β-溶血性鏈球菌對紅霉素、克林霉素耐藥性及對大環內酯類抗生素耐藥機制研究

(1山東醫學高等?？茖W校,山東 臨沂 276000;2臨沂市人民醫院;3山東醫專附屬醫院)

β-溶血性鏈球菌(Beta-hemolytic streptococci,BHS)主要定植于呼吸道、皮膚、陰道等處,是最常見的社區感染性病原菌之一。紅霉素等大環內酯類抗生素廣泛用于該菌感染的臨床治療,其耐藥問題也引起人們的廣泛關注。為了解BHS耐藥特性,本研究對其耐紅霉素、克林霉素特征進行分析,并檢測對大環內酯類藥物耐藥基因ermB、mefA,分析其耐藥表型與耐藥基因的相關性,為臨床醫生選擇合理抗菌藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1菌株來源及鑒定 收集本院2020年6月-2021年12月從門診及住院患者痰液、咽拭子、膿性分泌物等標本分離的BHS,共64株。將標本接種于哥倫比亞血瓊脂培養基,置于5% CO2、37℃培養箱中24 h,使用VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統及溶血性鏈球菌血清鑒定試劑盒進行鑒定。

1.2抗菌藥物敏感性試驗 采用紙片擴散法測定其對紅霉素、克林霉素的耐藥性,挑取分純的新鮮菌落懸浮于生理鹽水中,震蕩混勻后使用麥氏比濁儀,調整濁度為0.5麥氏濃度,將菌液均勻涂布于整個哥倫比亞血瓊脂培養基表面,待水分吸收后將藥敏紙片貼于培養基表面,紙片中心距培養基邊緣不少于15 mm,貼上紙片后將平板倒置,放于37℃溫箱中培養。24 h后測量抑菌圈直徑,其結果判讀參照美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)M100-S29指南。質控菌株為肺炎鏈球菌ATCC49619,購于美國菌種保藏中心。

1.3細菌處理 將細菌分純培養后,用無菌接種環刮取適量新鮮細菌,加入含有無菌去離子水的EP管中,制成懸液,振蕩混勻后100℃加熱10 min,高速離心10 min后使用移液槍小心吸取上清液(即為提取的DNA)。測定DNA濃度與純度后,置于-20℃冰箱中保存備用。

1.4聚合酶鏈式反應(PCR)擴增 采用軟件Primier.5設計部分耐藥基因引物,引物委托上海生工生物有限公司合成,利用PCR法對大環內酯類藥物相關耐藥基因ermB、mefA進行擴增。PCR反應體系為50μL,PCR擴增體系為:2×Taq Master Mix 25μL;上下游引物各0.5μL,模板2μL,ddH2O 22μL;反應條件:94℃預變性3 min,94℃、30s,退火45s,72℃延伸90s,30個循環,72℃延伸7 min。將產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。耐藥基因引物序列及產物大小見表1。

表1 耐藥基因PCR引物序列

2 結果

2.1藥物敏感性實驗及耐藥表型 BHS對紅霉素耐藥率為85.9%,對克林霉素耐藥率為87.5%。其中82.8%對紅霉素、克林霉素均表現為耐藥。其中C群鏈球菌(GCS)對紅霉素耐藥率最高,其次是A群鏈球菌(GAS)。B群鏈球菌(GBS)、GCS對克林霉素耐藥率最高,其次是GAS。F群鏈球菌(GFS)對二者耐藥率較低。見表2。

表2 β-溶血性鏈球菌對紅霉素、克林霉素藥物敏感性(%)

2.2耐藥基因檢測結果 ermB基因陽性率為84.4%,其中GCS、GFS對該基因攜帶率最高均為100%。mefA基因陽性率為3.1%,均在紅霉素耐藥菌株中檢出。另有1株GBH同時攜帶ermB、mefA基因,7株紅霉素敏感菌株中檢出ermB基因,與耐藥表型不符。見表3,部分耐藥基因擴增結果如圖 1所示。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增引物結果

表3 β-溶血性鏈球菌對紅霉素耐藥基因分布情況(%)

3 討論

BHS可引起人類急性扁桃體炎、咽峽炎、丹毒、猩紅熱、產后感染等,也可合并其它細菌感染引起混合性感染。依據細胞表面C-多糖抗原的血清凝集原理,可將其分為A、B、C、D、F、G等不同亞型。青霉素是治療BHS的首選用藥,但對于對青霉素耐藥及過敏者,紅霉素及克林霉素為治療該菌感染的二線推薦用藥。隨著免疫抑制劑、廣譜抗生素的廣泛應用,BHS對紅霉素、克林霉素的耐藥性也引起學者的廣泛關注。樊節敏等[1]報道的安徽地區GAS對紅霉素、克林霉素耐藥率分別為55.0%和70%。2018年CHINET中國細菌耐藥性監測報告顯示,各組鏈球菌屬對紅霉素和克林霉素的耐藥率均在56%以上,其中A組BHS對上述兩藥的耐藥率可達90%以上[2]。本研究中BHS對紅霉素、克林霉素耐藥率分別高達85.9%和87.5%,與黃青等[3]報道類似。其中克林霉素的耐藥率較高,可能與大環內酯類藥物存在的交叉耐藥有關。另外本研究中GAS對紅霉素耐藥率也達90%以上,與全國耐藥監測報道數據相同。其中GCS對紅霉素耐藥率為100%,GBS、GCS對克林霉素耐藥率均為100%,高于張金一等報道[4]。

GBS對大環內酯類耐藥機制主要有:erm基因介導的核糖體糖蛋白甲基化,導致藥物與核糖體親和力下降,使菌株產生耐藥;mef基因介導的主動外排機制,該基因可誘導紅霉素主動排出細胞外,阻止紅霉素在菌株內聚集,導致菌株對紅霉素表現耐藥。黃青等[3]報道的安徽地區ermB、mefA基因檢出率分別為45.2%、31.1%,其中GAS、GBS、GGS中ermB基因檢出率分別為46.1%、45.2%、60%。本研究中ermB基因檢出率為84.4%,mefA基因檢出率為3.1%,其中只有GCS紅霉素敏感菌株的ermB基因為陰性,GAS、GBS、GGS、GFS在紅霉素耐藥及敏感菌株中均出現ermB陽性情況,與耐藥表型不符。這可能是由于紅霉素對BHS作用靶點發生突變導致甲基化為無效修飾或存在某些抑制ermB基因表達的因素有關,具體耐藥機制有待于進一步研究。另有1株紅霉素耐藥的GFS同時攜帶ermB、mefA基因,說明BHS對紅霉素的耐藥由多個基因共同引起。

綜上所述,本地區BHS對紅霉素、克林霉素耐藥率較高,且存在多重耐藥現象。引起大環內酯類藥物耐藥與ermB基因無明確相關性,并存在多種耐藥基因共同參與的現象,這對臨床治療BHS感染帶來一定的挑戰。因此,對BHS感染者應適當減少紅霉素、克林霉素的使用,并依據藥敏結果指導臨床用藥。