CDGSH鐵硫結構域1在肺纖維化和鐵死亡中的作用與機制

龐昕洳 劉乃國

濱州醫學院附屬醫院醫學研究中心 山東 濱州 256603

肺纖維化是一種慢性致死性間質性肺疾病,以細胞外基質異常沉積和肺泡結構嚴重破壞為特征[1]。目前,肺纖維化疾病預后極差,治愈率低。因此,尋找新的治療靶點及治療策略具有重要意義。鐵死亡是一種鐵依賴性程序性細胞死亡[2],在形態方面主要表現為線粒體膜收縮,膜密度增加,線粒體嵴減少,核膜完整[3],在生物化學方面表現為鐵超載、活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高、脂質過氧化產物的積累[4-6]。erastin是公認的鐵死亡小分子誘導劑[7]。經博來霉素處理的肺泡II型細胞出現鐵積累,鐵超載導致線粒體損傷,誘發鐵死亡,最終發展為肺纖維化[8]。CDGSH鐵硫結構域1(CDGSH iron sulfur domain 1,CISD1)基因位于染色體10q21.1,該基因編碼的CISD1蛋白相對分子質量約為12.2×103[9],是錨定在線粒體外膜上的鐵硫蛋白[10],調節線粒體的生物學功能以及線粒體中鐵和ROS的水平[11]。CISD1的缺失導致線粒體鐵超載和氧化損傷[12]。抑制CISD1可增強Fe2+介導的線粒體脂質過氧化,進一步促進鐵死亡[13]。穩定CISD1的鐵硫簇可能會阻礙線粒體對鐵的攝取、脂質過氧化和鐵死亡[13]。雖然鐵代謝與肺纖維化和鐵死亡密切相關,但鐵代謝相關基因CISD1在肺纖維化中的作用尚未見報道,肺纖維化與鐵死亡的關系也不清楚。本研究旨在以人類非小細胞肺癌細胞(A549細胞)為研究對象,研究CISD1在肺纖維化和鐵死亡中的作用及其氧化應激相關機制,為豐富肺纖維化的發病機制和尋找新的治療策略提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 A549 細胞(普諾賽生命科技有限公司,中國),培養于Ham’s F-12K基礎培養基(普諾賽生命科技有限公司)+10% FBS(Sigma公司,德國)培養基中。在5% CO2培養箱中,37℃培養。當培養細胞融合度達到80%左右時,用0.25%胰蛋白酶消化細胞,進行傳代。

1.2 細胞分組及處理 A549細胞培養24 h后隨機分為對照組(C組)、TGF-β1組(T 組)、erastin組(E組)、TGF-β1+erastin組(T+E 組)、TGF-β1+ NL-1組(T+N 組)5組。 本研究所用的藥物濃度如下:TGF-β1(Sigma公司,德國)5 ng/mL,erastin (Sigma公司,德國)10 μmol/L,NL-1 (Med Chem Express公司,美國)40 μmol/L。在倒置顯微鏡下觀察細胞形態。分別在處理后6、12、24、36、48 h收集細胞,用于進一步檢測。

1.3 熒光定量PCR檢測 使用Trizol試劑(賽默飛公司,中國)提取細胞中總RNA,再將提取的總RNA反轉錄為cDNA。以GAPDH為內參檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)、E-鈣粘蛋白(E-cadherin,E-Ca)、CISD1的表達,PCR反應條件為:95℃ 5 min,95℃ 15 s,59℃ 30 s,72℃ 30 s,共40個循環。各個基因引物序列見表1。

表1 用于實時定量PCR的引物序列

1.4 Western blot測定 收集各組A549細胞,提取總蛋白,蛋白按每孔30 μg進行上樣,用12% SDS-PAGE凝膠進行電泳分離,轉移到硝酸纖維素膜上,分別用CISD1一抗(稀釋比例為1∶2 000)和GAPDH一抗(稀釋比例為1∶500)進行4℃孵育過夜,加入羊抗兔或羊抗鼠偶聯二抗,室溫孵育2 h,使用ECL Plus化學發光系統進行顯影,Image J 軟件分析條帶灰度值,計算目的蛋白相對表達量。

1.5 細胞活力檢測 A549細胞接種于96孔培養板,各處理組分別于6、12、24、36、48 h后,將10 μL增強CCK-8溶液(伊萊瑞特生物科技有限公司,中國)依次加入相應的孔中,在37℃、5% CO2條件下孵育1 h,使用酶標儀(Thermo Fisher公司)在450 nm波長處測量吸光度。細胞活力計算公式為:(OD450 sample-OD450 blank)/(OD450 control-OD450 blank)×100%。

1.6 線粒體活性氧(mitoROS)測定 不同組A549細胞用100 μL MitoSOX Red試劑工作液(MedChemExpress公司,美國)在37℃避光孵育15 min,然后用無血清Ham′s F-12K培養基洗滌2～3次。用倒置熒光顯微鏡拍攝熒光圖像(Olympus,日本),平均熒光強度用Image J(NIH)軟件量化。

1.7 細胞內Fe2+含量的檢測 各組細胞在處理6、12、24、36、48 h后收集1×106細胞,PBS洗滌2次。每個樣品加入0.2 mL緩沖液?；旌虾笾糜诒狭呀?0 min,15 000g離心10 min,收集上清液。按照Elabscience?細胞亞鐵檢測試劑盒(伊萊瑞特生物科技有限公司,中國)的說明測定Fe2+水平。使用酶標儀(Thermo Fisher公司)在593 nm波長處測量吸光度。測定不同濃度下標準樣品的吸光度,繪制標準曲線,進而測定樣品中的Fe2+濃度。

1.8 4-羥基壬烯醛(4-HNE)測定 將每組1×106細胞重懸于150 μL PBS中,用超聲波處理器破碎。收集上清液,參照4-HNE酶聯免疫吸附測定試劑盒(伊萊瑞特生物科技有限公司,中國)的說明測定4-HNE水平。用酶標儀(Thermo Fisher公司)在450 nm處測定反應混合物的光密度(OD值),用OriginPro軟件將光密度值轉換為4-HNE濃度。

2 結果

2.1 各組細胞中CISD1的表達 在各時間點T組和E組中CISD1 mRNA和蛋白質表達水平均顯著低于C組的表達(P<0.01)。T+E組中CISD1 mRNA及蛋白質表達水平均顯著低于C組(P<0.01)、T組(P<0.01)和 E組(P<0.01)。在處理后24～48 h,與T組比較,T+N組CISD1 mRNA和蛋白表達量顯著降低(P<0.01),見圖1。這說明,NL-1處理抑制了CISD1表達,TGF-β1和erastin處理也會抑制CISD1的mRNA和蛋白表達,且呈現協同作用。

A.Western blot檢測得到的不同處理組CISD1的蛋白表達;B.Western blot檢測各處理組中CISD1蛋白質表達的結果定量并均一化;C.各組中CISD1 mRNA表達水平。與C組比較,**P<0.01;與T組比較,△P<0.05,△△P<0.01;與E組比較,##P<0.01。

A.α-SMA mRNA表達水平;B.E-Ca mRNA表達水平。與C組比較,*P<0.05,**P<0.01;與T組比較,△△P<0.01;與E組比較,##P<0.01。

2.2 ɑ-SMA和E-CamRNA在各處理組細胞中的表達情況 T組、E組中的α-SMAmRNA表達量在處理后12～48 h高于C組的表達(P<0.01)。與T組比較,T+E組α-SMAmRNA表達量在處理后6～24 h均升高(P<0.01),但處理后36、48 h時均降低(P<0.01)。在處理后24～48 h,T+N組α-SMAmRNA表達量顯著高于T組的表達(P<0.01),見圖2A。與C組比較,T組E-CamRNA表達量在整個實驗過程中均顯著降低(P<0.01)。在處理后12～48 h,E組E-Ca mRNA表達量顯著低于C組(P<0.01)。在處理后6～24 h,T+E組E-CamRNA表達量顯著低于T組(P<0.01),但在處理后36、48 h明顯高于T組(P<0.01)。T+N組各時間點E-CamRNA表達水平均顯著低于T組,見圖2B。

2.3 不同處理后A549細胞的形態學變化 與C組比較,T組、T+ E組和T+N組從處理12 h開始細胞形態發生明顯變化。這些細胞由最初的多邊形逐漸轉變為成纖維細胞樣形態,這提示,細胞形態的改變是由TGF-β1引起的。E組和T+E組細胞在處理后24 h開始出現細胞死亡,并呈聚集性細胞死亡現象,細胞死亡數量隨著時間的延長逐漸增加,直至48 h。T+N組細胞在處理后24 h后出現一定程度的細胞死亡,未見死亡細胞聚集。見圖3。

圖3 不同處理組中A549細胞的形態表現

2.4 細胞活力分析 CCK-8檢測顯示,T組細胞活力與C組比較無明顯變化,從處理后12 h開始,E組細胞活力顯著低于C組(P<0.01)。處理后12～48 h,T+E組細胞活力顯著低于T組(P<0.01),整個時間段細胞活力均低于C組(P<0.01)。從處理后24 h開始,T+N組細胞活力顯著低于T組(P<0.01)。見圖4。

與C組比較,**P<0.01;與T組比較,△P<0.05,△△P<0.01。

2.5 抑制CISD1表達可增強線粒體活性氧(mitoROS)含量 在各時間點T組、E組和T+E組中的mitoROS水平均顯著高于C組(P<0.01)。自處理后6～36 h,T+E組的mitoROS水平明顯高于T組(P<0.01)和E組(P<0.01)。從處理后24 h開始,T+N組mitoROS水平顯著高于T組,且隨時間增加呈上升趨勢(P<0.01)。見圖5。

A.不同組線粒體活性氧隨時間的熒光圖像(400×,Bar = 20 μm);B.各處理組A549細胞中線粒體活性氧的相對定量。與C組比較, **P<0.01;與T組比較,△△P<0.01;與E組比較,##P<0.01。

2.6 抑制CISD1表達可提高細胞內Fe2+和4-HNE水平 與C組比較,T組的Fe2+水平從處理后12 h開始顯著升高(P<0.01),從處理后6 h開始,E組的Fe2+水平高于C組(P<0.01)。與T組比較,T+E組Fe2+水平在處理后24 h前升高(P<0.01),處理后24 h后低于T組(P<0.01)。處理后24～48h, T+N組Fe2+水平顯著高于T組(P<0.01)。這說明,NL-1抑制CISD1可以導致Fe2+水平升高,見圖6A。與C組比較,處理后12～48 h,T組、E組、T+E組、T+N組4-HNE水平顯著升高(P<0.01)。自處理后6 h開始,T+E組的4-HNE水平明顯高于T組(P<0.01)和 E 組(P<0.01)。從處理后24 h開始,T+N組4-HNE水平顯著高于T組(P<0.01),見圖6B。

3 討論

3.1 TGF-β1和erastin分別誘導A549細胞EMT和鐵死亡 上皮間質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是肺纖維化發展的關鍵過程[14]。轉化生長因子-β1(TGF-β1)誘導A549細胞的EMT通常被用作體外肺纖維化模型[15]。在EMT過程中,間充質標志物如α-SMA的表達上調,上皮標記蛋白如E-ca的表達下調,導致上皮細胞粘附受損,結構改變,最終促進肺纖維化發展[16]。本研究中,T組、T+ E組、T+N組TGF-β1處理12 h后,細胞形態都發生了顯著變化,由最初的多角形逐漸變為成纖維細胞樣形態。這提示,細胞形態的改變主要是由TGF-β1引起的。此外,TGF-β1處理A549細胞后,α-SMAmRNA表達水平顯著升高,E-CamRNA表達水平明顯降低。這提示,TGF-β1處理A549細胞后發生EMT,可作為體外肺纖維化模型。erastin是一種公認的鐵死亡小分子誘導劑[7,17]。本研究發現,E組和T+E組A549細胞出現聚集性細胞死亡,在形態學上表現為細胞收縮變圓,死亡細胞數量隨時間增加。與C組比較,E組和T+E組細胞Fe2+、mitoROS和4-HNE水平顯著升高,細胞活力明顯降低。這表明,erastin誘導的A549細胞死亡符合鐵死亡的形態學和生化特征[3,18-19]。這說明,erastin可誘導A549細胞發生鐵死亡。

3.2 鐵死亡與TGF-β1誘導EMT的共同機制 TGF-β1誘導EMT時,鐵蛋白重鏈(ferritin heavy chain,FHC)水平顯著降低,導致細胞內鐵超載,進而促進ROS的產生,導致肺泡上皮細胞損傷[20]。TGF-β1增加4-HNE的產生,4-HNE是氧化應激的標志,是脂質過氧化的產物[21]。4-HNE通過促進ROS生成、抑制抗氧化酶增加氧化應激,促進TGF-β1表達,參與纖維化過程[22]。在鐵死亡發生過程中存在鐵過載[23],ROS、mitoROS和4-HNE水平增高[24]。本研究中,與C組比較,T組、E組和T+E組的Fe2+、mitoROS和4-HNE水平均明顯升高,T+E組中4-HNE和mitoROS水平明顯高于T組和E 組。這提示,鐵超載、線粒體氧化和脂質過氧化升高是TGF-β1誘導EMT和Erastin誘導鐵死亡的共同機制。

3.3CISD1在肺纖維化和鐵死亡中的作用及可能機制CISD1是線粒體外膜蛋白,維持細胞內鐵和活性氧穩態[25]。CISD1調節細胞內游離鐵的水平,細胞內較高水平的游離鐵會通過芬頓反應促進4-HNE的生成[26]。抑制CISD1導致鐵積累和隨后的線粒體氧化損傷,促進erastin誘導的鐵死亡[13]。本研究中,經TGF-β1和erastin處理后,CISD1的mRNA和蛋白質表達水平顯著降低。與T組比較,T+N組α-SMAmRNA表達水平及細胞內Fe2+、mitoROS、4-HNE水平顯著升高,而E-CamRNA表達量明顯降低。這說明,抑制CISD1可提高Fe2+、mitoROS和4-HNE水平,增強氧化應激和脂質過氧化,促進肺纖維化和鐵死亡,CISD1可能通過降低Fe2+水平、抑制氧化應激和脂質過氧化作用來抑制鐵死亡和肺纖維化。此外,與T組和E組比較,T+E組CISD1的表達水平明顯降低。這提示,TGF-β1與erastin在抑制CISD1表達方面可能具有協同作用。

綜上所述,TGF-β1和erastin分別誘導A549細胞EMT和鐵死亡。Fe2+、mitoROS、4-HNE水平升高是TGF-β1誘導A549細胞的EMT和erastin誘導的鐵死亡的共同機制。CISD1可通過降低Fe2+水平、抑制氧化應激和脂質過氧化作用抑制肺纖維化和鐵死亡。