糠椴木聚糖提取及納米木聚糖制備工藝優化

李慧杰,孫金龍,張鳴遠,王宏興,葛澤儒,龐久寅,夏富才

(1.吉林省木質材料科學與工程重點實驗室(北華大學),吉林 吉林 132013;2.梅河口市山城鎮綜合行政執法隊,吉林 梅河口 135022;3.長春凈月經濟開發區應急管理局,吉林 長春 130000)

糠椴(Tiliaamurensis)隸屬椴樹科(Tiliaceae),主要生長在濕潤的山區和溫暖濕潤的平原地帶。由于具有顯著的生態和經濟價值,糠椴被認為是一種可持續資源和環保原料[1]。木聚糖為普遍存在的半纖維素,是由β-1,4-糖苷鍵連接的多糖單元組成的能夠自然生物降解的大分子物質[2-3],在環保方面展現出重大的應用價值[4-5]。木聚糖存在于植物細胞的半纖維素組分中,具有綠色環保、有效抑制微生物、無刺激性和可生物降解等特性,展現出了優異的抗菌性能[6]。

為高效開發與利用糠椴資源,本文采用堿提法提取木聚糖。堿提法是一種常用的木聚糖提取方法,能從糠椴中有效提取高純度木聚糖,可為后續研究和應用奠定基礎。納米木聚糖是對木聚糖進行納米級修飾后的產物,能充分發揮木聚糖的固有優勢[7-8],主要體現在顯著增強機械性能,如抗拉強度、韌性和耐久性等,這些特性的顯著提升極大拓展了納米木聚糖在多種材料中的應用。納米木聚糖具有良好的生物降解和環保特性[9-10],在多種材料生產過程中,采用納米木聚糖可以顯著降低與傳統塑料等不可生物降解材料相關的環境影響[11-12]。此外,相較于未經修飾的木聚糖,納米木聚糖顯示出優異的熱穩定性,特別適用于需要高耐熱性材料的應用場景,如電子和汽車行業[13]。納米木聚糖以其獨特的性質和優勢,已經成為被廣泛應用的多功能材料[14]。本文通過堿提法從糠椴中提取木聚糖,通過二次堿液處理制備納米木聚糖,并采用響應面法(RSM)[15-16]優化納米木聚糖制備工藝[17],可為糠椴資源開發提供參考與支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

糠椴莖、葉,市場購買;木糖(化學純),二乙醇胺、氫氧化鈉(分析純),上海百靈威化學技術有限公司;無水乙醇(工業級),3,5-二硝基水楊酸(化學純),無水乙醇、乙酸乙酯、無水甲醇(分析純),國藥集團化學試劑有限公司;酒石酸鉀鈉、苯酚、鹽酸、硫酸、亞硫酸鈉、戊二醛,分析純,上海阿拉丁生物科技股份有限公司;馬來酸酐,分析純,濟南創科化學有限公司;對甲苯磺酸,分析純,上海源葉生物科技有限公司;3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨,分析純,上海易恩化學技術有限公司。

1.2 試驗設備

電熱恒溫水浴鍋(HH-1),金壇市富華儀器有限公司;數顯多頭磁力加熱攪拌器(HJ-6A),常州市億能實驗儀器有限公司;分析天平(TG328A),上海天平儀器廠;電子萬用爐(DK-98-Ⅱ),天津市泰斯特儀器有限公司;高速離心機(HC-3514),安徽中科中佳科學儀器有限公司;高速多功能粉碎機(HL-FS400),上海寰熙醫療器械有限公司;電熱鼓風干燥箱(DL102),天津市實驗儀器廠;真空冷凍干燥機(BK-FD12T),山東博科生物產業有限公司;納米激光粒度儀(Winner802),濟南微納儀器股份有限公司;電子顯微鏡(TM3030 plus),日本日立高新技術公司。

1.3 糠椴木聚糖提取

選擇無變質糠椴,放入高速多功能粉碎機粉碎后用80目篩篩選,得到糠椴粉末。將糠椴粉末在索氏提取器中用95%乙醇溶液抽提12 h,除去蠟質,然后用去離子水洗滌,置于40 ℃電熱鼓風干燥箱中,干燥后取出。取糠椴粉末10 g放入燒杯中,加入150 mL 10%NaOH溶液,在90 ℃下浸提3 h,經過抽濾得到提取液,調節pH為5,將3倍體積的乙醇加到剩余液體中進行醇沉,將得到溶液放在4 ℃冰箱中12 h。濾去多余液體后,用高速離心機在8 000 r/min下離心10 min,重復3次,將得到的物質放入真空冷凍干燥機中凍干。

1.4 木糖標準曲線繪制

分別將0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL木糖標準溶液加到25 mL比色管中,加水至1.0 mL,再加入3 mL的3,5-二硝基水楊酸(DNS)溶液。在沸水浴下蒸煮5 min,冷卻至室溫,加水定容,搖勻,在520 nm處測定木糖溶液吸光度。以不含木糖的溶液作為對照,利用木糖的質量濃度繪制吸光度曲線,最終確定木糖標準曲線。

1.5 木聚糖得率測定

取一定量的木聚糖溶液,調pH至5.5,加入3倍體積的乙醇進行醇沉,置于4 ℃冰箱中過夜,然后在高速離心機5 000 r/min下離心10 min,從離心管中濾去上清液,取其沉淀,加入一定量的0.1 mol/L HCl,于90 ℃水解2 h,中和、定容、過濾,測定濾液的還原糖質量,乘以木聚糖聚合因數0.9作為木聚糖質量,采用DNS法測定還原糖。木聚糖得率(%)=(m1/m2)×100%,式中:m1為提取的木聚糖質量(g);m2為原料質量(g)。

1.6 納米糠椴木聚糖制備

取1 g凍干的糠椴多糖粉末,加入200 mL的5%氫氧化鈉溶液中,在70 ℃下溶解,冷卻至室溫,使用稀鹽酸將pH調至5.5,倒入3倍體積的無水乙醇進行醇沉。將沉淀物在索氏提取器中抽提1.5 h,抽提后,在真空冷凍干燥機冷凍干燥24 h,機械研磨得到淡黃色粉末,即為納米糠椴木聚糖。

1.7 粒徑測定

將制備的納米木聚糖在蒸餾水中充分溶解,超聲分散,利用納米激光粒度儀測定納米木聚糖粒徑。

1.8 響應面法優化工藝

依據中心組合試驗設計原則,將納米木聚糖粒徑作為指標設計3因素3水平響應面分析試驗,因素水平見表1。利用Design Expert 8.6軟件建立的二項式模型分析數據,確定納米木聚糖最佳制備工藝參數。

表1 Box-Behnken 設計因素及水平

1.9 透射電鏡分析

利用HT7800型透射電子顯微鏡(TEM,加速電壓200 kV)對納米木聚糖粒子形態進行觀測。取1滴分散在無水乙醇中的納米木聚糖溶液滴置于鋪有碳膜的銅網上,在溶劑揮發后進行表征。

2 結果與分析

2.1 木糖標準曲線

通過分光光度法測定木糖標準樣品在520 nm波長的吸光度,根據已知木聚糖標準樣品的質量濃度(x)和對應的吸光度(y)繪制標準曲線。建立的回歸方程為y=0.904 6x+0.004 5,線性相關系數R2=0.997 1,見圖1。

圖1 木聚糖質量濃度與吸光度的回歸線性方程Fig.1 Regression linear equation of xylan mass concentration and absorbance

2.2 不同條件對木聚糖得率的影響

2.2.1 堿液質量分數對木聚糖得率的影響

堿液質量分數對木聚糖得率的影響見圖2。由圖2可見:當堿液質量分數為10%時,木聚糖的得率最高;當堿液質量分數超過10%時,大部分木聚糖會隨著堿液質量分數的提高而逐漸水解,可能是因為堿液可以溶解植物細胞壁中的木聚糖,過高的堿液質量分數會使木聚糖發生堿解,斷裂β-1,4糖苷鍵,導致木聚糖鏈降解轉化為低聚木糖和單糖,從而降低了提取率。因此,從糠椴中提取木聚糖的最佳堿液質量分數為10%。

2.2.2 固液比對木聚糖得率的影響

固液比對木聚糖得率的影響見圖3。由圖3可見:當固液比(g/mL)由1∶5增加到1∶15時,木聚糖得率大幅上升;當固液比繼續增加到1∶20時,得率僅僅提高了0.76%。當固液比大于1∶15后,得率隨固液比提高的上升趨勢并不明顯,可能是當固液比為1∶15時,木聚糖在提取液中的溶解度已接近飽和。適量溶劑可以充分溶解和提取木聚糖,但過多的溶劑會導致溶液中的木聚糖濃度過低,從而降低了木聚糖從植物細胞壁向溶液內部擴散的濃度梯度,提取率下降。

圖2 堿液質量分數對木聚糖得率的影響Fig.2 Effect of alkali concentration on the yield of xylan圖3 固液比對木聚糖得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of xylan

2.2.3 處理溫度對木聚糖得率的影響

處理溫度對木聚糖得率的影響見圖4。由圖4可見:當處理溫度為90 ℃時,木聚糖的得率最高,為42.65%。反應溫度繼續提高,木聚糖得率大幅下降,這可能是因為木聚糖的穩定性會隨著溫度升高而降低,當溫度持續上升時,多糖結構受到破壞,木聚糖鏈發生裂解,產生了大量的低聚糖、寡糖和單糖,導致木聚糖得率下降。因此,最佳處理溫度為90 ℃。

2.2.4 處理時間對木聚糖得率的影響

處理時間對木聚糖得率的影響見圖5。由圖5可見:處理時間在60～120 min時,隨著處理時間的增加木聚糖的得率顯著提高;超過120 min后有小幅降低,這是因為當達到飽和狀態后,過長時間的處理會導致溶液中的木聚糖鏈發生降解,產生低聚物,導致木聚糖得率下降。當處理時間為120 min 時,木聚糖得率最大。因此,處理時間應選擇120 min。

圖4 處理溫度對木聚糖得率的影響Fig.4 Effect of treatment temperature on yield of xylan圖5 處理時間對木聚糖得率的影響Fig.5 Effect of processing time on extraction yield of xylan

2.3 各因素對納米木聚糖粒徑的影響

2.3.1 堿液質量分數對納米木聚糖粒徑的影響

堿液質量分數對納米木聚糖粒徑的影響見圖6。由圖6可見:隨著堿液質量分數的提高,納米木聚糖的粒徑呈現下降趨勢,當堿液質量分數超過3%時,納米木聚糖的粒徑呈現大幅上升趨勢,這可能是因為堿液在木聚糖粒子納米化的過程中發揮著催化劑作用,當堿液質量分數較低時,隨著堿液質量分數的提高,對木聚糖粒子向納米木聚糖粒子的分解和轉化起著促進作用;但當堿液質量分數過高時,會破壞木聚糖的長鏈結構,產生小分子物質,大部分木聚糖粒子在納米化的過程中受到阻礙,從而抑制了木聚糖粒子的分解速率。

2.3.2 處理溫度對納米木聚糖粒徑的影響

處理溫度對納米木聚糖粒徑的影響見圖7。由圖7可見:隨著處理溫度的提高,納米木聚糖的粒徑減小,當處理溫度為60 ℃時,粒徑為9.56 nm,達到最小值;當處理溫度超過60 ℃時,納米木聚糖的粒徑增大。這可能是因為當溫度較低時,隨著溫度的升高,提高了大分子木聚糖粒子的反應活性,從而促進了大分子木聚糖粒子向小分子納米木聚糖粒子的轉化;當溫度過高時,納米木聚糖粒子在納米化的過程中表面能升高(吸收了大量熱能),為了降低表面能,大量新生的納米木聚糖粒子會發生團聚現象而達到穩定狀態。因此,當溫度過高時,納米木聚糖的粒徑反而出現上升的情況。

圖6 堿液質量分數對納米木聚糖粒徑的影響Fig.6 Effect of alkali concentration on theparticle size of nanoscale xylan圖7 處理溫度對納米木聚糖粒徑的影響Fig.7 Effect of treatment temperature on particle size of nanoscale xylan

2.3.3 處理時間對納米木聚糖粒徑的影響

處理時間對納米木聚糖粒徑的影響見圖8。由圖8可見:隨著處理時間的增加,納米木聚糖的粒徑呈現變小的趨勢。但當處理時間超過2 h時,納米木聚糖的粒徑反而會大幅增加,這可能是因為當處理時間較短時,木聚糖粒子活性較小,分解和轉化速率很慢;當處理時間增加時,木聚糖粒子逐漸納米化,粒徑達到最小,但如果處理時間過長,大量粒子會出現團聚現象,從而引起納米木聚糖的粒徑大幅上升[18]。

圖8 處理時間對納米木聚糖粒徑的影響Fig.8 Effect of processing time on the particle size of nanoscale xylan

2.4 響應面法優化糠椴納米木聚糖的提取工藝參數

2.4.1 試驗結果及方差分析

通過Design-Expert 8.6軟件進行數據回歸分析,得到二次回歸方程:y=9.63+0.11A+2.84B-2.55C+0.057AB+0.31AC+0.8BC+9.44A2+11.53B2+19.49C2.Box-Behnken 試驗結果見表2,回歸模型方差分析見表3。表1給出了響應面試驗因素設計;表2為根據表1參數設計記錄的17次試驗結果,為建模和優化提供了數據基礎;表3驗證了所建立的回歸模型具有良好的擬合效果和顯著性,可用于優化確定最優條件。

表2 Box-Behnken 試驗結果

表3 回歸模型方差分析

2.4.2 響應面分析

堿液質量分數和處理溫度對納米木聚糖粒徑的影響見圖9,處理溫度和處理時間對納米木聚糖粒徑的影響見圖10。由圖9、10對比可見,圖10建立的3D響應面傾斜度最高,等高線顏色變深,說明處理時間和處理溫度的交互作用最為顯著,其他因素的主效應不明顯。

圖9 堿液質量分數和處理溫度對納米木聚糖粒徑的影響Fig.9 Effect of alkali concentration and treatment temperature on particle size of nanoscale xylan

圖10 處理溫度和處理時間對納米木聚糖粒徑的影響Fig.10 Effect of treatment temperature and processing time on particle size of nanoscale xylan

為了進一步驗證不同因素對響應值影響的統計學意義,我們對回歸方程系數進行了顯著性檢驗[19],結果見表4。表4檢驗結果也顯示處理溫度B和處理時間C及其交互項BC對粒徑影響達極顯著水平(P<0.000 1),而堿液質量分數A和其交互項AB、AC的影響不顯著(P>0.05),這與響應面分析結果一致,表明處理溫度和時間是決定納米木聚糖粒徑的主效應因素。為確定響應面模型的最優點,分析建立的回歸方程數據,結果表明:當處理溫度為58.74 ℃、處理時間為3.03 h、堿液質量分數為3%時,納米木聚糖粒徑最小,為9.36 nm。

表4 回歸方程系數顯著性檢驗

為了檢驗試驗的可靠性,在最佳制備條件下制備納米木聚糖。同時,考慮到實際操作的方便性,將最佳制備條件調整為處理溫度59 ℃,處理時間2 h,堿液質量分數3%,在此處理條件下,納米木聚糖的粒徑為9.36 nm。如圖11所示(綠色代表通過率,紅色代表粒徑占比),在此優化條件下經過多次試驗驗證得到的納米木聚糖粒徑為9.58 nm,與納米木聚糖粒徑的理論值9.36 nm相比,相對誤差為2.2%。由此表明,試驗結果與模型預測吻合度較高,驗證了響應面法求解最優點的準確性,也表明優化后的工藝條件能夠較好地控制產品粒徑,獲得粒徑較小、分布較均勻的納米木聚糖產品。因此,采用響應面法優化納米木聚糖最佳制備條件參數準確、可靠,具有非常高的實用價值[20]。

圖11 納米木聚糖粒徑Fig.11 Nanometer xylan particle size

2.5 透射電鏡分析

為了進一步驗證納米木聚糖的粒徑,使用透射電子顯微鏡觀察納米木聚糖的形態,并測量粒子大小,見圖12。圖12 a、b、c分別為納米木聚糖在500、200、200 nm下的透射電鏡圖像。

圖12 納米木聚糖TEM圖Fig.12 TEM image of nano xylan

由圖12可見:納米木聚糖粒子接近于圓狀的且形狀較規則;粒徑在20～40 nm,這一結果與粒徑測定結果相符;納米木聚糖粒子聚集在一起,這是因為表面能高,納米木聚糖發生了團聚現象。

3 結 論

采用響應面法對糠椴木聚糖的堿法提取與納米木聚糖制備工藝進行了優化。通過試驗確定了糠椴木聚糖最佳提取工藝參數,即以糠椴為原料,堿液質量分數為10%,處理溫度為90 ℃,處理時間為3 h,固液比為1∶15(g/mL),在此條件下,能夠有效地從糠椴中提取出木聚糖;納米木聚糖的最佳制備工藝參數為處理溫度59 ℃,處理時間2 h,堿液質量分數5%,在此條件下得到的納米木聚糖粒徑為9.36 nm;通過透射電子顯微鏡觀察發現,納米木聚糖呈現出接近于圓形的形態,形狀規則,粒徑基本在20～40 nm,這個結果與納米激光粒度儀的粒徑測試結果相符合,證實了按照上述工藝制備的納米木聚糖的質量和粒徑。

本研究驗證了響應面法在工藝參數優化中的有效性,同時為從糠椴中提取木聚糖、制備納米木聚糖并確認其粒徑提供了一種有效方法,具有一定的理論價值和應用價值。