基于UPLC-Q-TOF-MS/MS和網絡藥理學探討尖尾芋抗乳腺癌藥效物質及作用機制

王鵬 陳婭 彭江麗 彭求賢

〔摘要〕 目的 利用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術和網絡藥理學探討尖尾芋抗乳腺癌物質基礎及作用機制。方法 結合MassBank等數據庫及現有文獻研究，鑒定尖尾芋醇提物的化學成分，通過TCMSP、GeneCards等數據庫篩選尖尾芋抗乳腺癌的作用靶點，使用STRING數據庫和Cytoscape 3.9.0構建關鍵靶點蛋白相互作用（protein-protein interaction， PPI）網絡；通過DAVID數據庫對關鍵靶點進行基因本體論（gene ontology， GO）功能與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）信號通路富集分析，最后借助Cytoscape 3.9.0構建“成分-基因-通路”互作網絡圖。結果 從尖尾芋醇提物中共鑒定18個成分，包括生物堿類（1，3，10，12）、苯丙素類（2，8，18）、黃酮類（6，7，9，11，15）等；基于鑒定出的化合物通過網絡藥理學得到429個潛在作用靶點；PPI分析發現PIK3CA、PIK3R1、MAPK1等10個核心靶點，富集分析發現核心靶點可能通過調控癌癥通路發揮抗乳腺癌作用，“成分-基因-通路”互作網絡圖顯示生物堿類成分小檗堿及黃酮類成分山柰酚、木犀草素可能是尖尾芋醇提物發揮藥效的主要活性成分，其機制與凋亡相關。結論 本研究初步探究了尖尾芋醇提物抗乳腺癌活性成分為生物堿及黃酮類成分，其作用機制與細胞凋亡相關，為進一步開展尖尾芋醇提物抗乳腺癌的藥效物質基礎及作用機制研究提供了新的思路和線索。

〔關鍵詞〕 尖尾芋醇提物；抗乳腺癌；超高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯質譜；網絡藥理學；相互作用；富集分析

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.01.012

Anti-breast cancer pharmacodynamic substances and mechanism of

action of Alocasia cucullata based on UPLC-Q-TOF-MS/MS and

network pharmacology

WANG Peng1，2， CHEN Ya1，2， PENG Jiangli1，3， PENG Qiuxian1，2*

1. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Key Laboratory for Quality Evaluation of Bulk Herbs of Hunan Province， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Hunan Engineering Technology Research Center for Bioactive Substance Discovery of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the material basis and mechanism of action of Alocasia cucullata against breast cancer by UPLC-Q-TOF-MS/MS technology and network pharmacology strategies. Methods Combined with MassBank and other databases as well as existing literature research， the chemical constituents of the ethanol extract of Alocasia cucullata were identified. The anti-breast cancer targets of Alocasia cucullata were screened by TCMSP， GeneCards， and other databases. And the protein-protein interaction （PPI） network of key targets was constructed using STRING database and Cytoscape 3.9.0. Then， GO and KEGG enrichment analyses of key targets were performed by DAVID database. Finally， the interaction network of "component-gene-pathway" was constructed by Cytoscape 3.9.0. Results A total of 18 components were identified from the ethanol extract of Alocasia cucullata， including alkaloids （1， 3， 10， 12）， phenylpropanoids （2， 8， 18）， and flavonoids （6， 7， 9， 11， 15）， etc. Based on the identified compounds， 429 potential targets were obtained by network pharmacology. In addition， ten core targets such as PIK3CA， PIK3R1， and MAPK1 were found by PPI analysis. Enrichment analysis revealed that these core targets may exert anti-breast cancer effects by regulating cancer pathways. Moreover， the interaction network of "component-gene-pathway" showed that the alkaloid component berberine and the flavonoid components kaempferol and luteolin may be the main active components of the ethanol extract of Alocasia cucullata responsible for pharmacological effects， and their mechanism was related to apoptosis. Conclusion This study preliminarily explored that the anti-breast cancer active components of the ethanol extract of Alocasia cucullata were alkaloids and flavonoids， and their mechanism of action was related to apoptosis， which provides new ideas and clues for further research on the material basis and mechanism of action of the ethanol extract of Alocasia cucullata against breast cancer.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 ethanol extract of Alocasia cucullata; anti-breast cancer; UPLC-Q-TOF-MS/MS; network pharmacology; interaction; enrichment analysis

尖尾芋，又名卜芥，為天南星科海芋屬植物尖尾芋Alocasia cucullata（Lour.）Schott的根莖。在中國尖尾芋主產于福建、廣西、廣東、四川及貴州等海拔2 000米以下地區，尖尾芋最早記載于《廣西實用中草藥新選》，味辛、微苦，性寒，有毒，歸肺經，具有清熱解毒、消腫鎮痛的功效[1-2]?，F代研究表明，尖尾芋水提物和醇提物具有顯著的抗腫瘤活性[3-6]，尖尾芋水提物通過免疫增強抗乳腺癌的物質基礎與其所含多糖有關[3]，但尖尾芋醇提物通過誘導乳腺癌細胞凋亡的藥效物質基礎研究比較薄弱，其抗乳腺癌活性成分尚不明確[4]。因此，本研究主要采用超高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯質譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技術深入解析尖尾芋醇提物的化學組成，并運用網絡藥理學探究尖尾芋醇提物抗乳腺癌的核心活性成分、核心靶點及作用機制，以期為尖尾芋的深入研究及開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1? 尖尾芋醇提物化學成分分析

1.1.1? 色譜條件和質譜條件? 色譜條件：色譜柱ACQUTTY UPLC BEH C18 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相A（0.1%甲酸水），流動相B（純乙腈），梯度洗脫（0～2 min，95% A；2～12 min，95%～70% A；12～22 min，70%～0% A；22～25 min，0% A），進樣量1 μL，以0.3 mL/min流速進行梯度洗脫，柱溫為30 ℃。

質譜條件：使用正、負離子2種模式進行檢測，設定錐孔電壓30 V，毛細管電壓1.0 kV，離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣溫度100 ℃，脫溶劑氣體流速50 L/h。采集方式為MSE，采集時間25 min。分子量掃描范圍為m/z 100～1 500，碰撞能量為40～60 V，碰撞氣體為高純氬氣。使用亮氨酸腦啡呔進行準確質量數實時校正。

1.1.2? 尖尾芋醇提物樣品溶液的制備? 尖尾芋于2020年11月購于廣西欽州，經湖南中醫藥大學劉塔斯教授鑒定為天南星科海芋屬植物尖尾芋Alocasia cucullata（Lour.）Schott。精密稱取尖尾芋粉末1 g，用20 mL 70%甲醇回流提取2次，每次2 h。用布氏漏斗抽濾，合并濾液，減壓濃縮成浸膏，將浸膏轉移至10 mL容量瓶中并加入甲醇，定容至刻度，超聲20 min，10 000 r/min離心10 min，離心半徑13.5 cm，取上清液，經0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得尖尾芋醇提物樣品溶液。

1.1.3? 尖尾芋醇提物的化學成分鑒定? 采用全掃描-動態排除和數據依賴性掃描（DDA），基于Acquity超高效液相色譜串聯四極桿/飛行時間質譜對尖尾芋醇提物中的化學成分進行檢測和數據采集。采用 MassLynx V4.1軟件提取總離子流色譜圖，獲取化學成分的保留時間、質譜準分子離子峰和碎片離子峰等信息，參考Chemspider、MassBank、MoNA和HMDB數據庫和相關文獻，推測總結不同類別化合物及其質譜裂解規律。

1.2? 尖尾芋醇提物網絡藥理學分析

1.2.1? 作用靶點預測? 利用TCMSP數據庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、Swiss數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）查詢UPLC-Q-TOF-MS/MS技術鑒定尖尾芋醇提物化合物所對應的靶點，同時通過Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/）查詢靶點對應的基因名，選擇物種為“Homo sapiens”，建立數據集，將靶點蛋白名稱對應Uniprot數據集統一轉換為基因名。檢索GeneCards在線數據庫（https：//www.genecards.org/），選擇“breast cancer”為關鍵詞，獲得與抗乳腺癌相關靶點的數據集。使用Venny 2.1.0，提取單體化合物與疾病交集靶點作為尖尾芋抗乳腺癌的潛在作用靶點。

1.2.2? 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction， PPI）網絡的構建? 將尖尾芋醇提物化學成分抗乳腺癌的潛在作用靶點導入STRING在線數據庫（STRING： functional protein association networks （string-db.org））獲取PPI網絡，選擇物種為“Homo sapiens”，置信度設置為0.400，使用Cytoscape 3.9.0中Cyto NCA插件中的degree值算法篩選出得分前30的潛在核心靶點，將潛在核心靶點導入STRING數據庫，選擇物種為“Homo sapiens”，置信度設置為0.900，得到尖尾芋醇提物化學成分的潛在核心靶點蛋白的PPI網絡。

1.2.3? 尖尾芋醇提物化學成分的GO及KEGG通路富集分析? 通過DAVID Bioinformatics Resources 6.8在線分析平臺對尖尾芋醇提物化學成分核心靶點進行GO和KEGG富集分析。選取生物學過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）前5個條目進行GO富集結果氣泡圖繪制，選取京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路前20個條目進行氣泡圖繪制。

1.2.4? 尖尾芋醇提物“成分-靶點-通路”網絡的構建? 利用Cytoscape 3.9.0（https：//cytoscape.org/）軟件，構建尖尾芋醇提物“成分-靶點-通路”網絡，分析化合物和靶點間的度（degree）值關系，其中節點代表化學成分、靶點和信號通路，邊用來連接化學成分、靶點和信號通路。

2 結果和分析

2.1? 尖尾芋醇提物主要化學成分

通過UPLC-Q-TOF-MS技術分析得尖尾芋醇提物總離子流色譜圖，見圖1。結合Chemspider、MassBank等數據庫及現有文獻研究，從尖尾芋醇提物中共鑒定18個化學成分，具體信息見表1。其中包括生物堿類成分（1，3，10，12）、吲哚類成分（4，5）、黃酮類成分（6，7，9，15）、苯丙素類成分（8，18）及其他類成分（2，11，13，14，16，17），其結構式見圖2。

2.2? 生物堿類成分分析

從尖尾芋醇提物中鑒定出4個生物堿類成分，分別為化合物1、3、10、12。其保留時間分別為0.70 min、4.00 min、11.99 min和13.82 min。負離子模式下可見化合物1 m/z 307.154 0 [M-H]-，其二級碎片離子：m/z 239.092 2 [M-H-C4H4O]-、170.059 1 [M-H-C8H8O2]-，結合MassBank數據庫信息及參考文獻[7]，鑒定該化合物為長春蔓尼定（vincanidine）。在正離子模式下化合物3，準分子離子峰為m/z 348.122 4[M]+，其二級碎片離子：m/z 332.091 6 [M-CH4]+、304.096 9 [M-CO2]+，結合MassBank數據庫信息及參考文獻[9]，鑒定該化合物為白屈菜紅堿（chelerythrine）?；衔?0小檗堿（berberine）分子式為C20H18NO4，通過掃描正離子模式的一級質譜圖譜得準分子離子：m/z 336.123 9 [M]+，小檗堿屬于異喹啉類生物堿，此類生物堿的母核易形成穩定的大π共軛體系一般不會發生裂解，碎片離子主要以甲氧基等小分子取代基為主[25]。所以小檗堿二級特征碎片離子為m/z 321.099 7 [M-CH3]+、320.091 8 [M-CH4]+、306.077 2 [M-2CH3]+。其裂解途徑見圖3。在正離子模式下化合物12，準分子離子峰為m/z 295.181 5 [M+H]+，其二級碎片離子：m/z 143.072 5 [M+H-C10H16O]+，結合MassBank數據庫信息及參考文獻[18]，鑒定該化合物為鉤吻素戊（koumidine）。

2.3? 吲哚類成分分析

從尖尾芋醇提物中鑒定出2個吲哚類成分，分別為化合物4、5。其保留時間分別為4.80、4.97 min?；衔?、5在正離子模式下分別可見m/z 146.059 6 [M+H]+、m/z 118.065 4 [M+H]+。對m/z 146.059 6 [M+H]+進行MS/MS裂解分析，化合物4的質譜給出其二級碎片離子為 m/z 118.065 0 [M-CO]+，結合MassBank數據庫及參考文獻[10]，鑒定該化合物為3-吲哚甲醛（3-formylindole）。對m/z 118.065 4 [M+H]+進行MS/MS裂解分析，化合物5的質譜給出其二級碎片離子為 m/z 117.057 4[M]+，結合MassBank數據庫及參考文獻[11]，鑒定該化合物為吲哚（indole）。

2.4? 黃酮類成分分析

從尖尾芋醇提物中鑒定出4個黃酮類成分，包括化合物6、7、9、15。其保留時間分別為6.44、6.87、11.50、16.87 min?；衔?、7、9在負離子模式下分別可見m/z 577.136 4 [M-H]-、m/z 285.041 3 [M-H]-、m/z 285.040 9 [M-H]-。對m/z 577.136 4 [M-H]-進行MS/MS裂解分析，化合物6的質譜給出其二級碎片離子為 m/z 425.088 7 [M-H-C8H8O3]-、289.072 2[M-H-C15H12O6]-，結合MassBank數據庫及參考文獻[12]，鑒定該化合物為原花青素B1（procyanidin B1）。對285.041 3 [M-H]-進行MS/MS裂解分析，化合物7的質譜給出其二級碎片離子為 m/z 184.052 3[M-H-C4H4O3]-、168.052 5 [M-H-C4H4O4]-，結合MassBank數據庫及參考文獻[13]，鑒定該化合物為山柰酚（kaem？鄄pferol）。對m/z 285.040 9[M-H]-進行MS/MS裂解分析，化合物9的質譜給出其二級碎片離子：m/z 151.002 8[M-C8H7O2]-、133.029 4 [M-C7H5O4]-、107.013 9 [M-C9H7O4]-均為黃酮苷元碎裂特征離子，結合Chemspider數據庫及參考文獻[15]，鑒定該化合物為木犀草素（luteolin）。在正離子模式下化合物15，準分子離子峰為m/z 251.106 5 [M+H]+，其二級碎片離子為m/z 135.044 3 [M+H-C9H8]+，結合MassBank數據庫信息及參考文獻[21]，鑒定該化合物為3'，6-dimethylflavone。

2.5? 苯丙素類成分分析

從尖尾芋醇提物中鑒定出的苯丙素類成分可分為木脂素類及苯丙酸類，其中化合物8為木脂素類，化合物18為苯丙酸類?；衔?、18保留時間分別為7.23、19.91 min，在正離子模式下分別可見m/z 379.081 0 [M+H]+、m/z 165.091 8 [M+H]+，對化合物8進行MS/MS裂解分析，化合物8的質譜給出其二級碎片離子為m/z 349.070 4[M+H-CH2O]+、335.092 3 [M+H-CO2]+，結合MassBank數據庫及參考文獻[14]，鑒定該化合物為爵床脂素G（justicidin G）。對化合物18進行MS/MS裂解分析，化合物18的質譜給出其二級碎片離子為m/z 124.051 9[M+H-C3H5]+、109.028 4 [M+H-C3H5O]+，結合MassBank數據庫及參考文獻[24]，鑒定該化合物為丁香酚（eugenol）。

2.6? 其他類成分分析

從尖尾醇提物中鑒定出化合物2為脂肪酸類，化合物11為蒽醌類，化合物13、17為酮類，化合物14、16為酯類。蒽醌類化合物11，通過掃描負離子模式的一級質譜圖譜得準分子離子：m/z 269.045 5 [M-H]-，其二級碎片離子：m/z 240.034 8[M-H-CHO]-，結合文獻[17]，鑒定該化合物為蘆薈大黃素（aloe-emodin）。酮類化合物17，其通過正離子模式的一級質譜掃描圖譜得準分子離子：m/z 153.127 2 [M+H]+，二級質譜的碎片離子為m/z 137.096 6 [M+H-CH4]+、109.101 7 [M+H-C2H4O]+。根據以上裂解方式，結合MoNA數據庫信息及參考文獻[23]，鑒定該化合物為胡薄荷酮（pulegone）。

2.7? 網絡藥理學分析

按照上述研究方案，運用網絡藥理學對尖尾芋尖尾芋醇提物鑒定成分進行分析，發現尖尾芋醇提物化學成分與乳腺癌具有429個交集靶點。進一步分析得到13類成分與乳腺癌有關的30個潛在核心靶點，再將30個潛在核心靶點蛋白相互作用信息導入Cytoscape3.9.0繪制尖尾芋醇提物活性成分作用靶點蛋白相互作用網絡圖，如圖4所示，節點大小及顏色深淺代表靶點degree值大小。

再通過DAVID Bioinformatics Resources 6.8在線分析平臺對尖尾芋醇提物30個核心靶點進行GO和KEGG富集分析。獲得GO條目共408條，其中GO BP有308條、GO CC有42條、GO MF有58條。分別選取BP、CC、MF前5個條目進行GO富集結果氣泡圖繪制，如圖5所示，GO BP條目中前5條為蛋白磷酸化、胞內信號轉導、細胞凋亡負調控過程、細胞衰老以及纖維母細胞正調控過程。GO CC條目中前5條為細胞溶質、細胞質、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復合物、細胞核以及質膜細胞質側的外源性成分。GO MF條目中前5條為蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、酶結合以及蛋白激酶結合。

共獲得KEGG通路共142條，選取KEGG富集通路前20個條目進行氣泡圖繪制，如圖6所示，前10條分別為胰腺癌、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、癌癥通路、癌癥蛋白多糖、內分泌抵抗、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發癥中的作用、人巨細胞病毒、病毒致癌、結直腸癌以及乙型肝炎，這些通路均和癌癥反應密切相關。

運用Cytoscape 3.9.0作圖軟件對尖尾芋醇提物13個有效成分、30個核心靶點及10條KEGG信號通路制作成分-靶點-通路互作網絡圖，如圖7所示。成分、靶點、通路在網絡圖中用節點表示，兩個節點間的相互作用用邊表示，degree值的大小決定節點大小，從而確定中藥中重要的成分及相互作用力度。尖尾芋醇提物成分中小檗堿度值最高，其次是山柰酚、木犀草素、爵床脂素G、蘆薈大黃素等，而1-棕櫚酸單甘油酯度值最低，這些成分中，生物堿類化合物小檗堿及黃酮類化合物山柰酚、木犀草素可能是尖尾芋醇提物發揮藥效的主要活性成分。同時，尖尾芋醇提物化學成分作用靶點中，度值排名前10依次為磷酸肌醇3激酶α（PIK3CA）、磷酸肌醇3激酶調節亞基1（PIK3R1）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、表皮生長因子受體（EGFR）、類固醇受體共激活因子（SRC）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、胱天蛋白酶3（CASP3）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1A（CDKN1A）、腫瘤蛋白（TP53），這些靶點主要集中于PI3K蛋白家族和MAPK蛋白家族，很多癌癥和PI3K及MAPK蛋白家族有關。此外，KEGG通路分析也發現，尖尾芋醇提物化學成分主要通過調控癌癥通路、病毒感染相關通路，從而發揮抗腫瘤、抗病毒感染功效。

3 結語

本課題組前期研究[4]發現，尖尾芋醇提物石油醚部位具有良好的抗乳腺癌活性，其機制與抑制MAPKs通路p-ERK/ERK的表達有關，但尖尾芋醇提物抗乳腺癌藥效物質基礎尚不明確。因此，本文采用UPLC-Q-TOF-MS技術分析了尖尾芋70%乙醇提取物的18種化學成分，同時，通過網絡藥理學分析出尖尾芋醇提物13個抗乳腺癌活性成分（1，3，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，18）及429個抗乳腺癌相關靶點，說明尖尾芋醇提物抗乳腺癌作用與其多成分、多靶點的特性有關。其中生物堿類成分小檗堿（10）及黃酮類成分山柰酚（7）、木犀草素（9）為度值排名前三的核心成分，研究表明[26-28]，這3種成分抗乳腺癌作用與其抑制MAPK、PI3K等信號通路，促進凋亡等有關。PPI網絡預測得到SRC、TP53、MAPK1、MAPK3、PIK3R1 5個核心靶點，進一步通過GO生物學過程富集分析顯示，尖尾芋醇提物抗乳腺癌主要涉及蛋白翻譯后修飾、細胞凋亡負調控等生物過程，KEGG信號通路富集分析顯示，尖尾芋醇提物抗乳腺癌作用靶點富集最多的在癌癥通路，包括TP53、MAPK1、MAPK3等23個靶點蛋白，TP53是一個經典腫瘤抑制蛋白，該蛋白可以調控細胞生長、凋亡等多種生物過程[29]。而MAPK為絲氨酸/蘇氨酸激酶，也可以調節程序性細胞凋亡[30]。這些靶點蛋白主要集中于PI3K蛋白家族和MAPK蛋白家族，均與細胞凋亡相關，成分-基因-通路互作網絡圖顯示，生物堿類成分小檗堿及黃酮類成分山柰酚、木犀草素可能為尖尾芋抗乳腺癌的主要活性成分，其機制與凋亡相關。以上研究結果與本課題組前期研究的尖尾芋醇提物抗乳腺癌機制相符合。

綜上，尖尾芋醇提物可能通過小檗堿、山柰酚及木犀草素等成分調控TP53、MAPK1、MAPK3等30個核心靶點蛋白，進而影響PI3K、MAPK等凋亡相關信號通路來發揮抗乳腺癌作用，提示尖尾芋醇提物抗乳腺癌作用的藥效物質基礎可能與其所含生物堿類及黃酮類成分有關，為后續尖尾芋醇提物抗乳腺癌藥效物質基礎及作用機制的進一步研究提供了理論依據。

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