多交叉置換擴增聯合納米生物傳感器技術對低病毒載量慢性乙型肝炎人群快速診斷價值

賀瀟瑾, 周 娟, 龍云鑄, 李 丹, 歐陽靜, 袁 婷, 卿 玲, 譚英征

中南大學湘雅醫學院附屬株洲醫院 感染內科,湖南 株洲 412006

慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一個重大的全球公共衛生問題,可導致病毒性肝炎、肝纖維化、肝硬化乃至原發性肝細胞癌的發生[1]。明確診斷后積極抗病毒治療可有效抑制HBV DNA的復制,并最大程度減輕肝細胞壞死、炎癥及纖維化、肝小葉增生等,是延緩疾病進展及改善預后的有效手段[2]。但有臨床研究發現,20%～40%長期規律接受一線核苷(酸)類似物治療的患者仍處于低病毒血癥狀態(low level viremia,LLV)[3],即采用靈敏的定量聚合酶鏈反應法(quantitave polymerase chain reaction,qPCR)檢測血清HBV DNA持續或間歇大于檢測下限但低于2 000 IU/ml[4]。LLV可導致耐藥風險增加、病毒學突破、肝纖維化進展、肝硬化進展、肝癌風險增加等一系列臨床危害[5],因此,開發新的技術以提高檢測HBV的靈敏度和特異性對于指導低病毒載量慢性乙型肝炎人群的臨床管理至關重要,也有助于實現最終達到治愈乙型肝炎的目標。多交叉置換擴增(multiple cross displacement amplification,MCDA)是一種新型擴增技術,能夠在恒溫條件下快速、敏感、特異地擴增核酸,明顯提高檢測效率[6]。近年來,MCDA已被用于檢測許多病原體,如結核分支桿菌[7]、膿腫分枝桿菌[8]、李斯特菌[9-10]、腦膜炎奈瑟菌[11]、布魯氏菌[12]、白色念珠菌[13]等。MCDA產物可以通過多種技術進行分析,包括瓊脂糖凝膠、濁度法、比色法及納米生物傳感器(nanoparticle-based lateral biosensor,LFB)等。其中,LFB是一種特異的核酸檢測裝置,其根據MCDA的陽性產物可以在1～2 min內顯示結果,陰性表現為一條線,陽性為兩條線,直接肉眼觀察即可判斷。既往研究表明,MCDA聯合LFB具有相對特異、敏感、經濟、快速、簡單等特點[7,9-13]。本研究以HBV S基因為靶標,擬應用MCDA-LBF技術建立一種針對HBV的簡單、快速、經濟、有效的診斷方法,同時比較MCDA-LBF與qPCR對臨床實際樣本的檢測能力,以評估MCDA-LFB檢測HBV的應用價值?，F報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取株洲市中心醫院自2020年4月至2022年4月收治的42例擬聯合聚乙二醇干擾素α-2b(pegylated interferon alpha-2b,Peg-IFNα-2b)抗病毒治療的核苷(酸)類似物經治低病毒載量慢性乙型肝炎患者和同期的15例健康受試者為研究對象。慢性乙型肝炎符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[1]診斷標準,排除合并其他嗜肝病毒感染和人類免疫缺陷病毒感染。所有研究對象均簽署知情同意書。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 檢查方法 所有研究對象分別于聯用Peg-IFNα-2b抗病毒治療前、治療24周后、治療48周后空腹采集靜脈血5 ml,分離血清后-80℃低溫保存備用。所有血樣標本分別采用MCDA-LFB和qPCR兩種方法進行HBV DNA平行檢測。

1.3 主要試劑及儀器 HBV和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核酸標準物質(北京擎科生物科技有限公司);DNA核酸提取試劑盒(西安天隆科技有限公司);超敏HBV DNA熒光定量試劑盒(湖南圣湘生物科技有限公司);MCDA核糖核酸擴增試劑盒和納米生物傳感檢測條(天津捷易特生物科技有限公司);孔雀石綠(malachite green,MG)比色指示劑(北京海泰正元科技有限公司);引物合成(北京擎科生物科技公司);實時熒光聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增儀(美國ABI公司);實時濁度儀和Nano drop 2000分光光度計(美國Bio-Rad公司)。

1.4 MCDA-LFB 嚴格按照操作說明書進行實驗,采用DNA核酸提取試劑盒提取DNA模板,通過Nano drop 2000進行定量后,保存于-20℃冰箱待檢。參考相關資料,采用PRIMER PRIMER 5.0軟件設計10條引物(表1),采用BLAST分析工具驗證HBV-MCDA引物的特異性,引物合成后用高效液相色普級別純化。HBV-MCDA反應體系為25.0 μl,其中包含反應緩沖液12.5 μl,1.0 μl BstDNA聚合酶(8 U),擴增引物CP1和CP2各40.0 pmol,C1、D1、R1、C2、D2、R2各20.0 pmol,F1和F2各10.0 pmol,以及1.0 μl DNA模板。將以上混合物置于實時濁度儀中,65℃恒溫擴增30 min,閾值>0.1視為陽性擴增。實驗中用HBV核酸標準品為陽性對照,HCV核酸標準品為陰性對照,蒸餾水為空白對照。為驗證HBV-MCDA的敏感性,將HBV核酸標準物質分別稀釋為5.0 IU/ml、0.5 IU/ml。擴增產物采用比色指示劑(MG)和LFB兩種方法進行檢測及驗證。對于MG檢測,反應體系的顏色由無色變為淺綠色表明陽性擴增,顏色保持無色為陰性擴增。在LFB檢測中,對照線和檢測線同時出現為陽性擴增,僅出現對照線為陰性擴增。上述實驗均重復進行3次。

表1 HBV-MCDA引物信息

1.5 統計學方法 采用SPSS 26.0統計學軟件對數據進行處理。計數資料以例(百分率)表示,組間比較采用χ2檢驗。一致性分析采用Kappa檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HBV-MCDA產物檢測及驗證 稀釋為5.0 IU/ml的HBV核酸標準物質為陽性擴增結果,而稀釋為0.5 IU/ml的HBV核酸標準物質、HCV核酸標準物質、蒸餾水為陰性結果。見圖1。本研究用于HBV S基因檢測的HBV-MCDA引物對于建立HBV-MCDA檢測方法的特異性良好,HBV-MCDA的最低檢測下限為5.0 IU/ml。

圖1 HBV-MCDA產物檢測及驗證[a.HBV-MCDA擴增產物采用比色指示劑(MG)肉眼觀察顏色變化進行分析:A1管為HBV核酸標準物質陽性擴增(稀釋為5.0 IU/ml),A2管為HBV核酸標準物質陰性擴增(稀釋為0.5 IU/ml),A3管為HCV核酸標準物質陰性對照(稀釋為0.5 IU/ml),A4管為蒸餾水空白對照(稀釋為0.5 IU/ml);b.LFB對HBV-MCDA擴增產物的可視化檢測:LFB-B1為HBV核酸標準物質陽性擴增(稀釋為5.0 IU/ml),LFB-B2為HBV核酸標準物質陰性擴增(稀釋為0.5 IU/ml),LFB-B3為HCV核酸標準物質陰性對照(稀釋為0.5 IU/ml),LFB-B4為蒸餾水空白對照(稀釋為0.5 IU/ml)]

2.2 聯合Peg-IFNα-2b治療前病毒載量檢測結果比較及一致性分析 MCDA-LFB、qPCR兩種方法檢測的HBV DNA下限分別為5 IU/ml、20 IU/ml。因此,本實驗規定HBV DNA>20 IU/ml為檢測結果陽性,反之為陰性。在57例樣本的基線HBV DNA平行檢測中:MCDA-LFB檢出陽性標本42例,陽性檢出率為73.7%(42/57),陰性檢出率為26.3%(15/57);qPCR檢出陽性標本38例,陽性檢出率為66.7%(38/57),陰性檢出率為33.3%(19/57)。見表2。兩種方法的陽性檢出率比較,差異無統計學意義(P=0.125)。進一步行一致性分析,結果顯示,Kappa=0.833,P<0.001,說明兩種方法的診斷結果存在較好的一致性。

表2 MCDA-LFB、qPCR檢測臨床樣本的基線HBV DNA結果比較/例

2.3 聯合Peg-IFNα-2b治療不同階段病毒載量檢測結果比較及一致性分析 在治療24周后,MCDA-LFB陽性檢出率為49.1%(28/57),qPCR陽性檢出率為7.0%(4/57),MCDA-LFB陽性檢出率高于qPCR,差異有統計學意義(P<0.001);Kappa=0.295,P=0.035,提示兩種方法存在一致性,但一致性情況較基線水平(Kappa=0.833,P<0.001)明顯下降。在治療48周后,MCDA-LFB陽性檢出率為33.3%(19/57),qPCR陽性檢出率為3.5%(2/57),MCDA-LFB陽性檢出率高于qPCR,差異有統計學意義(P<0.001);Kappa=0.136,P=0.042,提示兩種方法一致性成立,但一致性情況較差。

3 討論

雖然乙型肝炎疫苗已在全球普及,但HBV感染及其所致的相關肝病仍是我國乃至全世界需要攻克的一大難題。HBV感染肝后,病毒的持續復制是導致疾病進展的重要原因,因此,HBV的檢測對于抗病毒治療的決策及長期疾病進展的監測至關重要。目前,酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和PCR相關技術是臨床上應用廣泛的HBV鑒定方法[14]。ELISA是基于針對HBV抗原或抗體的血清學反應,只能反映HBV的免疫應答狀態,且在感染的早期階段敏感性較低;qPCR檢測HBV DNA具有靈敏度高、特異性好的特點,現已成為監測HBV復制最常用的檢測手段之一[15]。但qPCR需要依賴昂貴的熱循環儀器來擴增靶基因,且檢測繁瑣、耗時,在許多資源有限的地區無法廣泛開展。本研究建立了一種簡單、低成本、敏感性和特異性均較好的MCDA-LFB方法來檢測HBV。

MCDA技術根據目標基因序列保守區域設計10條引物特異性識別靶序列上的10個獨立區域,在恒溫條件下(約58℃～69℃),在一種置換酶聚合酶的作用下,短時間內(15～40 min)引起多循環鏈置換反應,大量合成目標DNA[16],因此,反應特異性強,且快速、敏感。LFB具有較高的生物相容性、吸附性及反應活性,被廣泛用于檢測一些病原體的MCDA產物[17]。相較于瓊脂凝膠電泳、濁度分析和比色指示劑檢測,LFB可以更加客觀、準確且快速地判斷出結果。本研究參考了相關文獻及設備[18],根據MCDA作用機制設計了10條HBV-MCDA引物,特異性識別HBV S基因10個區域,在65℃恒溫擴增30 min,通過比色法及LFB分析擴增結果。結果顯示:稀釋為5.0 IU/ml的HBV核酸標準物質為陽性擴增結果,而稀釋為0.5 IU/ml的HBV核酸標準物質、HCV核酸標準物質、蒸餾水為陰性結果;本研究用于HBV S基因檢測的HBV-MCDA引物對于建立HBV-MCDA檢測方法的特異性良好,HBV-MCDA的最低檢測下限為5.0 IU/ml。目前,我院已開展的高敏qPCR檢測HBV DNA最低下限是 20 IU/ml,檢測時間約2～3 h,費用較高。相比之下,HBV的MCDA-LFB檢測方法不僅操作時間短,所有流程在1 h內能夠實現,而且所需的設備較為簡單,提供恒溫設備即可實現此項技術的應用,成本相對較低,同時,該項檢測具備較高的特異性和更高的敏感性,因此,對于臨床上提高HBV感染的診斷率、降低漏診率具有極大的輔助作用。

在慢性乙型肝炎患者抗病毒治療過程中,每個個體治療應答情況不盡相同,有臨床研究證實,部分慢性乙型肝炎患者長期接受核苷(酸)類似物治療后仍持續或間接存在LLV,且其與多種臨床不良結局相關[19]。由于檢測下限的不同,LLV的檢出率也存在較大差異。目前,國內針對HBV DNA的高敏qPCR檢測下限多為20 IU/ml,隨著檢測技術的進步,當采用更高靈敏的檢測方法時,既往認為持續完全病毒學應答的患者可能會被歸類為LLV。因此,近期有學者提出極低水平病毒血癥(very low-level viremia,VLLV)的概念,即定義為HBV DNA<20 IU/ml但大于更高靈敏PCR的檢測下限(5～10 IU/ml),在部分VLLV患者中可以觀察到有肝硬化、肝癌等不良事件發生[20]。在本研究中:聯合Peg-IFNα-2b治療前,MCDA-LFB陽性檢出率為73.7%(42/57),qPCR陽性檢出率為66.7%(38/57),兩種方法的陽性檢出率比較,差異無統計學意義(P=0.125);一致性分析結果顯示,Kappa=0.833,P<0.001,兩種方法的診斷結果存在較好的一致性。但隨著聯用Peg-IFNα-2b抗病毒治療后,出現病毒學應答的患者增加,在治療24周、48周后,兩種方法的檢出率一致性明顯下降,MCDA-LBF的陽性檢出率高于qPCR。

本研究存在一定的局限性。首先,MCDA-LFB是對HBV DNA的定性測定,不能確定樣本中的病原體數量,因此,需要設計一個更精確的研究實現定量測定。其次,盡管MCDA-LFB具有較高的特異性和敏感性,但仍需要控制實驗室污染造成假陽性結果的可能,通過第三方試劑幫助驗證。最后,本研究中的研究對象選擇并非完全隨機,還需要通過大樣本、多中心的數據來驗證檢測方法的適用性。

綜上所述,MCDA-LFB是一種敏感、特異、經濟、簡單、快速的檢測方法,可用于低病毒載量慢性乙型肝炎人群的診斷,尤其對于抗HBV治療后的極低病毒水平檢測,MCDA-LFB比qPCR更敏感。HBV MCDA-LFB擴增效率高,操作過程簡單,更節省時間和成本,且具有更高的敏感性,有成為經濟欠發達且缺少檢測設備地區進行HBV快速檢測及指導慢性乙型肝炎患者臨床管理新方法的巨大潛力。