LncRNA-NEAT1調控miR-182-5p表達對狼瘡性腎炎腎系膜細胞損傷的影響

張路路, 謝銳, 廖志敏, 吳剛, 萬波, 孫威, 周蓮紅

涼山州第二人民醫院 1腎內科, 2檢驗科(四川涼山 615000)

狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN)是系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)的主要并發癥,也是導致患者死亡的重要原因之一。從腎臟病理組織的角度來講,已確診的SLE患者約35%～75%表現為腎臟受累,導致SLE患者發生腎功能衰竭,對SLE患者的生命健康威脅極大[1]。LN發病率約占SLE患者的38%,主要病因是腎系膜細胞的過度增殖,從而引起炎癥因子的大量釋放,使得炎癥加重并導致腎小球硬化[2]。目前,LN的發病率逐年增加,臨床上通常采用藥物治療緩解患者的病情進展,并不能徹底將其治愈[3]。因此,探究LN的具體作用機制對提高患者治愈率來說非常重要。有研究表明,長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)能夠通過與微小RNA(microRNA,miRNA)結合來調控下游基因的表達從而參與調節細胞的生物學進程[4]。核旁叢組裝轉錄本1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1,NEAT1)是新發現的LncRNA。有研究顯示,NEAT1下調通過吞噬miR-128抑制氧化低密度脂蛋白誘導的動脈粥樣硬化發展中的炎癥和氧化應激[5];NEAT1過表達不僅能夠通過靶向miR-204和激活核因子-κB(NF-κB)通路加重脂多糖誘導的急性肺損傷[6],也能通過HMGB1/RAGE信號通路誘導肺泡上皮細胞損傷和炎癥的發生[7],還能夠吸附miR-139-5p來調控肝纖維化過程[8]。此外,NEAT1通過靶向miR-146b促進TRAF6的表達,加速LN腎系膜細胞損傷[9]。最近的研究[10]顯示,在急性肺損傷中,NEAT1與miR-182-5p存在靶向關系,NEAT1過表達可抑制其細胞活力,促進細胞凋亡和炎癥反應。miR-182-5p被證明與LN的進展有關,可調節腎臟纖維化[11]。然而,NEAT1與miR-182-5p在LN腎系膜細胞中的作用關系還不清楚。此外,叉頭盒蛋白O1(forkhead box O1,FoxO1)在LN患者和LN小鼠中處于激活狀態,說明FoxO1對LN進展起促進作用,而β-連環蛋白(β-catenin)位于FoxO1的下游,二者在炎癥環境下相互作用,FoxO1缺失會破壞FoxO1-β-catenin軸,進而阻礙炎癥的發生[12-13]。因此,本研究基于FoxO1/β-catenin通路,探討NEAT1對LN腎系膜細胞損傷的影響及其與miR-182-5p的調控關系,進一步揭示其發揮作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、主要試劑和儀器 人腎系膜細胞株,購自湖南豐暉生物科技有限公司;NEAT1小干擾RNA或過表達載體質粒(si-NEAT1/pcDNA-NEAT1)及相應對照(si-NC/pcDNA)、miR-182-5p模擬物(miR-182-5p mimics)和陰性對照miR-NC、miR-182-5p抑制物(anti-miR-182-5p)及陰性對照anti-miR-NC,購自上海生工生物公司;兔抗鼠FoxO1、β-catenin多克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗、酶聯免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒,購自美國Abcam公司;Lipofectamine2000試劑、酶標儀、流式細胞儀均購自美國BD公司;Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒、SYBR Premix Ex Taq II試劑盒,購自南京諾唯贊公司;細胞計數試劑盒8(cell counting kit 8,CCK-8)試劑、逆轉錄試劑盒,購自上海碧云天生物公司。CO2細胞培養箱,購自德國Eppendorf公司;超凈工作臺、實時定量PCR儀,購自美國伯騰儀器有限公司。

1.1.2 臨床樣本來源 收集2019年3月至2021年7月在涼山州第二人民醫院接受治療的32例經過腎穿確診的LN患者外周血,稱為LN組。其中,5例為Ⅰ型,8例為Ⅱ型,13例為Ⅲ型,6例為Ⅳ型。LN患者均符合1982年修訂的美國風濕病學會SLE分類標準,并且SLEDAI積分均>10分。按照SLEDAI評分標準評估疾病活動情況,同時符合排除標準。

排除標準:(1)藥物性狼瘡;(2)孕婦及哺乳期婦女;(3)合并其他自身免疫性疾病;(4)合并嚴重心、肺、腎臟等重要臟器病變及血液系統、內分泌系統相關疾病;(5)慢性感染及近期感染史;(6)惡性腫瘤。

同時,收集同期在本院體檢的32例健康者的外周血,稱為對照組。分別分離外周血單個核細胞和血清,置于-80℃冰箱保存待用。本研究方案經涼山州第二人民醫院倫理委員會批準進行(倫審科2019第(97)號),所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 細胞模型的制備、轉染及分組 取出凍存的腎系膜細胞復蘇,于37℃、5% CO2細胞培養箱中進行傳代培養,在超凈工作臺中,向細胞培養瓶中加入10%正常人血清和10%、15%、20% Ⅳ型LN患者血清繼續培養[14],96 h后,收集細胞,建立LN腎系膜細胞。然后用5 μg/mL細菌脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)[9]處理LN腎系膜細胞8 h。將構建好的LN腎系細胞膜采用Lipofectamine2000試劑進行轉染,并隨機分組為:對照組(正常培養,不轉染)、模型組(細胞中加入5 μg/mL 脂多糖繼續培養)、si-NC組(細胞轉染si-NC后加入5 μg/mL 脂多糖繼續培養)、si-NEAT1組(細胞轉染si-NEAT1后加入5 μg/mL 脂多糖繼續培養)、si-NEAT1+anti-miR-NC組(細胞共轉染si-NEAT1和anti-miR-NC后加入5 μg/mL 脂多糖繼續培養)、si-NEAT1+anti-miR-182-5p組(細胞共轉染si-NEAT1和anti-miR-182-5p后加入5 μg/mL 脂多糖繼續培養)。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time PCR,qRT-PCR) 取LN組和對照組外周血單個核細胞,采用逆轉錄試劑盒把提取的外周血單個核細胞總RNA反轉錄成cDNA,然后,根據qRT-PCR儀的使用說明利用SYBR Premix Ex Taq II試劑盒和特異性的定量引物進行PCR擴增。以GAPDH或U6作為內參基因,采用2-ΔΔCt方法計算NEAT1以及miR-182-5p、FoxO1、β-catenin mRNA的相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3 酶聯免疫吸附試驗 對臨床患者的血清和轉染后的各組細胞利用相關ELISA試劑盒檢測炎癥細胞因子:腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-1β(IL-1β)的濃度。

1.2.4 CCK-8實驗 收集轉染后的各組腎系膜細胞,將其置于96孔細胞板(1×105個細胞/孔)中過夜培養。然后,分別加入CCK-8(5 mg/mL)試劑10 μL,室溫下,繼續培養3 h。使用酶標儀,在450 nm處檢測各組細胞的吸光度值。

1.2.5 細胞凋亡實驗 將收集好的各組腎系膜細胞制備成懸浮液,依次加入Annexin V-FITC和PI溶液,避光反應15 min,接著使用流式細胞儀分析各組細胞凋亡情況。

1.2.6 LDH分析 收集各組細胞上清液,使用LDH檢測試劑盒測定各組細胞內LDH含量。

1.2.7 免疫印跡分析 提取細胞總蛋白并對其定量,接著使用SDS-PAGE電泳進行蛋白分離,然后轉膜,再加入脫脂奶粉進行封閉,1 h后,加入FoxO1、β-catenin、GAPDH一抗,次日加入對應二抗,使用ECL系統分析各組蛋白表達情況。

1.3 統計學方法 實驗數據均為計量資料,采用平均數±標準差的方式表示,采用SPSS 23.0軟件進行統計分析,兩組比較采用成組t檢驗(含校正t檢驗),多組比較采用單因素方差分析+兩兩比較HSD-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LN患者外周血單個核細胞中NEAT1、miR-182-5p、FoxO1和β-catenin mRNA的表達水平 與對照組比較,LN組患者外周血單個核細胞中NEAT1、FoxO1和β-catenin mRNA表達水平均顯著上升,miR-182-5p表達水平顯著下降(P<0.05),見表2。

表2 各組NEAT1、miR-182-5p、FoxO1和β-catenin表達水平

2.2 LN患者血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量 LN組患者血清中TNF-α、IL-6和IL-1β含量均顯著高于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 各組TNF-α、IL-6和IL-1β的含量

2.3 LN腎系膜細胞模型建立 與10%健康者血清組比較,10%、15%、20% LN患者血清組細胞活力均顯著升高(P<0.05),由于20% LN患者血清組細胞活力最高,故選擇20% LN患者血清誘導的LN腎系膜細胞模型,見表4。

表4 各組細胞活力比較

2.4 敲低NEAT1對LN腎系膜細胞模型細胞增殖、凋亡的影響 與對照組相比,模型組中NEAT1表達水平明顯升高,miR-182-5p表達水平明顯降低,細胞活力顯著上升(P<0.05);與模型組和si-NC組相比,si-NEAT1組中NEAT1表達水平和細胞活力明顯降低,miR-182-5p表達水平顯著升高(P<0.05);與si-NEAT1組和si-NEAT1+anti-miR-NC組比較,si-NEAT1+anti-miR-182-5p組中NEAT1表達水平和細胞活力顯著上升,miR-182-5p表達水平顯著下降(P<0.05);而各組細胞之間凋亡率差異無統計學意義(P>0.05),見圖1、表5。

2.5 敲低NEAT1對LN腎系膜細胞模型中炎癥因子的影響 較對照組而言,模型組中LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量均明顯升高(P<0.05);si-NEAT1組中LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量明顯低于si-NC組和模型組(P<0.05);si-NEAT1+anti-miR-182-5p組中LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量顯著高于si-NEAT1+anti-miR-NC組和si-NEAT1組(P<0.05),見表6。

2.6 各組細胞中FoxO1和β-catenin蛋白表達比較 模型組中FoxO1和β-catenin蛋白表達水平均顯著高于對照組(P<0.05);si-NEAT1組中FoxO1和β-catenin蛋白表達水平均明顯低于si-NC組和模型組(P<0.05);si-NEAT1+anti-miR-182-5p組中FoxO1和β-catenin蛋白表達水平均顯著高于si-NEAT1+anti-miR-NC組和si-NEAT1組(P<0.05),而si-NC組和模型組、si-NEAT1+anti-miR-NC組和si-NEAT1組間比較的FoxO1和β-catenin蛋白表達水平沒有顯著變化(P>0.05)。見圖2、表7。

注:A:對照組;B:模型組;C:si-NC組;D:si-NEAT1組;E:si-NEAT1+anti-miR-NC組;F:si-NEAT1+anti-miR-182-5p組

表5 敲低NEAT1對LN腎系膜細胞模型細胞增殖、凋亡的影響

表6 敲低NEAT1對LN腎系膜細胞模型中炎癥因子的影響

3 討論

LN是導致SLE發病和致死的重要原因[15],目前LN患者的治療方式主要是利用免疫抑制劑、B細胞調節療法或鈣調磷酸酶抑制劑[16]。有研究表明,LncRNA與多種疾病包括LN的發生、發展密切相關。據報道[17],LncRNA NEAT1在敗血癥肝損傷患者中高表達,且抑制NEAT1表達可降低體外炎癥細胞因子的水平。在非酒精性脂肪肝模型中,NEAT1表達上調,其過表達可通過靶向調控miR-146a-5p進而促進脂質積累[18];另外,NEAT1和miR-140協同作用可加劇非酒精性脂肪肝進展[19]。Zhang等[20]的研究顯示,NEAT1在SLE患者中高表達,NEAT1表達的增加可能導致SLE患者產生IL-6等大量細胞因子和趨化因子。而且,在LN中NEAT1可加速腎系膜細胞損傷[9]。但是,其在LN中的分子機制尚不完全清楚。因此,本研究首先以收集的LN患者的外周血單個核細胞和血清為研究對象來檢測NEAT1和炎癥因子的表達情況,結果顯示,與對照組比較,LN組患者外周血單個核細胞中NEAT1表達水平和血清中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量均顯著上升,說明NEAT1促進LN發展。腎系膜細胞可調節機體的免疫反應,能夠影響炎癥環境,是致使LN發生腎小球纖維化損傷的重要因素。本研究通過向腎系膜細胞中加入10%正常人血清和10%、15%、20%的Ⅳ型LN患者血清繼續培養,發現20% LN患者血清組細胞活力最高。因此,本研究選擇20% LN患者血清來構建LN腎系膜細胞模型。接著,本研究采用LPS誘導LN腎系膜細胞,結果顯示,模型組細胞活力顯著升高,炎癥因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)含量明顯增加,揭示LPS可促進LN腎系膜細胞增殖和炎癥因子的釋放,而細胞損傷標志物LDH含量的顯著升高,說明LPS能夠促進LN腎系膜細胞損傷,提示體外LN腎系膜細胞損傷模型構建成功。

注:A:對照組;B:模型組;C:si-NC組;D:si-NEAT1組;E:si-NEAT1+anti-miR-NC組;F:si-NEAT1+anti-miR-182-5p組

表7 各組細胞中FoxO1和β-catenin蛋白表達比較

LncRNA通常與miRNA相互作用進而調控細胞的增殖、凋亡、損傷等過程[21]。已有研究[10]表明,NEAT1靶向負調控miR-182-5p水平,敲低NEAT1能改善急性肺損傷進展。另外,Zhu等[22]研究也表明,在LPS刺激的急性肺損傷小鼠和RAW264.7細胞中,miR-182-5p表達降低,且其過表達可通過減少炎癥因子的釋放而抑制炎癥反應。而miR-182-5p在LN中發揮重要的調控作用[11]。故本研究以NEAT1和miR-182-5p的靶向關系為基礎,進而探討二者在LN腎系膜細胞損傷中的作用和調控機制。結果顯示,LN患者外周血單個核細胞和LN腎系膜細胞中NEAT1的表達均顯著升高,miR-182-5p的表達均顯著降低,二者趨勢正好相反,提示在LN中,NEAT1可能通過調控miR-182-5p發揮作用。敲低NEAT1后,細胞中NEAT1表達水平、細胞活力以及LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量均明顯降低,miR-182-5p表達水平顯著升高,凋亡率差異不大,說明抑制NEAT1表達能夠抑制細胞增殖和炎癥反應的發生。而在敲低NEAT1的基礎上抑制miR-182-5p表達后,細胞活力及LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β含量均顯著上升,但凋亡率無明顯變化,揭示抑制miR-182-5p表達可減弱NEAT1敲低對LN腎系膜細胞損傷模型細胞增殖和炎癥因子的影響,進一步表明敲低NEAT1通過靶向調節miR-182-5p水平減輕了LN腎系膜細胞模型細胞損傷。但是,NEAT1靶向miR-182-5p減輕細胞損傷的具體機制還不清楚,還需進一步研究。

Wang等[11]研究表明,FoxO1在SLE患者中高表達,既是miR-182-5p的靶基因,也是腎功能的保護因子;同時,Wang等[23]發現,LINC01018能夠通過吞噬miR-182-5p上調FoxO1,抑制肝癌細胞的增殖和周期進展。而FoxO1/β-catenin通路與氧化應激過程關系密切,抑制FoxO1/β-catenin通路能夠促進細胞凋亡和損傷[24]。FoxO1與β-catenin協同作用,激活Wnt/β-catenin信號進而促進肝癌進展[25]。LPS刺激后巨噬細胞中Foxol和β-catenin蛋白表達增加,髓系FoxO1缺失消除了FoxO1與β-catenin的相互作用,進而抵抗氧化應激誘導的肝細胞損傷[13]。本研究發現,FoxO1和β-catenin mRNA表達水平在LN組患者外周血單個核細胞中明顯升高;敲低NEAT1后,FoxO1和β-catenin蛋白表達水平明顯降低,而抑制miR-182-5p表達可減弱NEAT1敲低對FoxO1和β-catenin蛋白表達的影響,揭示敲低NEAT1通過靶向上調miR-182-5p表達,抑制FoxO1和β-catenin蛋白表達,進而減輕LN腎系膜細胞模型的細胞損傷。

綜上所述,敲低NEAT1可通過負調控miR-182-5p表達,抑制LN腎系膜細胞過度增殖,降低炎癥反應,其可能與FoxO1、β-catenin下調表達有關,NEAT1有望成為LN治療的靶標,為研究LN的發展機制提供新思路。但是,本研究還存在一些不足之處,首先,LN患者血清中本身可能存在較高的炎癥因子水平,而本研究以LN患者血清建立的體外LN腎系膜細胞模型為基礎來觀察LPS誘導后炎癥因子的表達情況,并不能完全排除血清本身的影響。其次,本研究只是在體外探討了NEAT1的功能,NEAT1在體內是否具有同樣的作用還需進一步研究。

利益相關聲明:所有作者聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻說明:張路路進行了論文選題、試驗設計、數據采集及論文初稿撰寫等工作。謝銳和廖志敏為實施試驗、數據提取、數據分析和統計分析提供了協助。吳剛和萬波進行了文獻檢索和論文編輯等工作。孫威和周蓮紅進行了論文審查與修訂等工作。