下小鼠動情周期變化(×20)

1.4 蛋白質組學分析

1.4.1 蛋白提取、酶解 從-80℃中取樣,將組織樣本置于預冷的液氮研缽中,加入液氮充分研磨至粉末狀,加入四倍體積的粉狀裂解緩沖液超聲波裂解。4℃,12 000g離心10 min,將上清液轉移至新離心管中,最后使用BCA試劑盒測定蛋白含量。將二硫蘇糖醇加入蛋白質溶劑中,調節至5 mmol/L的最終含量,并在56℃下還原30 min,然后加入碘乙酰胺,調節至11 mmol/L的最終含量,并在室溫下避光孵育15 min,最后,將樣品種的尿素含量稀釋至2 mol/L以下。將胰蛋白酶與蛋白質按1∶50的配比混勻,在37℃的溫度下酶解一晚。接著,將胰蛋白酶與蛋白質按1∶100的配比混勻,繼續酶解4 h。

1.4.2 TMT標記、HPLC分級 經StrataXC18(Phenomenex)脫鹽后,將胰蛋白酶溶解的肽放在0.5 mol/L TEAB中,并根據TMT操作說明進行標記。采用Agilent300ExtendC18色譜柱,其粒徑為5 μm,內徑為4.6 mm,長度為250 mm,通過pH反向HPLC技術對肽段進行分級。

1.4.3 液相色譜-質譜聯用分析 使用EASY-nLC1000超高性能液相系統分離肽。肽段經超高性能液相系統分離后注入NSI離子源,電離后進入QExactivePlus質譜儀進行分析。使用高分辨率Orbitrap檢測和分析肽母離子及其二級碎片。使用DDA程序進行數據采集。

1.4.4 數據庫搜索及生物信息學分析 使用Maxquant(v1.5.2.8)獲取二級質譜數據。數據庫系統為Mouse_swissprot _10090,并使用反庫運算來減少隨意配對導致的假陽性率。此外,還需要在數據庫系統中增加常見污染文庫,以減少蛋白質鑒別數據受到的干擾。利用費歇爾精確雙端檢驗方式,我們可以對差異表達基因的GO和KEGG通路進行富集研究,如果P值低于0.05,則表明該蛋白表達差異是顯著的。

2 結果

2.1 模型評價 造模后DOR組和POF組小鼠與對照組相比,精神相對萎靡,食欲減退,皮毛光澤度下降,體質量減輕,且POF組體質量下降較DOR組明顯;DOR組和POF組小鼠的動動情周期規律;顯微鏡下觀察到DOR組小鼠卵巢組織中較多閉鎖卵泡,黃體較多,情周期不規律,動情間期和后期持續,很少有動情前期和動情期。對照組小鼠原始卵泡和各級卵泡均少見,POF組中可見閉鎖卵泡較DOR組更多,對照組中見少量閉鎖卵泡,黃體存在,可見原始卵泡,次級卵泡和成熟卵泡數量較DOR組和POF組多。見圖2。

注:箭頭所指為閉鎖卵泡

DOR組和POF組小鼠血清中E2和AMH水平低于對照組(P<0.05),FSH水平高于對照組(P<0.05);POF組小鼠血清中E2和AMH水平低于DOR組(P<0.05),FSH水平高于DOR組,但差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 小鼠血清激素水平比較(n=7)

2.2 差異表達蛋白質譜分析 在本實驗中通過質譜分析共得到779 205.0張二級譜圖。利用蛋白質理論數據檢索質譜二次譜后,有效譜數為225 650,共鑒定出7 485.0個蛋白,其中6 621.0個蛋白包含定量信息。以1.2倍為差異表達變化閾值,以t檢驗P值<0.05為顯著性閾值,發現DOR組與對照組相比有149個顯著差異的蛋白,其中77個蛋白表達上調,72個蛋白質下調;與對照組相比,POF組發現了148個顯著差異的蛋白質,其中60個蛋白質上調,88個蛋白質下調。將這些顯著差異蛋白制成火山圖如圖3,部分差異蛋白信息如表2、3,二者重疊的表達差異蛋白有23個:D2HGDH、PHF24、BCR、ATP9A、TPD52、PODXL、TRIM24、MATN2、BICD1、GPX7、PDXK、MOCS2、RSRP1、H2AFY、HIST1H1E、RPL18、PIP5K1A、CD9、EPN3、ENO2、CTSA、HIST1H1C、PON1。

注:A:DOR組;B:POF組。橫軸為Log2對數變換后的蛋白質相對定量值的值,縱軸為-Log10對數變換后顯著性檢驗的P值。紅點表示顯著差異表達的上調蛋白,藍點表示顯著差異表達的下調蛋白

表2 DOR組與對照組部分差異表達蛋白

2.3 差異蛋白亞細胞定位結果 使用Wolfpsort軟件分析差異表達蛋白的亞細胞定位,兩組不同蛋白的亞細胞定位結果如下(圖4)。兩組差異蛋白質亞細胞定位按百分比大小依次排列均為細胞核、細胞質、細胞外,其次是線粒體和質膜、內質網,除此之外DOR組還有兩個差異蛋白定位在其他細胞器。

表3 POF組與對照組部分差異表達蛋白

注:A和B分別代表DOR組和POF組差異表達蛋白的定位,餅圖中的數字代表顯著差異表達蛋白的數量,百分比代表結構中差異表達蛋白的數量占總差異表達蛋白的百分比

2.4 差異表達蛋白的GO功能注釋 Gene Ontology(GO)是一個重要的生物信息學分析方法和工具,用于表述基因和基因產物的各種屬性。 GO注釋分為3個大類:生物進程(biological process,BP),細胞組成(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)[6]。針對BP、CC、MF中涉及的GO節點列出對應的蛋白數量,對差異表達蛋白在GO二級注釋中的分布進行統計(圖5)。在生物學過程這一類別中DOR組和POF組差異表達蛋白占比最多的都是細胞過程,其次是信號轉導過程;在細胞組分這一類別中,均是細胞的數量最多,其次是細胞器;參與分子功能的差異表達蛋白中,其中結合與催化活性二者最多。在所有亞類中,細胞過程、細胞、細胞器和結合注釋的差異蛋白數量最多。與此同時,對其差異表達蛋白進行GO富集分析(圖6),發現DOR組GO富集分析顯示差異蛋白主要參與了維生素B6代謝過程、磷酸吡哆醛生物合成過程、磷酸吡哆醛代謝過程、蛋白質-DNA復合物組裝、膽固醇穩態的正調節、對氧化應激反應的調節等生物過程;POF組GO富集分析顯示差異蛋白主要參與了細胞脂質分解代謝過程、甘油脂分解代謝過程、前列腺素反應、微絨毛組織的調節、輔基代謝過程、白細胞介素6生產的調節、對抗原刺激的炎癥反應等生物進程。

2.5 差異蛋白KEGG通路富集分析 KEGG是關于通路的公共數據庫,為了進一步探究差異蛋白發生作用的通路,將其具有顯著差異的蛋白納入KEGG數據庫檢索,得出差異表達蛋白在KEGG通路中富集分布氣泡圖,見圖7。DOR組中的差異蛋白主要與維生素B6代謝、α-亞麻酸代謝、PPAR信號通路相關,其中最顯著相關的是維生素B6代謝通路,富集蛋白最多的通路是PPAR信號通路;POF組中的差異蛋白主要與同源重組、錯配修復、鞘糖脂生物合成、花生四烯酸代謝、核糖體、糖鞘脂生物合成-神經節系列、DNA復制等通路顯著相關,其中與與同源重組、錯配修復通路最顯著相關,富集蛋白最多的一條信號通路是核糖體通路。P值最小的前5條通路具體見表4、5。

注:A、B分別代表DOR組和POF組差異表達蛋白在GO二級分類中的統計分布

注:A、B分別為DOR組和POF組BP、CC、MF三類差異蛋白富集分析,C、D分別為DOR、POF組BP的富集氣泡圖

注:A為DOR組,B為POF組。橫坐標為P值的-Log10 轉換值,縱坐標為通路的名稱,圓圈大小代表富集該通路的差異蛋白數目,顏色代表P值的大小

表4 DOR組差異表達蛋白KEGG通路富集結果(top 5)

表5 POF組差異表達蛋白KEGG通路富集結果(top 5)

3 討論

DOR是卵巢衰老或衰竭的前期,這是由于卵巢中可募集的卵泡數量減少或卵母細胞受精能力下降所致,發生率約10%,是月經過少的常見原因[7],若不重視后期會發展為POF。POF是指在40歲之前失去正常的卵巢功能,這種情況影響約1%的40歲以下女性和0.1%的30歲以下女性。它的生化特征是閉經伴有低雌激素和高促性腺激素性疾病,在某些情況下會導致生育能力喪失[8]。卵巢早衰通病因大多未確定[9],Fraison等[10]認為,POF是由潛在機制引起的,例如早期卵泡耗竭,卵泡成熟受阻或卵母細胞庫破壞以及抵抗性卵巢綜合征,可能涉及這些機制的POF的已確定原因分為兩類:遺傳和非遺傳原因。遺傳原因涉及各種遺傳異常,而非遺傳原因包括自身免疫和代謝紊亂、感染、環境因素和醫源性程序[11]。目前已經采用了各種方法來治療POF,但效果不顯。

蛋白質組學通過比較生物體或組織中所有蛋白質的差異表達[12],揭示了蛋白質分子水平的物質基礎和機制。在此實驗中,采用高分辨質譜儀進行TMT標記,進行鑒定和量化,通過生物信息學技術對差異蛋白進行分析來探究DOR、POF可能的靶點和通路。結果發現,DOR組小鼠卵巢有148個顯著表達蛋白,POF組小鼠卵巢有149個顯著差異表達蛋白,二者差異表達蛋白重疊有23個,其中HIST1H1C、RPL18、HIST1H1E、D2HGDH等蛋白在兩組中都呈現顯著高表達,二者重疊蛋白差異倍數趨勢一致。在DOR組中CA3、FABP4、RETN等蛋白顯著高表達,POF組D2HGDH、CYP4F3等蛋白顯著高表達,這些表達差異倍數較大的蛋白可能在疾病發展過程中起關鍵的作用。

差異表達蛋白的亞細胞結構定位表明,占比最多的是細胞核、細胞質和胞外,其次是線粒體、內質網。線粒體是多功能細胞器,其主要功能包括以ATP形式產生細胞能量,維持細胞內鈣穩態,活性氧(ROS)形成,細胞凋亡,脂肪酸氧化和類固醇合成。線粒體功能障礙是衰老的標志之一,線粒體功能障礙可由多種途徑引起,如線粒體DNA異?；蛑饾u累積損傷、氧化應激、Ca2+直接損傷線粒體,導致卵子發育潛力下降,誘導卵子凋亡,引起卵巢儲備功能下降,進而發展為卵巢早衰[13]。目前普遍認為氧化是導致衰老的重要因素,而線粒體和內質網中未折疊蛋白反應調節的氧化折疊機制是自由基的兩大來源[14]。內質網應激可能導致鈣和氧化還原穩態受損,引起氧化應激,從而影響線粒體功能。從內質網釋放的鈣增加了線粒體活性氧(ROS)的產生,內質網和線粒體內ROS的毒性積累會干擾基本的細胞器功能。持續的內質網應激可能引發炎癥反應,通過炎癥或線粒體功能障礙產生的ROS可能會加速內質網功能障礙[15]。D2HGDH、ATP9A、MRPl16、MTMR14、FAM162A等蛋白的功能與線粒體、內質網關系密切,可見,線粒體和內質網是關于DOR、POF疾病發生的重要細胞器,另外DOR組中有兩個差異蛋白定位在其他細胞器中,具體信息尚不清楚,仍需進行進一步的研究。

GO富集分析結果顯示DOR、POF疾病的發生、發展涉及氧化應激、炎癥等多種生物學過程。氧化應激指機體在受到各種有害刺激時,產生過多的自由基,且氧化物清除能力下降,體內氧化與抗氧化之間的不平衡[16],是導致衰老的重要因素。ROS主要是線粒體氧化磷酸化的副產物,當機體受到某些疾病或外源性物質攻擊時,導致組織細胞氧化應激損傷,于是細胞利用多種抗氧化機制阻斷ROS的形成或中和其代謝過程中產生的ROS。當ROS的產生超過細胞的排泄能力時,細胞因ROS的過度積累而引起異常的炎癥反應[17]。Bauer等[18]實驗證明,氧化應激是卵巢衰老過程的主要驅動力,并有助于與卵巢衰老相關的其他病因的發展,如端?？s短、線粒體功能障礙、細胞凋亡和炎癥。衰老器官中血清炎癥因子(如IL-6、IL-8、TNF-α)水平顯著升高,說明衰老與炎癥相關[19]。

GPX7是谷胱甘肽過氧化物酶家族(抗氧化)的成員,可有效控制過氧化物氫酶(H2O2)和通過還原谷胱甘肽的有機過氧化氫,它的主要作用是參與機體氧化還原穩態的維持[20]。TRIM家族,是一類具有E3泛素連接酶活性的蛋白質,其功能廣泛,能夠影響細胞增殖、分化、先天免疫、凋亡調控等,其中TRIM24是炎癥反應的負調節劑。GPX7在兩組中的蛋白表達較空白對照組相比均有所下降,TRIM24在兩組中的蛋白表達均有所上升,說明兩組小鼠體內氧化應激、炎癥反應較均有所增加。越來越多的證據表明,接頭組蛋白HIST1H1C(H1.2)在多個細胞過程中具有重要功能,包括細胞凋亡、自噬、基因轉錄等[21]。Wang等[22]發現組蛋白H1.2的過表達上可以導致自噬相關蛋白的上調,從而促進自噬,炎癥和病變形成。H1.2蛋白在兩組結果中都顯著高表達,說明其在兩種疾病中都發揮重要作用。D2HGDH是一種依賴FAD的線粒體酶,D2-羥基戊二酸(D2-HG)被認為是細胞代謝的不需要的副產物,D2HGDH介導D2-HG向α-酮戊二酸(α-KG)的轉化,研究表明D2HGDH表達的增加會提高細胞內α-KG的水平[23]。α-KG不僅是三羧酸(TCA)循環中的重要代謝產物,它可以抑制ATP合成酶,減少細胞耗氧量從而延緩衰老,此外其在脂質合成、氧化應激、細胞死亡等生理過程中也具有重要的調控作用。蛋白組學研究發現D2HGDH在DOR、POF組中都呈現高表達,說明細胞內α-KG升高,機體抗氧化能力升高,尤其在POF組中作用更加顯著。CA3是碳酸酐酶基因家族中的一員,在體內主要參與氧化代謝和離子交換等生理過程,其通過二硫鍵可逆結合到谷胱甘肽,可避免細胞受到氧化應激的傷害[24]。FABP4作為脂肪酸結合蛋白家族成員,在調節氧化應激、脂質代謝和炎癥反應等方面發揮重要的作用[25],可以直接促進炎性細胞因子的釋放和ROS的產生[26]。CA3和FABP4在DOR組中顯著高表達說明CA3、FABP4可能是DOR發生過程中的關鍵蛋白。

KEGG通路富集結果顯示DOR和POF疾病的發生發展是通過多條通路進行協同調控的,而不能單以一條通路來概括。目前我們課題組比較關注的通路是α-亞麻酸信號通路和花生四烯酸代謝通路。α-亞麻酸(ALA)和花生四烯酸(AA)都是多不飽和脂肪酸,多不飽和脂肪酸目前分為n-3、n-6、n-7和n-9這四個家族,其中ALA屬于n-3家族,AA屬于n-6家族。張怡等[27]研究發現多不飽和脂肪酸可影響卵巢脂肪酸含量、卵泡線粒體功能和卵泡氧化應激。n-3和n-6多不飽和脂肪酸可以調節生殖功能,因為它們會影響前列腺素合成和類固醇生成[28]。另外有研究[29]表示ALA能夠調節體內的氧化還原平衡。Wakefield等[30]研究發現在卵巢成熟過程中,卵母細胞暴露于富含n-3多不飽和脂肪酸的環境中會導致線粒體分布和鈣水平改變,并增加活性氧的產生,發現n-3 可以增加受精卵數量并能提高卵泡的線粒體功能和氧含量。Wathes等[28]認為卵母細胞的多不飽和脂肪酸含量會影響成熟、冷凍保存和隨后的發育能力。ALA與卵母細胞生長和分化、調節生發囊泡階段的減數分裂停滯以及防止生發囊泡破裂有關。近期的研究結果發現ALA可以抑制顆粒細胞的凋亡,可以通過抑制顆粒細胞中膽固醇的合成從而抑制類固醇激素的合成,導致E2分泌降低[31]。服用ALA后,體內谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性升高,自由基代謝產物丙二醛(MDA)的生成減少,揭示ALA有抗衰老作用。由此可見,ALA與氧化、炎癥、衰老關系密切,因此,認為α-亞麻酸信號通路是DOR疾病發展中的一條重要通路。

AA是細胞膜脂質的主要成分,它能進一步被環氧合酶(COX)、脂氧合酶(LOX)和細胞色素P450(CYP450)酶三種酶催化代謝,基于這三種代謝途徑,AA可以轉化為引發不同炎癥反應的各種代謝物[32]。AA是促炎前列腺素的前體,可介導卵泡成熟和排卵過程[33]。張金銘等[34]發現,AA會損害人卵巢顆粒腫瘤細胞系的分泌和線粒體功能,能有效地誘導氧化應激,然后發揮促凋亡作用,長期食用AA會使小鼠卵巢閉鎖卵泡增多。這些研究都輔助說明了花生四烯酸代謝通路是POF疾病發生中的一條重要通路。據報道,CYP4F亞家族成員主要參與花生四烯酸和異生素的代謝。CYP4F3是脂肪酸環氧化物氧化的主要催化劑,參與重要細胞介質的氧化[35]。CYP4F3過表達可誘導花生四烯酸增加,ROS積累和脂質過氧化,最終引起鐵死亡[36]。蛋白組學結果顯示POF組中CYP4F3顯著上調,導致ROS積累和AA代謝途徑激活,可見CYP4F3在花生四烯酸代謝通路中的重要作用。

綜上所述,通過對DOR組和POF組小鼠的差異蛋白進行生物信息學分析發現這兩種疾病是多蛋白、多生物學過程、多通路協同調控的。二者的發生都涉及氧化應激、炎癥反應等生物學過程;α-亞麻酸信號通路可能是參與DOR發生的一條重要通路,HIST1H1C、CA3、FABP4可能是其發生的關鍵靶點;花生四烯酸代謝信號通路可能是參與POF發生的一條重要通路,HIST1H1C、D2HGDH、CYP4F3可能是POF發生的重要靶點;本研究是基于多個數據模型得出的生物信息學假設,其具體發病機制有待進一步實驗驗證。

利益相關聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻說明:李曉榮研究方案設計、論文修改指導;仲佳雯、高婷撰寫論文、實驗操作、統計分析;秦嶺、羅玉雪文獻檢索、原始結果的整理與分析;馬小紅負責方案可行性分析、論文修改、研究指導。