高粱兩步法厭氧發酵產己酸研究

鄧星成, 任志強,2, 曾 波, 衛春會,2, 鄧 杰,2,謝 軍,2, 黃治國,2,*

(1.四川輕化工大學 釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室, 四川 宜賓 644000;2.中國輕工業釀酒生物技術及智能制造重點實驗室, 四川 宜賓 644000)

高粱[Sorghumbicolor(L.) Moench]是被子植物門(Angiospermae)百合綱(Liliopsida)莎草目(Cyperales)禾本科(Poaceae)黍亞科(Sub Fam. Panicoideae)高粱族(Trib. Andropogonea)高粱屬(Sorghum)植物,一年生草本作物,籽粒為谷物類糧食。高粱是中國的古老作物之一?？脊艑W家發現,遠在西周至西漢時期高粱已在中國廣泛分布,至今約有 4 000年的栽培歷史。中國的琥珀甜高粱于1853年傳入美國,曾對那里的糖高粱生產起過重要作用?，F在世界熱帶和溫帶的90多個國家栽培高粱,主要的生產國有中國、美國、印度、阿根廷、墨西哥、尼日利亞、蘇丹、澳大利亞等。高粱在中國的主產區集中在東北、華北和西北地區。高粱是我國重要的雜糧作物,其產量低于水稻、小麥、玉米、甘薯,居第五位。高粱是釀酒和制醋、飴糖、淀粉的主要原料之一。我國白酒生產多以高粱為主要原料,因此白酒也稱為“高粱白酒”,高粱酒在清朝已經被公認為是最好的酒,流行于我國北方和部分南方地區。中國的茅臺酒、汾酒、山西陳醋等均以高粱為原料。高粱經酸或酶水解后會產生大量的風味物質,這些風味物質會在釀酒生產時帶入酒中[1]。

以高粱為釀酒原料的濃香型白酒中己酸不僅是重要的揮發性風味化合物,還是己酸乙酯合成的前體物質。己酸作為6個碳的中鏈脂肪酸,廣泛用于食品添加劑、醫藥、香料等工業生產領域[2-3],具有較高的經濟價值。同時,以微生物發酵己酸的研究中,發酵原料大多含有豐富的糖類物質,如餐廚垃圾、果蔬廢棄物和纖維素等[4]。高粱具有抗旱、抗澇、耐鹽堿、耐瘠薄、耐高溫、耐寒冷等抗逆性,即使是在貧瘠的土地上仍能穩定生長,作為一種非口糧競爭性農作物,不會搶占糧食土地,且淀粉含量高,價格便宜。但高粱作為己酸發酵原料的研究目前還未見報道,本研究團隊從優質窖泥中經富集、篩選產己酸相關的微生物得到己酸復合菌液,該菌液能利用底鍋水、黃水等白酒釀造廢液發酵己酸。

化學法主要是以硝酸氧化仲辛醇制得己酸,但副產物多,對環境污染較大;而微生物發酵方面,當前研究多利用玉米、小麥、甜高粱等淀粉質原料生產短鏈羧酸[5-6],這類酸相對分子質量較小,能量密度低,親水性強,難分離[7],因而進一步的資源化利用受到限制,于是近年來利用產己酸微生物將短鏈脂肪酸轉化為中鏈脂肪酸的研究得到了較多的關注。

實際微生物合成己酸是一個碳鏈延伸的過程,通過β氧化逆循環實現,在這個過程中發生了電子供體的氧化與電子受體的還原,常見電子供體有乙醇和乳酸,短鏈羧酸(丁酸、乙酸等)則作為電子受體[8]。因此,當前己酸的厭氧發酵也大多采用兩步發酵的方式[9]。首先,因產己酸微生物難以直接利用大分子有機物,第一步先利用酸化類微生物分解大分子有機物產生丁酸和乙酸等短鏈脂肪酸作為電子受體。第二步利用產己酸微生物在電子供體作用下,將第一步中的短鏈脂肪酸經碳鏈延長轉化為己酸[7]。將己酸發酵過程分為兩步驟的同時,也將酸化類微生物和產己酸微生物進行空間隔離,這不僅可避免己酸和電子供體(乙醇)對酸化微生物的毒害,同時在不同發酵體系下,能更有效地控制兩類微生物處于最佳的發酵條件,從而提高己酸的產量。而電子供體的來源可分為三大類[10],第一類為發酵底物自身富含電子供體,如釀造廢水[11]、乳清液等;第二類為外源添加電子供體[12-13];第三類為利用有機底物通過微生物發酵自生電子供體,例如Contreras-Davila等[14]將食品垃圾經過同型乳酸發酵生成乳酸并結合連續生物反應器進行碳鏈延長,最終實現在無外源電子供體的條件下生成正己酸。但目前大部分的己酸發酵仍然依賴外加電子供體的方式以提高己酸產量[15],這導致己酸生產成本過高,通過原料自生電子供體,以強化己酸生成的研究還相對較少,值得進一步探索。

本研究在無外源添加電子供體條件下,探究以高粱為原料,采用兩步法厭氧發酵產己酸的可行性。通過優化發酵時間、接種量、發酵溫度等條件,以提高第一步中丁酸、乳酸、乙醇發酵液的轉化率。然后以3種發酵液為底物進行發酵制備己酸,通過優化不同底物組合,以及乙醇發酵液和乳酸發酵液添加比例,以獲得較優的己酸發酵條件。并分析較優條件下己酸發酵過程中的微生物與代謝物質相關性,探究己酸發酵機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高粱原料為市售粳高粱(粉碎至200目)。己酸復合菌液,山東中惠生物科技股份有限公司;糖化酶(5×104U/g)、α-淀粉酶(5×104U/g),江蘇博立生物制品有限公司;釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),安琪酵母股份有限公司;嗜酸乳桿菌TYCA06(Lactobacillusacidophilus),安徽錦喬生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Auper Alcomat型高精度數顯酒精濃度計,優萊博技術(北京)有限公司;1000A型多功能粉碎機,永康市紅太陽機電有限公司;UV-1200型紫外分光光度計,上海美普達儀器有限公司;悟空K2025型高效液相色譜儀,海能未來技術集團股份有限公司;GC2200型氣相色譜儀,云鉑儀器(成都)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1兩步法厭氧發酵己酸工藝流程

高粱經兩步法厭氧發酵產己酸的工藝流程見圖1。第一步是以高粱為原料分別接種己酸復合菌液、接種嗜酸乳桿菌TYCA06、添加釀酒酵母制得丁酸發酵液、乳酸發酵液、乙醇發酵液;第二步是將丁酸發酵液、乳酸發酵液、乙醇發酵液等3種發酵液混合,接種己酸復合菌液,制得己酸。

圖1 高粱兩步法厭氧發酵產己酸工藝流程Fig.1 Process of two-step anaerobic fermentation to produce caproic acid by sorghum

1.3.2第一步丁酸發酵液的發酵工藝條件優化

取10 g高粱粉,添加了所有發酵所需物(包括高粱粉、CaCO3、己酸復合菌液)后定容至100 mL;添加質量分數為1%的CaCO3(即1 g)。采用單因素優化法,分別考察發酵時間(1、3、5、7、9 d)、發酵溫度(25、30、34、37、40 ℃)、己酸復合菌液接種量(5%、10%、15%、20%)(接種量為5%即菌液體積占總發酵體系體積的體積分數,下同)對高粱厭氧發酵產酸的影響。厭氧瓶有效容積100 mL,每組3次平行,定期取樣檢測發酵液中丁酸和乙酸質量濃度,并計算相應淀粉轉化率。

淀粉轉化率的計算方法見式(1)。

(1)

式(1)中,162為淀粉相對分子質量;88為丁酸相對分子質量;120為2 mol乙酸相對分子質量;實際淀粉消耗量為發酵前后淀粉質量分數的差值。

1.3.3第一步乳酸發酵液的發酵工藝條件優化

取200 g高粱粉,加入1 800 mL沸水,95 ℃水浴并不斷攪拌,按400 U/g高粱粉干質量加入α-淀粉酶,攪拌液化1 h。取出后晾冷至40 ℃左右,按500 U/g高粱粉干質量加入糖化酶,放于65 ℃恒溫糖化2 h。糖化完成后用4層紗布過濾,得到濾液,高壓蒸汽滅菌15 min,冷卻至常溫,制得高粱糖化液。

MRS培養基:無水葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母提取物5 g、無水乙酸鈉5 g、檸檬酸銨2 g、K2HPO4·3H2O 2 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·H2O 0.25 g、吐溫80 1 mL,蒸餾水1 L,pH值6.2±0.1,121 ℃滅菌20 min。

從嗜酸乳桿菌干粉中獲得的乳酸菌菌株在MRS培養基中培養至對數期(OD600為1.3左右),接種于100 mL高粱糖化液。采用單因素優化法,分別考察發酵時間(1、2、3、4、6、8、10 d),發酵溫度(25、30、34、37、40 ℃),接種量(5%、10%、15%、20%)對高粱厭氧發酵產乳酸的影響,厭氧瓶有效容積100 mL,每組3次平行,定期取樣檢測發酵液中乳酸質量濃度,并計算乳酸轉化率。

乳酸轉化率的計算方法見式(2)。

(2)

式(2)中,乳酸產量為發酵結束后乳酸發酵液中乳酸的質量分數,總糖消耗量為發酵前后乳酸發酵液中總糖質量分數的差值。

1.3.4第一步乙醇發酵液的發酵工藝條件優化

取250 g高粱粉加水定容至1 L,添加釀酒活性干酵母2 g,按100 U/g高粱粉干質量加入α-淀粉酶干粉,通過稱重法每12 h測定發酵質量損失,并考察發酵溫度(20、25、30、34、37 ℃)、料水比[m(高粱粉)∶V(水)=1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 g/mL]對高粱發酵產乙醇的影響,厭氧瓶有效容積為1 L,每組3次平行,發酵結束時取樣100 mL,測定發酵液酒精度,計算乙醇轉化率。

乙醇轉化率的計算方法見式(3)。

(3)

式(3)中,乙醇產量為發酵結束后乙醇發酵液中乙醇的質量分數,總消耗淀粉理論乙醇產量為發酵前后乙醇發酵液中淀粉質量差值理論生成乙醇的質量分數。

1.3.5第二步己酸發酵底物組合的優化

3種發酵液在12 000 r/min條件下離心8 min,分別收集上清液,加去離子水稀釋調整后,得到丁酸、乙酸質量濃度分別為20 g/L和8 g/L的丁酸發酵液,乳酸質量濃度為10 g/L的乳酸發酵液,乙醇質量濃度為20 g/L的乙醇發酵液。

不同發酵底物組合的己酸發酵實驗設計見表1。采用批次發酵方式,于100 mL厭氧發酵瓶中,控制產己酸發酵體系中總物質的質量濃度為10 g/L,以上述3種發酵液為發酵底物組合發酵;設置1種發酵液發酵組(M1、M2、M3),2種發酵液組合發酵組(M4、M5、M6)和3種發酵液組合發酵組(M7),M7中乙醇和乳酸質量濃度比值為1∶1;均接種體積分數為10%的己酸復合菌液,調節pH值為5.6±0.1,每組3次平行,35 ℃條件下厭氧發酵,每3 d取樣測定己酸質量濃度,并計算最終己酸產率。

表1 不同底物組合的己酸發酵實驗設計

己酸產率的計算見式(4)。

(4)

式(4)中,高粱消耗量為己酸發酵液中初始底物換算為高粱消耗的量,見表1。

1.3.6第二步乙醇發酵液與乳酸發酵液添加比的優化

乙醇發酵液與乳酸發酵液添加比的優化實驗設計見表2。以最優底物組合,添加丁酸發酵液12.5 mL,控制己酸發酵體系物質總質量濃度為13.5 g/L,通過添加不同比例的乙醇發酵液與乳酸發酵液,得到不同的乙醇與乳酸添加質量濃度比例(1∶1、2∶1、3∶1、1∶2、1∶3),并對己酸的合成性能進行研究?？刂瓢l酵條件,每7 d取樣測定丁酸、乙酸、乙醇、乳酸、己酸的質量濃度。

表2 不同乙醇發酵液與乳酸發酵液添加比的己酸發酵實驗設計

1.3.7發酵液中目標產物質量濃度的測定

1)發酵液預處理。取1 mL發酵液于15 mL離心管中,加入1 mL5 g/L 2-乙基丁酸,再加入100 μL甲酸,用乙醇定容至5 mL,以12 000 r/min 離心5 min,取上清液于樣品瓶中,用于氣相檢測發酵液中丁酸、乙酸、己酸的質量濃度。

取1 mL發酵液于2 mL離心管中,以12 000 r/min離心5 min,過0.22 μm微孔濾膜,取100 μL上清液加900 μL超純水(稀釋10倍),轉移至進樣品瓶中,用于液相檢測發酵液中乙醇、乳酸的質量濃度。

2)氣相色譜條件。毛細管色譜柱為LZP-930(30 m×0.32 mm×1.0 μm),不分流,進樣量1 μL,進樣口溫度為230 ℃;程序升溫:50 ℃保持6 min,從5 ℃/min升溫至170 ℃,保持5 min;載氣為高純度氮氣,載氣壓力0.05 MPa。

3)液相色譜條件。色譜柱為Hi-Plex H (300 mm×7.7 mm×8 μm),流動相為5 mmol/L H2SO4水溶液,流速為0.6 mL/min,上樣量為20 μL,柱溫為55 ℃。

1.3.8發酵液其他理化指標的測定

淀粉含量測定參照GB 5009.9—2016《食品安全國家標準 食品中淀粉的測定》中酸水解法;總糖含量測定參照GB 5009.7—2016《食品安全國家標準 食品中還原糖的測定》中直接滴定法;酒精度測定參照GB 5009.225—2016《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》中蒸餾法。

1.3.9己酸發酵過程中微生物群落分析

通過無菌操作收集1.3.6節中最優己酸發酵組的0、8、14 d的己酸發酵液樣品,置于-80 ℃冰箱保存待用,對樣品細菌16S rRNA的V3～V6區設計引物(338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT′3′),通過上海美吉生物醫藥科技有限公司高通量測序平臺(Illumina MiSeq PE300)進行高通量測序,所得數據經過質控、過濾和拼接并對相似度大于等于97%的操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)進行聚類,比對Silva數據庫(SSU123)進行分物種注釋。

1.4 數據處理

采用Excel 2019對數據進行處理,使用SPSS 23.0對數據結果進行統計分析,采用Origin 2021繪圖。

2 結果與分析

2.1 丁酸發酵液的發酵工藝條件優化結果

為探究丁酸發酵液的最佳發酵條件,本研究通過單因素實驗考察了發酵時間、發酵溫度和菌液接種量對丁酸發酵液發酵情況的影響,見圖2。由圖2(a)可知,從發酵時間上看,在1～9 d內,隨著發酵時間的延長,丁酸和乙酸質量濃度呈現逐漸增加的變化趨勢,在第7天后丁酸和乙酸質量濃度變化不顯著(P>0.05),這可能是發酵至第7 d酸類物質的積累導致發酵液pH降低抑制微生物的生長代謝。因此選擇發酵時間7 d為宜。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

厭氧發酵產酸過程中,溫度通過影響微生物生命活動及相應酶的活性,從而影響最終代謝產物的產量[16],由圖2(b)可知,隨著溫度的升高丁酸、乙酸質量濃度和淀粉轉化率呈現先增加后降低的變化趨勢,在37 ℃達到最高值,丁酸、乙酸產量分別為20.16 g/L和8.47 g/L,淀粉轉化率達76.02%,并且顯著高于其他組(P<0.05)。因此選擇發酵溫度37 ℃為宜。

接種量直接影響著發酵過程中的微生物的生長速率,從而影響發酵周期[17],由圖2(c)可知,隨著菌液接種量增加,丁酸產量和淀粉轉化率呈現先升高后降低的變化趨勢,在菌液接種量為10%時丁酸和乙酸質量濃度達到最高值,但當接種量大于10%后,丁酸質量濃度差異不顯著(P>0.05)但淀粉轉化率卻急劇下降。因此選擇最佳菌液接種量為10%。

在己酸兩步法厭氧發酵中,提高第一步中高粱的轉化率是后續產己酸高轉化率的前提,最終確定在發酵溫度為37 ℃條件下,接種10%的己酸復合菌液,發酵7天為高粱厭氧發酵產丁酸和乙酸的最佳條件,此時丁酸發酵液淀粉轉化率達到76.02%,丁酸、乙酸產量分別為20.16 g/L和8.47 g/L。

2.2 乳酸發酵液的發酵工藝條件優化結果

乳酸的發酵過程中乳酸菌可通過生成乳酸形成酸性環境和分泌細菌素等方式抑制雜菌的生長,從而實現乳酸的定向轉化[18],為得到乳酸發酵液的最佳發酵條件,本研究通過單因素實驗考察了發酵時間、發酵溫度和乳酸菌接種量對高粱厭氧發酵產乳酸的影響,見圖3。

不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

發酵時間對高粱厭氧發酵產乳酸的影響結果見圖3(a),由圖3(a)可知,乳酸質量濃度隨發酵時間增加呈現逐漸增加的變化趨勢,在前2 d乳酸質量濃度增長較快,在第4 天時進入穩定期,在8 d后乳酸質量濃度不再呈現顯著變化(P>0.05),因此選擇發酵時間8 d為宜。

發酵溫度對高粱厭氧發酵產乳酸的影響結果見圖3(b),由圖3(b)可知,隨著發酵溫度升高乳酸質量濃度和乳酸轉化率均呈現先增加后降低的變化趨勢,在發酵溫度34 ℃時乳酸質量濃度和轉化率均達到最高,為11.41 g/L和42.48%,與其他發酵溫度呈現顯著差異(P<0.05)。趙微等[19]從清香型白酒酒醅中篩選的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)SL32-2,在高粱糖化液中產乳酸的最佳發酵溫度為35 ℃,與本研究最適溫度接近。因此選擇發酵溫度34 ℃為宜。

乳酸菌接種量對高粱厭氧發酵產乳酸的影響結果見圖3(c),由圖3(c)可知,隨著乳酸菌接種量的增加乳酸產量和轉化率整體呈現先降低再增加的變化趨勢,在較少的接種量(體積分數為5%)時,乳酸產量和轉化率均達到最高值。因此選擇最佳接種量為5%。

因此選擇發酵溫度34 ℃,乳酸菌接種量為5%,發酵8 d,為乳酸發酵液最優發酵條件,此時乳酸產量和轉化率達到11.41 g/L和42.48%。

2.3 乙醇發酵液的發酵工藝條件優化結果

為得到乙醇發酵液最佳發酵條件,本研究通過單因素實驗考察了發酵時間、發酵溫度和接種量對高粱厭氧發酵產乙醇的影響,見圖4。酵母的乙醇發酵常伴隨著CO2的生成,因此以釀酒酵母發酵的累計失重來表征其發酵情況,由圖4(a)可知,在發酵前72 h,發酵累計失重變化較快,釀酒酵母生長代謝較旺盛,在72 h到144 h發酵累計失重變化曲線逐漸變平緩,在168 h后累計失重量變化不再明顯,表明此時發酵結束,因此選擇發酵時間168 h為宜。

不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

發酵溫度對高粱厭氧發酵產乙醇的影響結果見圖4(b),由圖4(b)可知,發酵液酒精度和乙醇轉化率隨著發酵溫度的增加均呈現先增加后減小的變化趨勢,在溫度為25 ℃時發酵液酒精度和乙醇轉化率均達到最高,顯著高于其他發酵溫度(P<0.05)。溫度過低會使發酵速度緩慢,延長產酒周期;溫度過高會抑制酵母菌生長代謝。因此選擇25 ℃作為高粱乙醇發酵的合適溫度。

相同發酵質量,料水比反映了發酵液中淀粉的含量,淀粉含量過高容易造成原料的浪費,淀粉含量過低又不能滿足釀酒酵母發酵所需碳源,以至于出酒酒度不高[20]。不同料水比對高粱厭氧發酵產乙醇的影響結果見圖4(c)。由圖4(c)可知,隨著料水比的降低,發酵液酒精度呈現逐漸降低變化趨勢,但乙醇轉化率呈現先增加后降低的變化趨勢,在料水比為1∶3時達到最高,顯著高于其他料水比(P<0.05)。雖然料水比在1∶2條件下的發酵液酒精度較高,但乙醇轉化率相較于料水比1∶3更低,說明在料水比為1∶2時釀酒酵母對淀粉質原料的利用率不高,為節約原料成本,選用1∶3作為最佳的高粱乙醇發酵的料水比。

因此,選擇發酵溫度25 ℃,料水比為1∶3時,發酵7 d為乙醇發酵液最佳發酵條件,發酵液酒精度高,乙醇轉化率可達95.06%。

2.4 己酸發酵底物組合的優化結果

碳鏈的延長往往需要電子供體等還原性物質提供ATP和還原力(NADH)[4],己酸發酵過程中電子供體的多樣性,反映了電子供體轉移電子的難易程度,從而影響己酸的產量[21]。因此本研究探究了以不同電子供體為底物己酸發酵情況的差異,結果見圖5。由圖5可知, M1、M2、M3、M6的產己酸效果明顯弱于其他組,說明當發酵底物缺乏電子供體(M3)或者電子受體(M1、M2、M6)時,不利于己酸發酵。

圖5 發酵底物對己酸發酵的影響Fig.5 Effect of fermentation substrate on caproic acid fermentation

當以乙醇(M4)或乳酸(M5)發酵液提供電子供體時,產己酸效果顯著,其中M4組在前6 d己酸增長較快,在第9天進入穩定期,在12 d后己酸質量濃度變化不大,最終己酸質量濃度達到2.20 g/L。此時乙醇為電子供體,乙醇首先被乙醇脫氫酶氧化生成乙醛,并在乙醛脫氫酶作用下產生乙酰輔酶A,產生能量,然后進入循環[22]。第二步是乙酸和丁酸的還原,2個乙酰輔酶A縮合成乙酰乙酰輔酶A,經脫氫、脫水、還原生成丁酰輔酶A。同時,在乙酰輔酶A轉移酶的作用下,乙酸與丁酰輔酶A反應生成新的乙酰輔酶A和丁酸。丁酰輔酶A和乙酰輔酶A被轉化為己酰輔酶A,己酰輔酶A在?；o酶A轉移酶的作用下,與丁酸反應生成己酸[8,10]。M5在發酵前6 d己酸產量較低,之后己酸增長迅速,在12 d 時進入穩定期,15 d后趨于穩定,己酸產量達2.89 g/L。此時乳酸為電子供體,但己酸發酵啟動較M4組緩慢,可能原因是從代謝途徑來看,乳酸首先被乳酸脫氫酶氧化生成丙酮酸,丙酮酸再經過丙酮酸脫羧酶生成乙酰,結合輔酶A生成乙酰輔酶A,需經過兩步氧化,然后再參加逆β氧化實現碳鏈延伸[15]。從微生物角度來看,對于混菌發酵體系下,發酵前期產己酸微生物需要適應環境,在多菌合作協同之下實現不斷富集。史陽[23]也發現以乳酸為電子供體進行己酸發酵時,前期乳酸消耗仿佛僅為己酸的生成提供相應的短鏈碳骨架,需要后續補充乳酸來驅動己酸的合成。

當以乙醇和乳酸發酵液同時提供電子供體時,觀察M7發現,發酵前6 d己酸質量濃度增長速度較快,隨著發酵的進行,己酸質量濃度逐漸增加,第12天進入穩定期,第15天己酸質量濃度濃度達到4.15 g/L,表明乙醇和乳酸同時作為電子供體時,己酸發酵周期縮短,己酸產量顯著提高。這可能是乙醇和乳酸在己酸發酵過程中產生過剩的H2和CO2可以經過同乙?；蛯⒁宜徇€原再生成乙酸和乙醇,隨后進一步參加碳鏈的延長,因此促進了己酸的生成[22,24]。

本研究以高粱為原料經兩步發酵的方式生產己酸,因此己酸的原料轉化率值得被關注,計算不同發酵底物組的己酸產率見表3。由表3可知,當以乙醇發酵液提供電子供體時(M4),己酸產量雖然僅有2.2 g/L,但己酸的高粱轉化率達到67.05 mg/g,相比于乳酸發酵液提供電子供體(M5),己酸產量雖然有2.89 g/L,但己酸產率只有37.29 mg/g。當乙醇和乳酸發酵液同時提供電子供體時,己酸產量和產率都得到了顯著提升,分別達到4.15 g/L和75.20 mg/g。因此也同樣證明了乙醇和乳酸同時作為電子供體能有效提高己酸的原料轉化率。

表3 發酵底物組合對己酸產量和產率的影響

2.5 乙醇發酵液與乳酸發酵液添加比的優化結果

Zhu等[25]以窖泥為接種物合成中鏈脂肪酸時,發現窖泥菌群更偏好于消耗乳酸合成中鏈脂肪酸,而乙醇幾乎不消耗。2.4節發現同時以乙醇和乳酸為電子供體時己酸發酵效果較好,本研究所用接種物為己酸復合菌液,在此混菌發酵體系中,產己酸微生物對乙醇和乳酸的利用或許也存在偏好,乙醇和乳酸的添加比例可能也會引起己酸發酵體系中微生物的改變,從而影響最終的己酸形成。

乙醇發酵液與乳酸發酵液添加比對己酸發酵的影響結果見圖6。由圖6可知,不同比例的乙醇發酵液與乳酸發酵液添加比對己酸的生成有著一定的影響,在發酵14 d后己酸產量分別為5.19 g/L (添加比為1∶3)、5.15 g/L (添加比為1∶2)、5.34 g/L (添加比為1∶1)、6.65 g/L (添加比為2∶1)、4.82 g/L(添加比為3∶1)。隨著乙醇比例的增加,發酵結束時己酸質量濃度整體呈現先增加后降低的變化趨勢,丁酸的質量濃度呈現逐漸增加的變化趨勢,發酵過程中乙酸的變化,呈現了先增加后降低的變化趨勢,這可能與發酵前期產酸微生物占優勢有一定的關系,隨著發酵進行,優勢微生物菌群發生變化,或者同種微生物代謝途徑也會有所改變,從而乙酸質量濃度降低[23]。

圖6 乙醇發酵液與乳酸發酵液添加比對己酸產量的影響Fig.6 Effect of addition ratio of ethanol fermentation broth to lactic acid fermentation broth on caproic acid yield

乙醇比例較低的組別(添加比為1∶3和1∶2),主要以乳酸消耗為主,乙醇消耗較少,并且仍然有剩余乳酸未被利用,可能乳酸為電子供體形成乙酰輔酶A時會釋放CO2,有一定的碳流失,導致部分微生物的生長代謝受到一定的限制,因而微生物對乙醇的利用也不夠充分[26]。當乙醇發酵液與乳酸發酵液比例提升至2∶1時,發酵結束時乳酸幾乎消耗完全,此時己酸質量濃度也達到最高,但當乙醇發酵液與乳酸發酵液添加比值達到3∶1時,己酸質量濃度反而降低。說明過高或偏低的乙醇和乳酸添加比都不利于己酸的形成。

不同乙醇發酵液與乳酸發酵液添加比對己酸產量和產率的影響見表4。由表4可知,隨著乙醇比例的增加,己酸產率呈現先增加后減小的變化趨勢,在乙醇發酵液與乳酸發酵液添加比為2∶1時,己酸產率達到最高,達99.78 mg/g,此時發酵液中底物的轉化效率更高,對原料高粱的利用更充分。因此適當提高乙醇發酵液與乳酸發酵液添加比,能有效地促進己酸的生成,當乙醇發酵液與乳酸發酵液添加比為2∶1時,為己酸發酵的優化條件。

表4 不同乙醇發酵液與乳酸發酵液添加比對己酸產量和產率的影響

2.6 己酸發酵過程中微生物群落結構多樣性分析

不同己酸發酵時期門和屬水平上的細菌群落組成情況見圖7,從3個發酵液樣本中檢測到5個門,82個屬的細菌。由圖7(a)可知,其中有5個細菌門,包括厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacter-iota)、擬桿菌門(Bacteroidetas)、變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi) ,其中占優勢的菌群是厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteriota)、擬桿菌門(Bacteroidetas)。隨著發酵進行,厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteriota)、變形菌門(Proteobacteria)在發酵液中的相對含量呈現先減小再增加的變化趨勢,然而擬桿菌門(Bacteroidetas)呈現先增加后減小的變化趨勢。由圖7(b)可知,己酸菌屬(Caproiciproducens)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)、普氏菌屬(Prevotella)是發酵過程中的4個優勢菌群。

圖7 己酸發酵過程中細菌門水平和屬水平群落組成Fig.7 Community composition of bacteria at phylum level and genus level during caproic acid fermentation

在發酵0 d時Caproiciproducens豐度僅8.58%,

隨著發酵進行己酸菌屬不斷富集,到發酵后期相對豐度達到37.81%。有研究表明Caproiciproducens能代謝半乳糖醇產生氫氣、乙醇、乙酸、丁酸和己酸[27],是濃香型白酒中的特征香味物質己酸乙酯的主要合成菌[28]。Lactobacillus能利用碳源代謝產乳酸,為己酸的生成補充相應的電子供體。在發酵0 d時Lactobacillus豐度占比19.88%,在發酵8 d時豐度達到最高28.58%,但在發酵后期豐度僅有0.45%?？赡芤驗榘l酵后期,底物中的碳源消耗完全,乳酸菌開始衰亡[29],Caproiciproducens也因此逐漸占據優勢。Prevotella在發酵過程中豐度呈現先增加后減小的變化趨勢,在第8 天時豐度達到最高26.94%,14天時豐度下降至6.59%,有研究表明普氏菌屬能降解淀粉、蛋白質等大分子有機物質,代謝產生乙酸和丙酸等有機物[30],推測這些代謝物質給其他微生物也提供了相應的碳源和氮源。

Clostridium_sensu_stricto_1、Clostridium_sensu_stricto_12在發酵后期的豐度分別占11.27%、13.65%。這類梭菌屬微生物擁有較廣泛可利用的底物,促進了厭氧發酵體系中的碳、氮和硫元素的循環,Clostridium_sensu_stricto_1在白酒窖泥中也是重要的微生物,不僅為己酸乙酯的形成提供了前體物質,而且對厭氧發酵體系的微生物結構起到了穩定的作用。有些梭菌利用乳酸代謝生成轉化丁酸,丁酸進一步作為電子受體促進己酸的形成[31]。也有研究發現通過乙醇對瘤胃微生物富集后Clostridium_sensu_stricto_12成了優勢菌屬,并與己酸產量呈正相關關系[32]。推測該梭菌類微生物能利用乙醇和乳酸,通過代謝為Caproiciproducens提供了更多的營養物質,這也間接證明之前乙醇和乳酸組合發酵時己酸生成效果更佳的結論。

2.7 己酸發酵過程中微生物與代謝物質相關性分析

在己酸發酵過程中,代謝物質含量與微生物相關性分析結果見圖8。由圖8可知,Caproiciproducens、Clostridium_sensu_stricto_12、Pseudoclavibacter的相對豐度和己酸、丁酸含量呈顯著正相關(P<0.05),與乙醇和乳酸含量呈現顯著負相關(P<0.05);Pseudoclavibacter是放線菌門微生物,郭威等[33]將放線菌和己酸菌共培養,發現放線菌不產生己酸,但可以耐受一定量的乙醇,并促進己酸菌利用乙酸和乙醇產己酸,結合之前最優己酸發酵條件,推測在乙醇發酵液與乳酸發酵液添加比較高時(2∶1),可能更有利于該類微生物富集。Clostridium_sensu_stricto_1、Atopobium、Weissella相對豐度與乙酸含量呈顯著負相關(P<0.05);Prevotella、norank_f_Eggerthellaceae相對豐度與乙酸含量呈顯著正相關,Fraga等[34]研究也表明在瘤胃中乙酸和丁酸比例的提高和普雷沃氏菌(Prevotellabryantii3C5) 具有較強的關聯性。

***表示兩指標之間差異顯著(P<0.05)。

研究表明己酸發酵過程中,Caproiciproducens、Clostridium_sensu_stricto_12、Pseudoclavibacter可能利用乙醇和乳酸等有機物,代謝生成了己酸或生成了促進己酸合成的前體物質。其余大多微生物主要與短鏈脂肪酸(乙酸、丁酸)有較強的關聯。

3 結 論

研究結果表明,合理控制發酵時間、接種量、發酵溫度等條件,可提高第一步發酵中相應發酵液的轉化率,最終丁酸發酵液中的丁酸、乙酸產量達到20.16 g/L和8.47 g/L,淀粉轉化率達到76.02%;乳酸發酵液中的乳酸產量和乳酸產率分別達到11.41 g/L 和42.48%;乙醇發酵液中的乙醇產率可達95.06%。繼續優化己酸發酵工藝,發現當乙醇發酵液和乳酸發酵液同時作為電子供體時,己酸產量和產率均顯著提升,分別達到4.15 g/L和75.20 mg/g, 且當乙醇發酵液和乳酸發酵液中乙醇與乳酸添加的質量濃度比為2∶1時,己酸產量和產率均達到最高,分別為6.65 g/L和99.78 mg/g。對己酸發酵過程中微生物與己酸的相關性分析發現,發酵過程中和己酸含量呈正相關的微生物有Caproiciproducens、Clostridium_sensu_stricto_12、Pseudoclavibacter。其中Caproiciproducens隨著發酵進行不斷富集,到發酵后期相對豐度達到37.81%,是己酸形成的主要貢獻者。希望研究可為在無外源電子供體添加條件下,實現高粱兩步法厭氧發酵生產己酸提供理論基礎,為拓展高粱的資源化利用提供新思路。