基于天樞與上巨虛穴經皮神經電刺激觀察對潰瘍性結腸炎模型大鼠結腸組織TLR9/MyD88/NF-κB蛋白表達的影響

張冠林 向晶 焦子遠 卓越 易細芹 張泓

〔摘要〕 目的 基于“合募配穴”原則觀察經皮神經電刺激（transcutaneous electrical nerve stimulation， TENS）對潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis， UC）模型大鼠結腸組織Toll樣受體9（toll-like receptor 9， TLR9）/髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88， MyD88）/核因子-κB（nuclear factor-κB， NF-κB）信號通路相關蛋白表達的影響，探討TENS治療UC的相關機制。方法 從48只SPF級成年SD大鼠中隨機抽取12只作為空白組。其余36只通過2-4-6三硝基苯磺酸（2-4-6 trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）/乙醇法制備UC大鼠模型，成模后再次隨機分為模型組、TENS組、陽性藥物組，每組12 只。成模后第1 天開始干預：模型組僅行捆綁固定；TENS組捆綁固定后刺激天樞、上巨虛兩穴；陽性藥物組用225 mg/kg劑量的柳氮磺胺吡啶混懸液灌胃。以上各組干預均每天1 次，共10次。觀察記錄各組大鼠每天食量和體質量。干預結束后，HE染色觀察各組大鼠結腸組織病理學變化；ELISA法檢測結腸組織白細胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）炎性因子的含量；Western blot法檢測結腸組織TLR9、MyD88、NF-κB蛋白的表達量變化。結果 （1）與空白組相比：模型組大鼠結腸組織出現明顯潰瘍面，上皮細胞大面積萎縮，炎性因子大量浸潤，IL-6、TNF-α炎性因子含量升高（P<0.05）；TLR9、MyD88、NF-κB蛋白表達量上調（P<0.05）。（2）與模型組相比：TENS組和陽性藥物組結腸組織損壞情況較輕，上皮細胞黏液較充分，腺體分支較少，炎性細胞浸潤面積??；IL-6、TNF-α含量減少（P<0.05）；TLR9、NF-κB蛋白表達量降低（P<0.05）。（3）與陽性藥物組相比：TENS組TNF-α、IL-1β的含量及TLR9、MyD88、NF-κB蛋白表達量相對較高（P<0.05）。結論 TENS能夠保護腸道上皮細胞，減輕腸道炎癥，其機制可能與降低結腸細胞促炎因子水平，抑制TLR9/MyD88/NF-κB信號通路蛋白的過表達有關。

〔關鍵詞〕 潰瘍性結腸炎；經皮神經電刺激；Toll樣受體9；髓樣分化因子88；核因子-κB；炎性因子

〔中圖分類號〕R245.9? ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.01.019

Effects of transcutaneous electrical nerve stimulation at "Tianshu"

（ST25） and "Shangjuxu" （ST37） acupoints on the protein

expressions of TLR9/MyD88/NF-κB signaling pathway in

colonic tissue of model rats with ulcerative colitis

ZHANG Guanlin， XIANG Jing， JIAO Ziyuan， ZHUO Yue， YI Xiqin， ZHANG Hong*

School of Acupuncture-moxibustion， Tuina and Rehabilitation， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of transcutaneous electrical nerve stimulation （TENS） on toll-like receptor 9 （TLR9）/myeloid differentiation factor 88 （MyD88）/nuclear factor-κB （NF-κB） signaling pathway-related protein expressions in colonic tissue of ulcerative colitis （UC） model rats based on the principle of "He-sea and front-Mu point combination"， and to explore the related mechanisms of TENS in treating UC. Methods Twelve of 48 SPF adult SD rats were randomly selected as blank group. The remaining 36 UC rat models were prepared by 2-4-6 trinitrobenzene sulfonic acid （TNBS）/ethanol method， and then randomly divided into model， TENS， and positive drug groups after modeling， with 12 rats in each group. Intervention began on the first day after modeling. Model group was only bound and fixed; TENS group was stimulated at "Tianshu" （ST25） and "Shangjuxu" （ST37） acupoints after being bound and fixed; positive drug group was intragastrically administered with 225 mg/kg of sulfasalazine suspension. All groups were intervened once a day for a total of 10 times. The daily food intake and body weight of rats in each group were observed and recorded. After the intervention， HE staining was used to observe the pathological changes of colonic tissue in each group， ELISA to check the content of inflammatory factors of interleukin-6 （IL-6）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， and interleukin-1β （IL-1β）， and Western blot to examine the changes in the expression levels of TLR9， MyD88， and NF-κB proteins. Results （1） Compared with blank group， the colonic tissue of rats in model group showed obvious ulceration， large-area atrophy of epithelial cells， extensive infiltration of inflammatory factors， and increased content of IL-6 and TNF-α （P<0.05）; the expression levels of TLR9， MyD88， and NF-κB proteins were up-regulated （P<0.05）. （2） Compared with model group， TENS and positive drug groups showed milder colonic tissue damage， more sufficient epithelial cell mucus， fewer glandular branches， and smaller area of inflammatory cell infiltration; the content of IL-6 and TNF-α decreased （P<0.05）; the expression levels of TLR9 and NF-κB proteins were reduced （P<0.05）. （3） Compared with positive drug group， the content of TNF-α and IL-1β and the expression levels of TLR9， MyD88， and NF-κB proteins in TENS group were relatively higher （P<0.05）. Conclusion TENS can protect intestinal epithelial cells and alleviate intestinal inflammation， and its mechanism may be related to reducing the level of pro-inflammatory factors in colonic cells and inhibiting the overexpression of TLR9/MyD88/NF-κB signaling pathway proteins.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 ulcerative colitis; transcutaneous electrical nerve stimulation; toll-like receptor 9; myeloid differentiation factor 88; nuclear factor-κB; inflammatory factors

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis， UC）是臨床上常見的一種慢性炎癥性腸病，其臨床癥狀主要包括腹痛、腹瀉、便血等，同時出現腸道黏膜不同程度的潰瘍和破損[1-2]。近年來，UC發病率逐年上升，已然成為一種全球性疾病，且患病人群逐漸年輕化[3]。目前，臨床針對于UC的治療手段主要有5-氨基水楊酸鹽、皮質類固醇、口服抗生素以及各類中藥等[4-5]，但此類治療在具有一定療效的同時也存在著較明顯的藥物毒副作用和因治療周期長而產生的機體耐藥性等問題。隨著我國康復醫學的發展，經皮神經電刺激（transcutaneous electrical nerve stimulation， TENS）已被廣泛應用于臨床治療各種疾病，其具有無痛、無創、方便實用的特點，能夠實現患者進行自我居家治療，極大地節省患者的時間和精力。研究顯示，TENS能夠通過提升迷走神經的活性，有效降低炎癥因子的釋放，從而對炎癥性腸病起到一定的治療作用[6-7]，但對本病療效尚不清楚。目前有研究表明，合募配穴原則是臨床針灸治療大腸腑病的重要配穴方法，以電針、溫針灸等方式刺激天樞、上巨虛等穴位能夠有效改善UC癥狀，延緩UC的進程[8-9]。但存在部分患者因暈針、畏針或治療周期長而無法堅持等因素導致臨床針灸難以大范圍應用的問題。故本實驗利用TENS于UC模型大鼠之天樞、上巨虛二穴處進行干預，觀察其對UC大鼠Toll樣受體9（toll-like receptor 9，TLR9）/髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路相關蛋白以及部分炎性因子表達的影響，并對其治療效果進行分析，以期將TENS方便快捷、安全性高的優勢與UC遷延難愈、治療周期長的疾病特點相結合，為臨床治療UC提供一種新的治療思路與方法。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物及分組

本實驗動物為健康成年SD大鼠（SPF級），共48只，雌雄各半，體質量（180±10） g，由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供，動物實驗倫理編號：LL2022022305，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004。大鼠適應性分籠飼養于恒溫24～26 ℃、相對濕度50%～70%、24 h明暗交替的環境中7 d。7 d后隨機抽取12只大鼠作為空白組，其余36只大鼠作為造模組。造模結束后，將36只大鼠再次隨機分為模型組、TENS組、陽性藥物組，每組12 只。

1.2? 實驗試劑與儀器

2-4-6三硝基苯磺酸（2-4-6 trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）（美國Sigma公司，批號：2297）；柳氮磺胺吡啶片（上海信誼天平藥業有限公司，批號：國藥準字H31020840）；大鼠Anti-TLR9兔源多克隆抗體（南京川博生物技術有限公司，批號：53889-1）；MyD88鼠源單克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，批號：67969-1-Ig）；NF-κB p65兔源單克隆抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司，批號：A19653）；羊抗鼠二抗（伊萊瑞特生物科技有限公司，批號：E-AB-1001）；大鼠白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）試劑盒（廈門侖昌碩生物科技有限公司，批號：YD-30219、YD-31063、YD-30206）。

華佗牌經皮電刺激治療儀（蘇州醫療用品廠有限公司，型號：SDZ-V）；脫毛膏（法國Veet公司，規格：100 mL）；NC膜（美國Millipoer公司，型號：ISEQ00010）；電泳儀（北京百晶生物技術有限公司，型號：BG-subMIDI）；脫色搖床（海門其林貝爾儀器制造公司，型號：TS-100）；顯影儀（美國Bio-Rad公司，型號：170-8280）；低溫冷凍離心機（德國Sigma公司，型號：3-30K）；酶標儀（美國Thermo公司，型號：RT-6100）。

1.3? 造模方法

本實驗采用TNBS/乙醇法建立UC大鼠模型[10-13]。大鼠常規飼養7 d后，禁食不禁水24 h，稱重，以異氟烷吸入的方式麻醉大鼠，麻醉后固定倒懸位，取10 cm長聚丙烯管（直徑2 mm），剪側孔數處，并由肛門插入8 cm到達結腸部位，快速注入藥液（100 mg TNBS/kg+50%乙醇0.25 mL）后，再注入約0.4 mL的空氣，以使聚丙烯管中的藥液全部注入腸腔，繼續使大鼠保持1 min倒懸位，以防注入液倒流，并使藥液與結腸充分接觸，待麻醉清醒后正常喂養。造模后第1天，若模型大鼠出現腹瀉、血便、活動減少等典型癥狀且糞便隱血試驗陽性說明造模成功[14]?？瞻捉M給予等量生理鹽水灌腸。

1.4? 干預方法

TENS組參照《實驗針灸學》大鼠標準穴位圖譜[15]、《實驗動物常用穴位名稱與定位第2部分：大鼠》定位[16]。上巨虛：雙側后肢上后三里穴下約5 mm處。天樞：臍中旁開5 mm。將大鼠仰臥位固定于特制鼠板上，皮膚取穴點進行脫毛處理后，將自制直徑為5 mm的硅膠電極貼片分別貼敷于UC大鼠上巨虛、天樞兩穴的位置，調節電刺激治療儀頻率為100 Hz[17]，強度定于該治療儀“6”檔，以觸及大鼠肌肉輕微抖動為宜，每次20 min，模型組僅行固定處理。于成模后第1天開始刺激，每天1次，共10 次。陽性藥物組根據成人藥物劑量公式等比換算得出大鼠灌胃等效劑量為225 mg/kg，將柳氮磺胺吡啶片利用研缽研磨成粉末狀，加入生理鹽水（10 mL/kg）中充分混合制成灌胃藥液，每天灌胃1次，共10次。

1.5? 觀察指標與檢測方法

每天記錄大鼠食量和體質量，觀察大鼠精神狀況、毛發光澤、二便性狀、活動情況。治療10 d后進行取材，以異氟烷吸入的方式麻醉大鼠，將麻醉后的大鼠固定于鼠板上，沿腹正中線切開皮膚暴露腹腔，于乙狀結腸部分取3份長度為1 cm的結腸組織，沿腸壁縱向剖開，用生理鹽水將腸道內容物沖洗干凈以備后續檢測。其中1 份多聚甲醛固定保存用于HE染色；其余2 份暫放入凍存管并置于液氮中，待取材結束后存儲于-80 ℃冰箱用于ELISA檢測和Western blot檢測。

1.5.1? HE染色? 將多聚甲醛固定的組織進行石蠟包埋、切片，依次進行二甲苯脫蠟、無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、蒸餾水處理后進行蘇木素染色，染色后用自來水沖洗，最后進行脫水、透明、中性樹膠封片觀察。

1.5.2? ELISA檢測? 將各組大鼠取材得到的結腸組織在適量生理鹽水中充分研磨，放入離心機以3 000 r/min半徑8 cm離心10 min后取上清液。按照檢測試劑盒說明書要求進行打板、孵育，放入酶標儀中檢測樣本OD值，最終計算出各樣本中IL-6、TNF-α、IL-1β的濃度。

1.5.3? Western blot檢測? 首先提取結腸組織蛋白，將組織放入裂解液中并加入鋼珠，充分研磨后放入組織破碎儀（8 r，15 min）破碎2～3 次，冰上裂解15 min，取出鋼珠4 ℃、12 000 r半徑8 cm離心20 min，離心后取上清打板測定蛋白濃度（BCA法），最后計算蛋白濃度，配上樣液煮沸（100 ℃，20 min），保存于-20 ℃冰箱。制膠結束后將膠板放入電泳盒，倒入電泳液。在膠板孔道中上樣（5 ？滋L Marker，10 ？滋L上樣液）后進行80 V電泳，待蛋白條帶跑至膠板底部結束電泳進行轉膜（200 V，90 min），轉模結束將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中搖床封閉90 min，孵育一抗過夜。次日回收一抗后用TBST于搖床上洗膜3 次，每次6 min。搖床孵育二抗90 min，結束后回收二抗加入TBST洗膜3 次，每次6 min，顯影觀察蛋白條帶。

1.6? 統計學分析

采用SPSS 25.0軟件進行處理。計量資料采用“ｘ±s”表示，若符合正態性和方差齊性，采用單因素方差分析；不符合正態性或方差齊性采用秩和檢驗。設定檢驗水準為0.05，P＜0.05認為差異存在統計學意義。

2 結果

2.1? 造模后大鼠一般情況

空白組大鼠情況穩定，無不良事件發生，12例均完成周期觀察。模型組造模后第1天出現2例死亡，解剖觀察發現結腸出現明顯潰瘍面；在干預第5 天出現2例死亡，觀察發現均嚴重腹脹，解剖發現大鼠腸道出現大面積壞死，糞便堆積在腸道無法排出；其余大鼠均成模且存活，最終8例完成周期觀察。TENS組造模后第1天出現1例死亡，解剖觀察發現腸道出現穿孔；在干預第7、9天分別出現1例死亡，均為結腸壞死大便難以排出所致；其余大鼠均成模且存活，最終9例完成周期觀察。陽性藥物組造模后第2天出現2只未成模大鼠；在干預第3天出現1例死亡，觀察發現體質量過輕，體溫低；在干預第9天因灌胃操作不當致氣管破裂出現1例意外死亡；其余大鼠均存活，最終8例完成周期觀察。

2.2? 大鼠日常情況變化

空白組大鼠日常精神狀況良好，二便正常，飲食量尚可。模型組大鼠出現不同程度血便，體質量降低，飲食量下降，毛發暗淡粗糙，性情暴躁；TENS組和陽性藥物組均存在上述模型組的情況，但相較有所改善。

2.3? 大鼠體質量及食量變化

空白組大鼠體質量呈現平穩上升的趨勢，其余各組大鼠于造模后第1天體質量明顯降低，持續降低至第4天開始逐漸增高，于第9—10天體質量趨于穩定。與空白組比較，模型組大鼠體質量在成模后第1天起出現不同程度的降低（P<0.05）；與模型組比較，TENS組大鼠體質量降低幅度較小，差異無統計學意義（P>0.05）；與陽性藥物組比較，TENS組大鼠體質量降低幅度較小，但在第9—10天體質量偏低（P<0.05）。詳見圖1。

造模成功后各組大鼠均以大鼠普通飼料重量（g）為單位記錄每日食量，觀察發現空白組大鼠食量無明顯變化，其余各組大鼠于造模后第1—2天食量明顯減少，至第3 天食量開始逐漸增加。與空白組比較，模型組大鼠食量較?。≒<0.05）；與模型組相比，TENS組大鼠食量較小，差異無統計學意義（P>0.05）；與陽性藥物組相比，TENS組大鼠食量較大，第1天和第3—5天的差異有統計學意義（P<0.05）。詳見圖2。

2.4? 大鼠結腸組織變化

空白組結腸上皮結構規則且完整，杯狀細胞形態正常，無炎性細胞浸潤。與空白組比較，模型組杯狀細胞明顯萎縮，細胞內黏液減少，淋巴細胞增多，基底部漿細胞大量浸潤；與模型組比較，TENS組上皮細胞形態較完整，炎性浸潤程度較輕，出現部分杯狀細胞膿腫，腺體分支情況較輕；與陽性藥物組比較，TENS組杯狀細胞萎縮明顯，炎性浸潤程度更高。詳見圖3。

2.5? 各組大鼠結腸組織中IL-6、TNF-α、IL-1β含量比較

在控制標準品回歸曲線R2值不小于0.990 0的基礎上計算各樣品炎性因子濃度。與空白組相比，模型組結腸組織中IL-6、TNF-α、IL-1β的含量更高（P<0.05）；與模型組相比，TENS組IL-6、TNF-α的含量更低（P<0.05），IL-1β的含量較低，但差異無統計學意義（P>0.05）；與陽性藥物組相比，TENS組結腸組織TNF-α、IL-1β的含量更高（P<0.05），IL-6的含量較高，但差異無統計學意義（P>0.05）。詳見圖4。

2.6? 各組大鼠結腸組織中TLR9、MyD88、NF-κB表達量比較

與空白組比較，模型組TLR9、MyD88、NF-κB蛋白表達量更高，差異有統計學意義（P<0.05）；與模型組比較，TENS組TLR9、NF-κB p65蛋白表達量更低（P<0.05），MyD88蛋白表達量較低，但差異無統計學意義（P>0.05）；與陽性藥物組比較，TENS組TLR9、MyD88、NF-κB蛋白表達量更高（P<0.05）。詳見圖5。

3 討論

UC是一種病因復雜的慢性炎癥性腸病，多是由于長期飲食不規律、吸煙、遺傳等多種因素導致腸道內微生態發生變化，從而引發的一系列炎癥[18-20]。目前，5-氨基水楊酸鹽類藥物的應用是臨床上治療UC最常用的方法[21-22]。但其擁有較好藥效的同時也具有一定的毒副作用，例如惡心嘔吐、大便干結、腸道菌群失調和耐藥性出現等，且藥物對患者的肝腎功能也會造成一定的負擔，以上情況均會影響UC的長期治療效果[23-26]。而針對UC病程長、反復發作的疾病特點，針灸、理療等補充治療手段療效穩定、風險性低的特征使其成為臨床愈加常見的輔助治療方式[27]。TENS是近年逐漸興起的一種康復理療方式，在臨床上廣泛用于減輕各類炎癥。研究證明，TENS可以顯著降低大鼠體內促炎因子的水平，其中TENS頻率為100 Hz時療效更加明顯[28]。高曉林等[29]研究發現，TENS能夠促進大鼠免疫功能的恢復，顯著降低患者術后炎性因子的水平；王藝霏等[30]研究發現，通過經皮耳穴-迷走神經刺激能夠有效抑制小鼠神經炎性反應，下調MyD88蛋白的表達；金海峰等[31]研究發現，骶神經電刺激能夠有效改善UC大鼠的每天進食量和體質量，降低UC大鼠腸道炎性因子的水平，發揮抑制腸道炎癥的作用。雖然目前關于TENS治療UC的報道尚少，但TENS同樣是通過作用于迷走神經，下調大鼠體內相關蛋白表達和炎癥因子水平，減輕炎癥。同時其具有安全性高、操作簡便的特點，能夠達到患者自主治療的目標，因此，TENS相較于其他電刺激手段具備更加優良的治療優勢，容易被更多患者所接受。故探討TENS對于UC的治療效果具有一定的臨床意義。

TLR9作為細胞內天然的識別受體，能夠精確地識別細菌和病毒的CpG DNA[32]。MyD88是TLR9的下游接頭蛋白，能夠接受上游信號并激活下游NF-κB分泌大量炎性因子，從而引起炎癥的發生[33-34]。IL-6、TNF-α和IL-1β是由體內巨噬細胞、T淋巴細胞等免疫細胞所分泌的炎性因子，其主要功能是參與免疫的激活和介導過程，促進炎癥的發生[35-36]。TLR9/MyD88/NF-κB信號通路是存在于腸道上皮細胞中的經典通路，此通路表達上調后調節體內免疫細胞分泌IL-6、TNF-α、IL-1β等促炎因子的含量顯著升高，在UC的致病過程中發揮了重要作用[37]。

中醫學認為UC屬于“泄瀉”“腸澼”等范疇，該疾病發病于脾，遷延難愈，反復發作[38]。天樞與上巨虛兩穴均屬足陽明胃經，其中天樞屬于大腸募穴，上巨虛屬于大腸下合穴，此兩穴均有疏經活絡、通腑理腸的功效，故選取此穴組治療UC能夠取得良好的效果。其次，針對治療UC選用此穴組屬于合募配穴的配伍方式。本課題組前期研究證明，電針合募配穴對于治療UC改善腸道炎癥具有明顯的效果，并且廣泛應用于臨床[39-40]。相較于電針，TENS在操作上更加簡便、更加安全，所以探討TENS通過刺激天樞、上巨虛對于UC的治療效果，具有一定的臨床意義。最終通過本實驗證明，TENS組大鼠的結腸組織形態變化明顯優于模型組，且TLR9、NF-κB、MyD88的蛋白表達量及IL-6、TNF-α、IL-1β的含量均低于模型組。由此說明，TENS可能是通過抑制TLR9/MyD88/NF-κB信號通路相關蛋白的表達，下調了IL-6、TNF-α、IL-1β等促炎因子的含量，減輕了腸道炎癥；但與陽性藥物組相比，TENS組蛋白表達量及炎性因子的含量更高?？傊?，于天樞、上巨虛二穴施加TENS對于UC具有一定的治療作用，其作用機制可能是抑制了TLR9/MyD88/NF-κB信號通路上相關蛋白的表達，降低了體內IL-6、TNF-α、IL-1β炎性因子的含量，從而達到減輕腸道炎癥的效果。本實驗先嘗試證明TENS治療本病的有效性，在此基礎上將有必要再進一步探討TENS作為一種輔助治療方法治療UC是否有望達到降低西藥使用劑量、縮短治療時間、增加臨床療效等目標等。

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