乳清濃縮蛋白對松仁蛋白溶解度及其乳液穩定性的影響

劉文超, 楊 凱, 趙玉紅,3,*

(1.東北林業大學 生命科學學院, 黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江省林業科學研究所, 黑龍江 哈爾濱 150081;3.黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室, 黑龍江 哈爾濱 150040)

紅松(Pinuskoraiensis)是松屬松科植物,又稱海松、果松、朝鮮松,是中國珍貴的用材樹種之一,產于長白山、小興安嶺天然林中,在俄羅斯、日本、朝鮮、韓國也有分布。紅松種子含油脂,“中國紅松子”口味好,并有滋補、祛風寒等功效,是傳統出口食品,享有美譽。紅松的松子仁中蛋白質的質量分數約為16.5%,松二蛋白是一種營養價值較高的植物蛋白,具有氨基酸比例合理[1]、降血糖[2]、抗氧化[3]等優點。目前對松仁蛋白的研究主要集中在制備功能性肽、加工食品、功能性質以及蛋白改性等方面[4-7]。

天然松仁蛋白(pine kernel protein,PKP)乳液的穩定性較差,易出現絮凝、分層等不良現象。PKP的溶解度較差、乳化性能不佳,束縛了松仁蛋白在食品生產中的應用范圍。有研究對松仁蛋白進行磷酸化改性,以提高其乳化性[8];然而化學修飾會損壞蛋白的一級結構,可能產生不受歡迎的副產物[9]。也有使用加壓、烤制等物理方法提高松仁蛋白功能特性的研究[10-11],但生產工藝復雜、加熱蛋白變性等問題依然可能存在。

研究發現,蛋白質-蛋白質相互作用可改善蛋白質的功能特性,如酪蛋白和大米蛋白[12]、小麥面筋蛋白和大豆分離蛋白[9]、大豆蛋白和水稻蛋白[13]等的相互作用,改善了蛋白質的溶解性和乳化性。乳清濃縮蛋白(whey protein concentrate,WPC)具有營養價值高、易于消化、生物利用度高、較高的溶解度和親水性的特點[14],是制備復合蛋白的較佳選擇。Alrosan等[15]研究發現將乳清分離蛋白(whey protein isolate,WPI)按照一定的比例添加到小扁豆蛋白中,通過蛋白質復合物分子間作用力(靜電相互作用、疏水相互作用和氫鍵)的作用,小扁豆蛋白的溶解度可提高到90%以上。Wang等[16]在研究水稻蛋白和WPI的相互作用時也發現WPI的加入可使水稻蛋白的溶解性顯著提高。李良等[17]采用大豆分離蛋白-WPI作為乳化劑制備水包油型(O/W型)乳液,發現添加WPI后顯著改善了乳液的穩定性。其他研究也發現,WPI易與其他植物蛋白相互作用形成復合蛋白,WPI制得的復合蛋白乳液具有良好的乳液穩定性[18-19]。目前,關于松仁蛋白和乳清濃縮蛋白相互作用提高松仁蛋白的溶解度和乳液穩定性的研究尚未見報道。

本研究通過制備可溶性松仁蛋白-乳清濃縮蛋白(pine kernel protein-whey protein concentrate,PKP-WPC)復合蛋白,研究復合蛋白的結構變化,了解松仁蛋白和乳清濃縮蛋白之間相互作用的機制及二者產生穩定O/W型乳液的可行性。希望可為新型蛋白產品的研發提供理論基礎,拓寬松仁蛋白在加工食品中的應用范圍,推動PKP-WPC雙蛋白乳液研究的發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅松松子由黑龍江省林科院提供;乳清濃縮蛋白(蛋白質質量分數為78.79%),天津銀河偉業進出口有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、β-巰基乙醇,北京索萊寶生物科技有限公司;考馬斯亮藍G-250、尼羅藍、尼羅紅,上海源葉生物科技有限公司;硫脲、氯化鈉、8-苯胺基-1-萘磺酸鈉(ANS),上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TDL-40B-W型高速離心機,上海恒勤儀器設備有限公司;722型紫外-可見分光光度計,上海光譜儀器有限公司;FD5-2.5E型冷凍干燥機,北京金西盟儀器有限公司;LS55型熒光分光光度計,美國PE公司;Chirascan V10型圓二色譜儀,英國應用光物理公司上海代表處;90Plus型Zeta電位分析儀,美國布魯克海文儀器公司;FA25型高剪切分散乳化機,上海歐河機械設備有限公司;90Plus型Brookhaven激光粒度儀,美國布魯克海文儀器公司;LSM800型激光共聚焦顯微鏡,北京創誠致佳科技有限公司;AR2000ex型旋轉流變儀,美國TA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1脫脂松仁粕預處理

紅松松子手工去殼皮,粉碎機打碎,索氏抽提法去油,通風櫥中室溫風干,干燥的松仁粕粉碎,過60目篩,4 ℃儲存備用。

1.3.2松仁蛋白的提取

參考Yan等[20]方法并略作改動。按m(脫脂松仁粕)∶V(蒸餾水)=1∶10 g/mL的料液比溶解,用1.0 mol/L NaOH將懸浮液調節至pH值為 9.0,在室溫下磁力攪拌1 h,4 000 r/min離心15 min,收集上清液。用1.0 mol/L HCl將上清液的pH值調節至4.6,磁力攪拌1 h,4 000 r/min離心15 min,收集沉淀。將沉淀的蛋白質調至中性,冷凍干燥,-20 ℃保存備用。

1.3.3松仁蛋白-乳清濃縮蛋白復合蛋白的制備

參考He等[9]方法并略作改動。在室溫下,將1.0 g PKP分散在100 mL去離子水中,獲得質量分數為1.0%的懸浮液,分別加入0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 g的WPC,制成PKP與WPC質量比為1.0∶0.1、1.0∶0.5、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0的水溶液。用1.0 mol/L NaOH調節pH值至12.0,磁力攪拌2 h以確保充分水合。水合的蛋白溶液用0.1 mol/L HCl緩慢中和至pH值為7.0,10 000 r/min離心10 min,收集的上清液為復合蛋白原液;使用3 400 Da的透析袋透析24 h以除去多余的鹽,冷凍干燥,即為PKP-WPC復合蛋白。除非另有說明,以下表征均用新鮮制備的上清液進行實驗。為了進行比較,PKP和WPC與上述樣品平行處理,作為對照,與復合物一起進行表征。

1.3.4松仁蛋白溶解度的測定

蛋白質的溶解度采用氮溶解指數(nitrogen solubility index,NSI)表示[21]。將pH循環后的PKP-WPC復合蛋白10 000 r/min離心10 min,收集上清液和沉淀物,凱氏定氮法進行氮測量。松仁蛋白的NSI計算方法見式(1)。

(1)

式(1)中,mp為松仁蛋白的初始質量,g;mk為離心后沉淀物中的蛋白質質量,g。

1.3.5復合蛋白分子質量的測定

參照Mohamed等[22]方法略作修改。采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)對PKP、WPC、不同復配比例的復合蛋白的蛋白質分子質量進行鑒定分析。取樣品溶液,用去離子水稀釋至質量濃度為5.0 mg/mL,按1∶1的體積比加入上樣緩沖液,100 ℃下煮沸5 min。上樣量為20 μL,分離膠質量分數為12%,濃縮膠質量分數為5%。開始電壓為80 V, 進入分離膠后為120 V,電泳時間約2.5 h。電泳后,用考馬斯亮藍R-250染色。離心后產生的沉淀也通過SDS-PAGE進行檢測。

1.3.6復合蛋白結構的測定

1.3.6.1 內源性熒光光譜的測定

參考He等[9]的研究方法采用熒光分光光度計測定蛋白質的三級結構變化。分別用pH值為12.0、11.0、10.0、9.0、8.0、7.0的去離子水將樣品溶液質量濃度稀釋至0.01%,使用熒光分光光度計在280 nm的激發波長下獲得300～450 nm波長范圍內的熒光光譜。狹縫寬度為10 nm。

1.3.6.2 紫外-可見光譜的測定

參考Wang等[12]的研究方法采用紫外-可見光譜測定蛋白質的立體構象變化情況。分別用pH值為12.0、11.0、10.0、9.0、8.0、7.0的去離子水將樣品溶液質量濃度稀釋到0.01%。使用紫外-可見分光光度計在波長為190～350 nm處獲得蛋白質溶液的紫外光譜。

1.3.6.3 圓二色譜的測定

參考Wang等[16]的研究方法采用圓二色譜儀測定蛋白質的二級結構變化。將復合蛋白溶液分別用pH值為12.0、11.0、10.0、9.0、8.0、7.0的去離子水將質量濃度稀釋至0.5 mg/mL。波長為190～250 nm,使用0.1 cm的石英比色皿,掃描參數為:步長0.1 nm,平均時間2 s,平均掃描3次。蛋白質二級結構含量通過與已知構象的蛋白質數據庫的光譜線性擬合進行計算。

1.3.7復合蛋白表面性質的測定

1.3.7.1 表面疏水性的測定

用ANS作為熒光探針測定蛋白質的表面疏水性[23]。用濃度為10 mmol/L的PBS緩沖液(pH=7.0)制備質量濃度為0～2 mg/mL的樣品溶液。將3 mL樣品溶液與30 μL濃度為 8.0 mmol/L ANS溶液混合。激發波長為390 nm,發射波長為470 nm,記錄熒光強度,激發和發射狹縫寬度為10 nm。

1.3.7.2 ζ-電位的測定

參考Yan等[24]的方法略作修改,采用ζ-電位分析儀測量蛋白質溶液的ζ-電位,上樣體積為1 mL,溫度平衡時間為2 min。測試條件為:溫度為25 ℃、散射角為173°、蛋白質和分散介質的折射率分別為1.45和1.33、電導率范圍為 0～200 ms/cm。

1.3.8乳液的制備

參考Turan等[25]的方法略作修改,以蛋白溶液為原料,分別模擬牛奶、冰淇淋和奶油的含油量,制備油相體積分數為3%、10%和50%的乳液。將所需量的大豆油和蛋白溶液混合,于高剪切分散乳化機16 000 r/min處理3 min,每隔20 s停頓1次,得到最終的乳液。

1.3.9乳液性質的測定

1.3.9.1 乳液平均粒徑的測定

參考Shao等[26]的方法,采用Brookhaven激光粒度儀測定乳液的平均粒徑。樣品乳液用質量濃度為10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)稀釋100倍,以避免多重光散射效應的影響。分散介質為水,顆粒折射率為1.46,分散介質折射率為1.33,吸收參數為0.001,測試溫度為25 ℃。

1.3.9.2 乳液ζ-電位的測定

參考Shi等[27]的方法略作修改。樣品乳液用質量濃度為0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)稀釋100倍。測定方法參考1.3.7.2節。

1.3.9.3 乳液乳層析指數的測定

參考Benetti等[28]的方法測定乳液乳層析指數。室溫條件下將制備好的樣品靜置10 d,分別在第0、1、3、7、10 天的同一時刻記錄乳液在比色管分層界面的刻度,用以衡量乳液分離的程度。乳層析指數(CI)的計算見式(2)。

(2)

式(2)中,HC為清液高度,cm;HE為乳液總高度,cm。

1.3.9.4 乳液微觀結構的測定

參考Zhang等[18]的研究方法采用激光共聚焦顯微鏡測定乳液的微觀結構。將20 μL質量分數為1%的尼羅藍和20 μL質量分數為0.1%的尼羅紅染液混合,吸取1 mL乳液樣品與40 μL混合染液避光染色30 min。將10 μL染色乳液樣品滴到載玻片上,用蓋玻片覆蓋。使用10倍放大透鏡觀察樣品,利用Ar/Kr和 He/Ne雙通道激光模式采集圖像,對于蛋白質和油,氬-氪和氦-氖激光激發波長分別為488 nm和633 nm。

1.4 數據處理

所有實驗重復3次。組間差異顯著性采用t檢驗分析(P<0.05),數據統計分析采用SPSS 20.0軟件,用Origin 2018、Excel軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 松仁蛋白溶解度分析結果

通過在pH 值為12.0條件下共溶PKP和WPC,并在pH值為7.0條件下重新收集,制備了可溶性復合蛋白。PKP的NSI大致計算為溶解在溶液中的PKP質量與反應中使用的初始PKP質量的百分比,實驗結果見圖1。由圖1 (a)可知,PKP(對照)的溶解度為48.53%,添加WPC后,溶解度顯著提高,當PKP與WPC質量比為1.0∶1.0時,PKP的溶解度為92.43%。減少乳清濃縮蛋白添加量會導致蛋白質混合物顯著沉淀,而乳清濃縮蛋白添加量的進一步增加不會顯著改變PKP的溶解度。這一現象與Wang[12]研究的添加酪蛋白對水稻蛋白的溶解度的影響一致。值得注意的是,制備的復合蛋白可以完全溶解在水中 [圖1 (b)]。以溶解度為評價指標,最終選擇了PKP與WPC質量比為1.0∶1.0的比例進行后續實驗。

圖1 WPC對PKP溶解度的影響Fig.1 Effect of WPC on solubility of PKP

2.2 復合蛋白分子質量分析結果

用SDS-PAGE研究了蛋白質亞基對復合蛋白形成的貢獻,結果見圖2。由圖2可知,幾乎所有的WPC亞基都溶解在上清液中,并在與PKP相互作用后進一步收集,因此,WPC的不溶性亞基的數量可被忽略;PKP在23、33、53 kDa處有顯著的蛋白條帶,這與Adelina[29]觀察到的PKP亞基條帶一致。WPC(第3條通道)的電泳圖顯示,在16 kDa和66 kDa處有清晰的亞基條帶,Wang等[16]在研究WPI的電泳圖時也看到了類似的條帶。通過以不同的比例將PKP和WPC構建成復合物,PKP和WPC的亞基條帶清晰地呈現在通道4～8中,表明復合蛋白完整保留了2種蛋白質的亞基。隨著WPC添加量的增加,16 kDa處的條帶因其更多地并入PKP而變得更加明顯。Wang等[13]也報道過類似的結論,復合蛋白含有來自2種原始蛋白質的蛋白質亞基,其分子質量沒有顯著變化,表明本研究中的pH循環誘導的蛋白質-蛋白質相互作用能有效保證2種蛋白質的分子完整性。

通道1～3分別為 Marker、PKP和WPC,4～8表示PKP與WPC質量比分別為1.0∶0.1、1.0∶0.5、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0構建的復合蛋白。

2.3 復合蛋白結構分析結果

2.3.1內源性熒光光譜分析結果

對中和至pH值為 7.0的復合蛋白進行熒光光譜分析,以證明PKP和WPC之間的蛋白質-蛋白質相互作用,這可以區分這種結構反應與兩種蛋白質的簡單混合,實驗結果見圖3。由圖3(a)可知,PKP和WPC在338 nm處都有一個明顯的峰值強度(Fmax),這是色氨酸的主要發射。PKP在280 nm激發下具有較高的Fmax,然而,添加WPC后,該峰強度基本上被猝滅,大量研究證實,蛋白質與外來物質的相互作用明顯地淬滅了蛋白質的固有熒光[30],這表明PKP和WPC是相互作用的。隨著酸化過程的進行,Fmax逐漸增大 [圖3 (b)],表明蛋白質被還原成更高階構象。最終,熒光強度在pH值為 7.0時達到頂峰,但仍然遠低于對照PKP,表明PKP與WPC相互作用發生三級結構變化,PKP的結構復性受到WPC的抑制。

圖3 蛋白樣品的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of protein samples

為了探究形成復合蛋白所參與的具體非共價作用力,在pH循環之前向樣品中添加NaCl、硫脲和SDS三種阻斷劑。上述阻斷劑的不同處理導致蛋白質復合物之間或內部不同分子力的破壞,并且可以通過熒光發射光譜反映出來。由圖3 (c)可看出,富含NaCl的反應蛋白溶液的熒光強度最高,其次是富含硫脲和SDS的反應蛋白溶液,這表明在PKP-WPC復合蛋白中,靜電力是主導力,其次是氫鍵和疏水力。Alrosan等[15]在研究小扁豆蛋白和WPI之間的相互作用時也發現靜電力占主導地位。因此,PKP和WPC的復合主要受靜電相互作用的影響,有氫鍵和疏水相互作用的輔助,但影響程度較小。當PKP與WPC反應的pH值降低時,PKP與WPC之間形成靜電相互作用、氫鍵和疏水相互作用,控制PKP與WPC之間的相互作用。因此,這些分子力可能有利于PKP-WPC復合蛋白的形成。

2.3.2紫外-可見光譜分析結果

紫外-可見光譜對蛋白質構象很敏感。蛋白質構象折疊與230 nm處的吸光度有關,折疊的構象在230 nm處的吸光度比未折疊的構象要強[31],蛋白質的紫外-可見光譜結果見圖4。

圖4 蛋白樣品的紫外-可見光譜Fig.4 UV-Vis spectra and secondary structure of protein samples

由圖4(a)可知,復合蛋白的A230顯著低于PKP,說明復合蛋白中含有未折疊的蛋白基團,其抗折疊能力強。PKP-WPC復合蛋白的pH值降低導致A230的增加[圖4(b)],這證明了蛋白質的重新折疊,Wang等[16]在研究WPI與水稻蛋白相互作用時也發現:酸化使A230顯著增長,蛋白質發生了重折疊。在pH值降低的過程中,復合蛋白在約230 nm處吸光度明顯增長,當pH值從8.0降至7.0時,增長幅度最大。這可能是因為在此pH范圍內的蛋白質經歷了最大限度的復性。添加WPC使PKP更耐復性。這些發現表明,堿性環境中的PKP-WPC復合蛋白對中和過程中的結構變化具有顯著的抵抗力[15]。

2.3.3圓二色譜分析結果

圓二色(circular dichroism,CD)譜能夠反映蛋白質二級結構的有關信息,結果見圖5。由圖5 (a)可知,所有蛋白樣品的CD光譜在 200～260 nm 都有較寬的負帶,表明具有復雜的二級結構。與PKP相比,復合蛋白的強度顯著降低,表明蛋白質的二級結構發生了明顯變化,2種蛋白并不是簡單地混合。類似地,正如He等[9]報導,所有蛋白樣品在pH 值為7.0時,在200～240 nm都有寬的負譜帶,表明具有復雜的二級結構。蛋白樣品之間存在顯著差異,由圖5 (c)可看到,與單一蛋白相比,復合蛋白的α-螺旋、β-轉角和無規卷曲結構含量增加,β-折疊含量降低,與黎露露[32]研究的大米蛋白-豌豆蛋白的二級結構含量變化一致。說明蛋白分子的剛性結構減弱,柔性結構增強,分子由有序結構變為無序,這也是蛋白質功能特性改善的原因之一。由圖5 (b)可知,酸化過程中,極值的強度減小,并伴有紅移,說明在pH 值為12.0時,由于結構展開暴露出更多的帶電基團,蛋白內部基團間的強烈排斥作用使蛋白質膨脹和延伸,故能在堿性條件下形成穩定的結構。在中和的過程中,蛋白質會由于表面電荷的減少而趨于聚集,但是,WPC的加入會抑制PKP的折疊能力,從而起到抑制蛋白質聚集的效果,因此在中性條件下也能形成穩定結構[21]?？傊?絡合不是通過在PKP表面涂覆WPC開始的,而是由于協同結構相互作用,即PKP和WPC的結構可能通過肽鏈或二級結構而不是三級或更高結構的絡合進行相互作用。

2.4 復合蛋白表面性質分析結果

表面疏水性和表面電荷對維持蛋白質溶液體系的穩定性起著重要作用。因此,對蛋白樣品的表面疏水性和表面電荷進行了表征,結果見圖6。

不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

由圖6 (a)可知,添加WPC后顯著降低了PKP的表面疏水性,復合蛋白的表面疏水性在酸化過程中逐漸增強 [圖6 (b)],并在pH值為 7.0時達到頂峰,但顯著低于PKP的表面疏水性(P<0.05)。復合蛋白的疏水性隨著pH值的降低而增加,這是蛋白質復性的另一個證據。在這方面,疏水性增加的主要原因不是疏水基團增加,而是共折疊的蛋白質鏈使非極性基團聚集在一起,從而形成疏水區域被ANS檢測到[33]。

由圖6(c)可知,復合蛋白的ζ-電位的絕對值是34.74 mV,顯著高于PKP和WPC的12.31和 24.43 mV。添加WPC后,表面疏水性降低,而ζ-電位絕對值增加,表明水穩定性提高。由圖6(d)可看到,在酸化過程中,ζ-電位絕對值略有降低,但都顯著高于單一蛋白。這表明大多數帶電基團很好地保持在復合蛋白的表面。該結果與Alrosan等[15]研究小扁豆蛋白與WPI復合后表面電荷的變化趨勢相同。在pH值為12.0時,蛋白質具有最高的表面電荷,說明在堿性環境中蛋白質結構展開并大量暴露于帶電基團的溶劑中,產生了足夠的靜電排斥,從而增強了復合蛋白的穩定性,并使其在絡合后溶解在水中時抵抗聚集。ζ-電位分析和表面疏水性分析再次揭示了復合蛋白的抗折疊結構,并解釋了WPC添加后導致PKP溶解度增加的原因。

2.5 乳液性質分析結果

2.5.1乳液平均粒徑分析結果

平均粒徑是評價乳液穩定性的重要因素,液滴粒徑越小,乳析速度越慢,乳液越穩定[34]。不同乳液樣品的平均粒徑見圖7。由圖7可知,PKP-WPC復合乳液的平均粒徑顯著低于PKP乳液。這可能是由于兩種蛋白發生相互作用,蛋白的構象重排,能夠快速吸附到油滴表面,降低油水界面張力,乳液穩定性提高。PKP乳液在油相體積分數為10%時平均粒徑最小,為225.14 nm。在固定的蛋白濃度下,當油相體積分數從3%增加到50%時,可用于穩定界面的蛋白質顆粒減少,因此會形成大液滴。WPC乳液和PKP-WPC復合乳液隨著油相體積分數的增加,平均粒徑逐漸增大,含油量過高導致蛋白質不足以穩定在所有油滴表面,使乳液液滴發生了聚結。這一結果與Li等[35]研究油相體積分數對細菌纖維素納米纖維乳液的液滴大小的影響結果一致。

不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

2.5.2乳液ζ-電位分析結果

ζ-電位在一定程度上可以反映乳液液滴之間相互作用的強度。ζ-電位的絕對值越大,說明液滴間斥力越大,可避免液滴聚結變大,體系越穩定[36],結果見圖8。由圖8可知,在所有的油相體積分數下,WPC乳液的ζ-電位絕對值最大,在油相體積分數為3%時,WPC乳液的ζ-電位值為-44.46 mV,說明此時液滴之間的靜電斥力大,乳液較穩定。PKP-WPC復合乳液的ζ-電位絕對值顯著高于PKP乳液,這可能是由于帶負電的PKP和WPC之間的靜電排斥作用抑制了液滴的絮凝,PKP和WPC的共同吸附可能導致凈電荷增加,因為它們都帶負電[37]。李良等[17]在研究大豆分離蛋白-乳清分離蛋白對O/W型乳液穩定性的影響時也發現復合乳液液滴表面均帶有負電荷,且ζ-電位絕對值顯著高于單一蛋白乳液。PKP乳液在油相體積分數為10%時ζ-電位絕對值最大,說明此時乳液最穩定。在WPC乳液和PKP-WPC復合乳液中,ζ-電位絕對值隨著油相體積分數的增加而減小。3%時的乳液較穩定,這與平均粒徑的結果一致。

不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

2.5.3乳液乳層析指數分析結果

儲存10 d期間乳液的乳層析指數分析結果與乳液的外觀圖見圖9。由圖9(a)可知,復合乳液的乳層析指數顯著低于PKP乳液,說明復合蛋白制備的乳液較穩定。由圖9(b)可看到,剛制備(第0天)的乳液均表現出均勻的外觀,含油量為50%的乳液,在第1天就發生了明顯的乳析現象。在第3天時,含油量為3%和10%的3種蛋白乳液都沒有發生明顯的乳析現象。儲存7 d后,才出現明顯的乳析現象,乳層析指數顯著升高。儲存10 d后,WPC-3和PKP-WPC-3沒有明顯的乳脂化,但仍然可以觀察到乳液底部的混濁程度降低。且隨著儲存時間的增長,乳層析指數逐漸增加。PKP乳液在儲存10 d后明顯觀察到有油滴析出,WPC乳液和PKP-WPC復合乳液未觀察到有油滴析出。PKP-WPC-3的乳液乳層析指數較低,說明乳液穩定性較好。

圖9 不同乳液樣品的乳層析指數及乳液外觀Fig.9 Creaming index and appearance of different emulsion samples

2.5.4乳液微觀結構的分析結果

激光共聚焦顯微鏡通常用于分析乳液的微觀結構,它可以從本質上反映乳液粒子的粒徑分布、分散性和穩定性[18],乳液的微觀形態結構見圖10。由圖10可知,紅色和綠色區域分別代表油滴和蛋白質。油相呈球形,表明油滴完全被乳液中的水包裹。乳液液滴的微觀結構因蛋白種類和油相體積分數的不同而有很大差異。對于PKP乳液,PKP-10的液滴分布較均勻,PKP-3發生了顆粒堆積效應,這可能是由于在較低的油相體積分數下,高剪切乳化后,更多的未被吸附的蛋白質會相互結合形成聚集體。PKP-50的液滴較大,且不均勻,表明此時液滴大量聚集,乳液穩定性低。WPC乳液和PKP-WPC復合乳液的微觀結構基本相似,隨著油相體積分數的增加,液滴逐漸增大,且變得聚集。WPC-3和PKP-WPC-3的乳液液滴小,分布均勻且有序,說明乳液穩定性好。含油量為50%的乳液液滴變大,可觀察到液滴絮凝。王一丹[38]在研究芝麻蛋白乳液性質時也發現液滴大小與油相體積分數呈正相關,且液滴尺寸增大,液滴間的聚集越明顯。與PKP乳液相比,添加WPC后復合乳液液滴尺寸明顯減小,且分散性好,這可能是由于復合蛋白濃度適宜且添加WPC后在油-水界面形成更加致密的膜結構。這與李良等[17]對大豆分離蛋白-乳清分離蛋白復合乳液的微觀形態的研究結果相類似。PKP-WPC-3乳液結構均一、穩定。以上現象證實了測定的平均粒徑、ζ-電位和乳層析指數的結果。

圖10 不同乳液樣品的微觀形態Fig.10 Microscopic morphology of different emulsion samples

3 結 論

采用pH循環法成功制備了可溶性PKP-WPC復合蛋白。PKP與WPC相互作用改變了PKP的結構和功能特性。蛋白質的二級結構(α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲),由于蛋白質絡合而發生顯著變化。靜電相互作用、疏水相互作用和氫鍵有利于PKP-WPC復合蛋白的形成。在酸化過程中,兩種蛋白質之間的相互作用抑制了蛋白質的結構復性,并維持了蛋白質的帶電表面,從而顯著提高了PKP的溶解度。PKP-WPC復合乳液顯示出較好的乳液穩定性,PKP-WPC-3乳液的穩定性顯著高于PKP-WPC-10和PKP-WPC-50,乳液的平均粒徑、ζ-電位、乳層析指數分析以及顯微鏡觀察證明了這一點。研究結果可為新型蛋白產品的研發提供理論基礎,有助于拓寬松仁蛋白在加工食品中的應用范圍。