結直腸癌組織中錯配修復蛋白及腫瘤相關巨噬細胞與臨床病理特征相關性

惠 虹, 胡亞翎, 蔡 堃, 鐘抒宇, 李 飛, 姚春梅

淮北礦工總醫院1.病理科;2.胃腸外科;3.腫瘤放療科,安徽 淮北 235000

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是消化系統常見的惡性腫瘤,早期癥狀不明顯,隨著腫瘤生長而逐漸出現排便習性改變、便血和腹瀉等癥狀,嚴重影響患者生活質量[1-3]。錯配修復(mismatch repair,MMR)是細胞間相互作用的重要紐帶,通過在DNA復制、基因重組及外源損傷等過程中糾正DNA雙螺旋上錯配的堿基對,以維持和保障靶細胞基因組的穩定,從而降低基因突變概率[4-6]。MMR的缺失加速正常突變,誘發原癌基因和抑癌基因的聚集或失活,從而引發癌變[7-8]。多項研究證實,CRC與MMR蛋白表達相關,其中約15%的CRC由MMR蛋白表達缺失所引起[9-11]。本研究旨在探討CRC組織中MMR蛋白及腫瘤相關巨噬細胞與臨床病理特征的相關性?，F報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取淮北礦工總醫院自2020年1月至2023年8月收治的81例CRC患者的癌組織及癌旁組織為研究對象。納入標準:確診為CRC,且術后病理檢測再次證實為CRC;腫瘤分期(tumor node metastasis,TNM)為Ⅰ～Ⅳ期[12];術后均接受輔助化療。排除標準:合并其他部位惡性腫瘤或嚴重器官功能衰竭者;無法提供完整病理組織樣本或臨床數據不全者;合并免疫系統疾病或正在接受免疫抑制治療者。其中,男性48例,女性33例;平均年齡(69.98±10.13)歲;直腸癌38例;結腸癌43例。本研究經醫院倫理委員會批準。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 免疫組化染色 癌組織及癌旁組織均浸泡至10%中性緩沖甲醛溶液中24 h,通過取材、脫水、透明、浸蠟、包埋和切片處理后,得到組織蠟片。采用全自動免疫組化染色儀(德國Leica公司)將處理好的組織蠟片進行免疫組化染色。一抗為鼠抗人單克隆抗體、錯配修復系統同源蛋白2(muts homolog 2,MSH2)抗體(克隆號RED2)、錯配修復系統同源蛋白6(muts homolog 6,MSH6)抗體(克隆號EP49)、錯配修復系統蛋白2(postmeiotic segregation increased 2,PMS2)抗體(克隆號EP51)及錯配修復系統同源物1(mutl homolog 1,MLH1)抗體(克隆號GM002)。巨噬細胞標志蛋白163(cluster of differentiation 163,CD163)(克隆號10D6),巨噬細胞標志蛋白68(cluster of differentiation 68,CD68)(克隆號KP1)等均購自上?；蚩萍脊煞萦邢薰?。免疫組化試劑盒與二氨基聯苯胺顯色液均購自徠卡生物系統(紐卡斯爾)有限公司。

1.3 染色結果判定 采用徠卡光學顯微鏡[型號DM2500,徠卡生物系統(紐卡斯爾)有限公司]進行染色結果判定。如果目標細胞的目標區域出現黃褐色或棕黃色顆粒,判定為陽性細胞。無顏色標記定為0分,淡黃色標記定為1分,棕黃色標記定為2分,深褐色標記定為3分。視野內無陽性細胞定為0分,0<陽性細胞占比<10%定為1分,10%≤陽性細胞占比≤50%定為2分,50%<陽性細胞占比<75%定為3分,陽性細胞占比≥75%定為4分。兩項評分相加定為最終的染色結果。分數>3分為蛋白表達正常,分數≤3分為蛋白表達缺失。MLH1、MSH2、MSH6和PMS2均正常表達判定為蛋白表達正常,蛋白表達缺失≥1種判定為蛋白表達缺失。先于低倍鏡下確定陽性染色數量高密度區域,后于高倍鏡下對陽性細胞進行計數。當CD68陽性細胞<22個、CD163陽性細胞<19個時判定為低表達,反之判定為高表達。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行處理。計數資料用例(百分率)表示,組間比較采用χ2檢驗。采用多因素Logistic回歸分析篩選CRC組織中MMR蛋白缺失、腫瘤相關巨噬細胞標志物高表達的危險因素。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRC患者MMR蛋白表達情況 81例CRC患者中, MMR蛋白表達正常69例(85.19%),MMR蛋白表達缺失12例(14.81%)。其中,僅MSH6缺失1例(1.23%),僅PMS2缺失2例(2.47%),MSH6和PMS2缺失2例(2.47%),MSH2和MSH6缺失2例(2.47%),MLH1和PMS2缺失5例(6.17%)。

2.2 CRC患者腫瘤相關巨噬細胞標志物表達情況 81例患者中,CD68低表達42例(51.85%),高表達39例(48.15%);CD163低表達46例(56.79%),高表達35例(43.21%)。

2.3 MMR蛋白、腫瘤相關巨噬細胞標志物表達與臨床病理特征相關性 CRC患者MMR蛋白表達與腫瘤直徑、腫瘤部位、TNM分期、組織分化相關(P<0.05),與性別、腫瘤形態、病理類型無關(P>0.05)。腫瘤相關巨噬細胞標志物CD68、CD163與腫瘤直徑、TNM分期、組織分化相關(P<0.05),與性別、腫瘤形態、腫瘤部位、病理類型無關(P>0.05)。見表1。

表1 CRC患者MMR蛋白表達、腫瘤相關巨噬細胞標志物與臨床病理特征相關性/例(百分率/%)

2.4 MMR蛋白缺失、腫瘤相關巨噬細胞標志物高表達危險因素的多因素Logistic回歸分析 腫瘤直徑≥5 cm、腫瘤位于右半結腸、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期和中至中-低分化均為MMR蛋白缺陷高表達的獨立危險因素(P<0.05);腫瘤直徑≥5 cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期和中至中-低分化均為腫瘤相關巨噬細胞標志物高表達的獨立危險因素(P<0.05)。見表2～4。

表2 MMR蛋白缺失危險因素的多因素Logistic回歸分析

表3 CD68高表達危險因素的多因素Logistic回歸分析

表4 CD163高表達危險因素的多因素Logistic回歸分析

3 討論

CRC來源于致癌基因的激活和抑癌基因的失活,這些變化均導致基因微結構改變,從而致使基因組突變,促進惡性細胞增殖和轉移[10]。MMR通過修復堿基和插入/缺失錯配來防止積累的突變DNA復制錯誤,以確保遺傳信息的穩定性[11]。MMR蛋白缺失直接導致MMR系統功能缺失,從而使得錯配的堿基DNA片段不能被切除,致使DNA損傷并產生基因突變,促使突變聚集繼而形成腫瘤。有研究報道,12種MMR基因/蛋白比較容易發生突變,主要的家族成員包括MLH1、PMS2、MSH2和MSH6[12]。有研究報道,惡性腫瘤病理特征與MMR表達缺失明顯相關[13]。與蛋白表達正常的CRC患者比較,蛋白表達缺失的CRC患者更容易出現直徑>5 cm的腫瘤、腫瘤更易出現在右半結腸和分化程度更差。MMR蛋白缺失具有顯著的特征,包括分化程度差、腫瘤膨脹性增長,少見淋巴細胞反應。這可能是MMR蛋白缺失引發微衛星不穩定性,誘導腫瘤發生和發展的結果。因此,MMR可為早期診斷和抗腫瘤治療提供思路。巨噬細胞是免疫反應的重要組成部分,在各種疾病微環境中發揮不同的作用[14]。CD68特異性表達于巨噬細胞中,并在細胞碎片清除中發揮作用[15]。CD163是一種I型膜蛋白,參與免疫細胞的內吞作用,保護目標組織免受氧化損傷[16]。

本研究結果顯示,CRC患者MMR蛋白表達與腫瘤直徑、腫瘤部位、TNM分期、組織分化相關(P<0.05),與性別、腫瘤形態、病理類型無關(P>0.05)。腫瘤相關巨噬細胞標志物CD68、CD163與腫瘤直徑、TNM分期、組織分化相關(P<0.05),與性別、腫瘤形態、腫瘤部位、病理類型無關(P>0.05)。MMR蛋白的表達與腫瘤的侵襲性特征如腫瘤直徑和組織分化程度相關,可能反映出MMR系統在腫瘤細胞的遺傳穩定性中的重要角色;而腫瘤部位的相關性可能暗示了腸道不同區域的微環境因素對MMR蛋白表達的潛在影響[17]。CD68與CD163的表達與晚期腫瘤特征相關,可能反映出腫瘤微環境中巨噬細胞在腫瘤進展和惡化中的促進作用[18]。本研究中多因素Logistic回歸分析結果顯示,腫瘤直徑≥5 cm、腫瘤位于右半結腸、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期和中至中-低分化均為MMR蛋白缺陷高表達的獨立危險因素(P<0.05);腫瘤直徑≥5 cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期和中至中-低分化均為腫瘤相關巨噬細胞標志物高表達的獨立危險因素(P<0.05)。這提示,MMR蛋白缺失在大直徑腫瘤和右半結腸的CRC患者中更為常見,可能反映了腸道不同部位的腫瘤生物學行為差異[19-21]。高表達的CD68和CD163與晚期、低分化腫瘤顯著相關,進一步證實其在腫瘤免疫逃逸和侵襲性增加中的重要作用[22]。

綜上所述,CRC組織中MMR蛋白表達與腫瘤直徑、腫瘤部位、TNM分期和組織分化相關,腫瘤相關巨噬細胞標志物表達與腫瘤直徑、TNM分期和組織分化相關。