染色體微陣列分析和全外顯子組測序在產前罕見疾病診斷中的應用

李永麗,李華鋒

(臨沂市婦幼保健院,山東 臨沂 276000)

近年來,隨著分子生物學技術的發展,以染色體基因芯片和全外顯子組測序為代表的高通量基因組檢測技術正快速被應用于遺傳性罕見病的診斷[1]。染色體微陣列分析(Chromosomal microarray analysis,CMA)又稱基因芯片技術,是檢測拷貝數變異(Copy number variation,CNV)引起罕見病的有效手段。全外顯子組測序(Whole-exome sequencing,WES)是目前單基因遺傳病確診的重要手段,但由于有限的產前表型信息,對次要發現解釋的困難以及檢測費用昂貴、技術耗時的性質,推遲了WES在產前胎兒異?；蛟\斷中的應用,相關研究數據較少。本研究采用CMA對高危孕婦進行檢測,分析致病CNV的變異和類型,對CMA檢測陰性者建議進一步行WES檢測,探討二者在產前罕見疾病診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月—2023年10月來本院醫學遺傳科就診的4845例孕婦,年齡15～50歲,平均(31.25±5.66)歲;孕16～34周,平均(20.93±4.65)周。納入標準:具有產前診斷指征;均接受詳細的遺傳咨詢;行羊水、絨毛CMA檢測。風險指征包括:血清學篩查風險增加、高齡產婦、超聲異常、無創產前檢查(NIPT)異常、夫婦核型異常、產科病史等。本研究經醫院倫理委員會審批,孕婦簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1DNA提取 行羊膜腔穿刺術抽取羊水或通過絨毛活檢術采集絨毛,從絨毛、羊水中采用天根DNA提取試劑盒提取基因組DNA,嚴格按照試劑盒說明書操作。DNA備份用于WES檢測。同時采集胎兒父母外周血提取DNA用于基因位點驗證。

1.2.2染色體微陣列分析 實驗反應流程參照Affymetrix公司提供的實驗操作流程。實驗采Affymetrix CytoScan750K Array芯片,選用GeneChip3000 Scanner 7G進行掃描,ChAS3.2 軟件用于陣列圖像分析。所有CNV均參照美國國家生物技術信息中心人類基因組GRCh37(hg 19)版本進行描述,并與本地數據庫和在線公共數據進行深度的檢索和判讀。根據美國醫學遺傳學和基因組學學會(ACMG)對CNV的判讀進行致病性分類。CMA檢測陰性者選擇行WES檢測。

1.2.3全外顯子組測序 使用靶向捕獲技術及高通量測序進行WES分析。OmniSeek?探針進行全外顯子捕獲,Illumina測序平臺進行高通量測序,測序數據質控后經bwa軟件比對、GATK軟件檢測變異后,用Flash Analysis在線軟件系統進行變異過篩及解釋。將WES所測得的可疑致病突變在父母中進行Sanger測序,以驗證WES結果的準確性。根據ACMG指南進行基因變異致病性分類。

2 結果

2.1CMA檢測情況 4845位孕婦樣本中,4683例為羊水樣本,159例為產前絨毛樣本。其中2例因樣本母血污染、1例DNA純化濃度過低檢出失敗,其余4842例樣本全部檢測成功。共檢測出染色體異常537例,檢出率為11.09%(537/4842),經分析明確致病性變異的為370例,包括非整倍體214例,致病性CNV 134例和部分CNV嵌合22例。非整倍體檢出情況見表1。CNV相關疾病主要涉及1q21缺失綜合征(7例)、DiGeorge 綜合征(6例)、17q12缺失綜合征(6例)、Cri-du-chat綜合征(5例)、16p11.2缺失綜合征(5例)。詳見表2。

表1 CMA檢測214例染色體非整倍體

表2 CMA診斷的微缺失/微重復綜合征

2.2WES檢測情況 68例孕婦在CMA檢測陰性的基礎上進一步行WES檢測,其中13例胎兒診斷出基因變異,陽性檢出率為19.12%(13/68),其中3例為新發變異,7例遺傳父母變異,3例遺傳模式未知。檢出的基因變異相關的常染色體隱性疾病5例,主要為TH、MYH3、FKTN、RYR3、SMPD1基因;檢出X連鎖隱形遺傳病3例,主要為KDM5C、MED12和P1CAM變異;檢出常染色體顯性遺傳病5例,主要為CIC、PTCH1、FBN2、PKD1、FGFR3基因,其中4例均為產前超聲結構異常,1例為不良孕產史。隨訪后,9位孕婦選擇終止妊娠,其余選擇繼續妊娠。見表3。

3 討論

由于遺傳性罕見病可能與所有類型的遺傳變異有關,包括非整倍體、單親二體、CNV和基因內突變,因此檢測方法也多種多樣。傳統的產前細胞遺傳學分析是檢測染色體核型異常的一線方法。但在過去的10年里,CMA越來越多地被用于產前診斷中檢測亞顯微致病性CNV變異。本研究中,CMA的陽性檢出率為11.09%,其中明確致病性的CNV為7.64%,經分析CMA檢測出染色體非整倍體214例,檢出致病性CNV134例,部分CNV嵌合22例。CNV異常相關疾病檢出最多的為1q21缺失綜合征,其次為DiGeorge 綜合征、17q12缺失綜合征、Cri-du-chat綜合征、16p11.2缺失綜合征等。此外,CMA在發現有臨床意義的基因組CNV的同時也檢測出3.45%的意義不明確變異。

隨著分子診斷技術的進步,高通量測序技術也被應用于產前診斷中進行罕見疾病的診斷。目前,WES主要應用于超聲診斷結構異常的胎兒產前診斷,能成功診斷3.6%～6.2%的孤立超聲結構異常和14.3%～16%的有多器官系統影響的胎兒[2]。在本研究中,48例產前表型為胎兒超聲結構異常,檢出結構異常表型和基因型相關的有2例,其中1例胎兒臨床表現為腦畸形、腦積水,WES檢測出FKTN純合變異相關的Walker-Warburg綜合;1例胎兒產前超聲檢測出四肢短小,WES檢測出FGFR3雜合變異,可引起嚴重軟骨發育不全伴發育遲緩及黑棘皮癥。許多孟德爾遺傳疾病沒有已知的產前表型,且胎兒產前表型獲得的信息有限,某些胎兒產前表型與檢測出臨床表型沒有明顯的相關性,但提示胎兒患病的風險較高。此次檢出1例胎兒TH基因復合雜合變異,胎兒產前診斷表型為NF增厚,提示胎兒患Segawa綜合征風險高;在1例NT增厚的胎兒中檢出MYH3復合雜合變異,相關疾病為攣縮、翼狀胬肉和跖椎融合綜合征1B型和遠端關節攣縮。

綜上所述,產前WES檢測可以增加胎兒異常情況下的診斷率,還具有將已知疾病表型擴展到產前表型的潛力。而每一種形式的產前篩查或診斷方法都有其風險、益處和局限性。在產前 WES的檢測中,不能對所有異常的表型進行診斷。WES不用于檢測非整倍性、多倍體,也不用于檢測易位、三核苷酸重復或低水平的嵌合體等;WES也不能準確檢測CNV,仍需要結合CMA技術[3]?？傊?在產前診斷中應用CMA和WES檢測出表型多樣的罕見病家系,降低了染色體病、嚴重遺傳病等的發病率,對出生缺陷的防控具有重要意義。