pH敏感載體負載三氯生納米粒對耐甲氧西林金黃葡萄球菌生物被膜的清除作用

黃菁華 林逸飛 陳相君 李文婷 鄭淑娜 王長榮 李珂珂

濱州醫學院藥學院 山東 煙臺 264003

細菌感染是疾病和死亡的重要原因之一,對全球公共衛生構成威脅[1]。細菌可以在胞外聚合物上形成生物被膜,生物被膜一旦形成后再使用常規劑量便無法達到預期的效果,這也是細菌感染疾病難以治愈的重要原因[2]。三氯生(triclosan,TCS)是廣譜抗菌藥物,對常見的革蘭氏陽性菌及陰性菌均具有很好的療效,但長期高劑量使用仍然無法有效穿透生物被膜,清除內部細菌[3]。因此,迫切需要開發新的載體負載TCS,用于穿透生物被膜屏障,達到治療的目的。pH敏感型載體可以在生理環境下負載抗菌藥物,在細菌感染形成的酸性環境中釋放抗菌藥物,使抗菌藥物精準到達感染部位,提高抗菌藥物穿透生物被膜的能力,進而增強生物被膜清除效果。pH敏感型載體還具有良好的藥物緩釋能力,能夠減少抗菌藥物的毒副作用和耐藥性,進一步提高其療效[4]。

本研究選用耐甲氧西林金黃葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcusaureus,MRSA)感染形成的生物被膜作為研究對象,應用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)考察pH敏感的兩嵌段共聚物(聚乙二醇單甲醚2000-b-聚甲基丙烯酸二丙基氨基乙酯-r-甲基丙烯酸二丁基乙酯,mPEG2k-b-Poly-DPAx-r-DBAy,PEPBx/y)清除MRSA生物被膜的能力,篩選出最優載體PEPB36/35,并采用納米沉淀法制備PEPB36/35@TCS,考察其在不同pH環境下體內外清除MRSA生物被膜及內部細菌的能力,為治療細菌感染疾病提供新的方法。

A.粒徑;B.Zeta電位;C.PDI;D. TEM圖。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司);Malvern Zetasizer Nano ZS9激光粒度分析儀(英國Malvern公司);JEM-1400透射電子顯微鏡(日本電子株式會社);LSM 900激光共聚焦顯微鏡(德國蔡司有限公司);Synergy H1酶標儀(美國伯騰儀器有限公司);U-LH100HG熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社);TDL-60B低速離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.1.2 藥品與試劑 TCS(上海麥克林生化科技有限公司,批號為C10404798,純度為97%);四氫呋喃(tetrahydrofuran,THF)(國藥集團試劑有限公司,批號為GB20201102,分析純);N,N-二甲基甲酰胺(n,n-dimethylformamide,DMF)(上海麥克林生化科技有限公司,批號為C14878669,純度為99%);聚乙二醇單甲醚2000(polyethylene glycol monomethyl ether 2000,MPEG-2000)(上海麥克林生化科技有限公司,批號為C15427549,純度為98%);偶氮二異丁腈(azobisisobutyronitrile,AIBN)(上海麥克林生化科技有限公司,批號為C15784717,純度為98%)。

1.1.3 細菌與動物 MRSA標準菌株33591,購自美國模式培養物研究所。雌性昆明小鼠,體質量為16～20 g,購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌培養 將MRSA細菌培養至對數生長期,稀釋為大約1×106CFU/mL的菌液備用,分別調整pH值至7.4和5.6。

1.2.2 篩選PEPBx/y最優載體

1.2.2.1 PEPBx/y的制備與表征 采用納米沉淀法制備PEPBx/y納米粒[5]。稱取117 mg MPEG-2000,分別加入不同比例的nDPA-MA 和nDBA-MA置于Shelenk管中,再加入4 mL DMF使其充分溶解,抽真空后通氬氣,加入1.64 mg AIBN,在70 ℃反應24 h,透析凍干,即得PEPBx/y納米粒?？疾炱淞椒植?、電位和外觀形態。

1.2.2.2 PEPBx/y的pKa值測定 通過酸堿滴定法測定PEPBx/y的pKa值。稱取40 mg PEPBx/y,加入20 mL HCl超聲溶解,使其濃度為2 mg/mL,轉移至燒杯中,在磁力攪拌作用下,加入0.18 g的NaOH,再滴入0.1 M的NaOH溶液,記錄pH值。以消耗NaOH的體積為橫坐標,pH值為縱坐標,繪制曲線作圖,得到PEPBx/y的pKa值。

1.2.2.3 PEPBx/y體外清除MRSA生物被膜 應用CLSM考察PEPBx/y體外清除表達綠色熒光蛋白的MRSA生物被膜的能力[6]。在玻璃皿中加入1 mL含有綠色熒光蛋白的MRSA菌液,于37 ℃條件下培養3 d,以確保生物被膜的形成。加入1 mL PEPBx/y溶液(濃度為960 μg/mL),在37 ℃下培養12 h,棄去皿中液體,在CLSM下觀察生物被膜的清除效果。

1.2.2.4 PEPBx/y生物安全性研究 應用溶血實驗考察PEPBx/y的生物安全性。取5 mL兔子動脈血,加入10 mL生理鹽水充分混勻,1 000 rpm離心10 min,得到壓積紅細胞。用生理鹽水將壓積紅細胞稀釋為2%的紅細胞懸液,分別取200 μL稀釋后的紅細胞懸液與200 μL受試溶液混合,以蒸餾水組為陽性對照組,生理鹽水組為陰性對照組,用酶標儀在波長為570 nm時測定OD值,并計算溶血率。

1.2.3 PEPB36/35@TCS的制備及其質量評價

1.2.3.1 PEPB36/35@TCS的制備 采用納米沉淀法制備PEPB36/35@TCS載藥納米粒。稱取40 mg PEPB36/35和20 mg TCS置于2 mL THF中,超聲溶解,緩慢滴入20 mL蒸餾水中,攪拌揮發去除THF,離心,加入蒸餾水定容至20 mL,即得PEPB36/35@TCS載藥納米粒?？疾炱淞椒植?、電位和外觀形態。

1.2.3.2 PEPB36/35@TCS的體外釋放性能考察 采用動態膜透析法考察PEPB36/35@TCS體外釋放性質[7]。吸取3 mL PEPB36/35@TCS混懸液2份,分別置于透析袋中,再將其分別置于含30 mL pH值為7.4和5.6的PBS緩沖液(含0.5%吐溫-80)的離心管中,于37 ℃、100 rpm條件下進行釋放,在預設的時間節點上每次取出3 mL釋放介質,同時補充3 mL新鮮釋放介質。用紫外可見分光光度計(UV-Vis)在282 nm處測量吸光度值,以時間為橫坐標,累積釋放百分率為縱坐標,繪制釋放曲線。

1.2.4 PEPB36/35@TCS體外清除MRSA生物被膜的研究

1.2.4.1 PEPB36/35@TCS體外清除MRSA生物被膜內部細菌 通過平板菌落計數法考察PEPB36/35@TCS體外清除MRSA生物被膜及內部細菌的能力[8]。在8孔板中每孔分別加入1 mL的MRSA菌液,在37 ℃培養3 d,待MRSA生物被膜形成之后,分別加入1 mL TCS、PEPB36/35和PEPB36/35@TCS(PEPB36/35濃度為72.5 μg/mL,TCS濃度為64 μg/mL),培養18 h。每孔加入1mL PBS緩沖液,振蕩混勻,轉移至離心管中,加入9 mL PBS緩沖液,稀釋至1×10-1菌懸液。再吸取1 mL 1×10-1菌懸液,加入9 mL PBS緩沖液,稀釋至1×10-2菌懸液,依次類比稀釋至1×10-5菌懸液,吸取100 μL 1×10-5菌懸液,用涂布器均勻的涂布在固體平板表面,在37 ℃培養24 h,取出進行菌落計數。

1.2.4.2 PEPB36/35@TCS體外清除MRSA生物被膜 應用結晶紫染色法考察PEPB36/35@TCS體外清除MRSA生物被膜的能力[9]。按照“1.2.4.1”項下MRSA生物被膜與受試溶液共培養方法,用0.2%結晶紫染色液染色30 min,PBS緩沖液清洗3次,在熒光倒置顯微鏡下觀察染色后的生物被膜。每孔加入95%乙醇,置于37 ℃搖床中洗脫1 h,用UV-Vis在595 nm下測定各孔的吸光度值。

1.2.5 PEPB36/35@TCS體內清除MRSA生物被膜的研究 通過小鼠背部創面愈合實驗考察PEPB36/35@TCS體內清除MRSA生物被膜及內部細菌的能力[10]。在16只雌性昆明小鼠背部建立1.5 cm×1.5 cm 的局部傷口,滴加50 μL的MRSA菌液建立創面MRSA生物被膜感染模型。將小鼠隨機分為4組,每組4只,分別滴加50 μL PBS、PEPB36/35、TCS和PEPB36/35@TCS(PEPB36/35濃度為72.5 μg/mL,TCS濃度為64 μg/mL)溶液進行治療,每隔1 d治療1次,測量創面面積,稱量小鼠體質量,于第9 d處死小鼠,取創面處皮膚,采用平板菌落計數法,測定創面菌落數量。

2 結果

2.1 篩選PEPBx/y納米粒最優載體

2.1.1 PEPBx/y的藥劑學性質表征 由圖1可知,PEPB80/0、PEPB64/22、PEPB36/35、PEPB22/68和PEPB0/70納米粒的粒徑分別為(190.5±4.98) nm、(187.6±5.99) nm、(220.3±10.99) nm、(265.3±14.03) nm和(240.2±18.99) nm,電位分別為(3.98±0.15) mV、(1.85±0.22) mV、(-1.95±0.31) mV、(-4.73±0.33) mV和(-7.86±0.62) mV,PDI分別為(0.209±0.003)、(0.140±0.028)、(0.173±0.029)、(0.205±0.015)和(0.281±0.051)。TEM結果顯示,5種PEPBx/y均形成了比較均勻的納米球形結構。這表明,5種PEPBx/y納米粒載體已經成功合成,可用于后續的藥物遞送。

2.1.2 PEPBx/y的pKa值 由圖2可知,PEPB80/0、PEPB64/22、PEPB36/35、PEPB22/68和PEPB0/70的pKa值分別為6.2、6.0、5.6、5.3和5.0,隨著nDBA-MA含量的增加,納米粒的pKa值逐漸降低。PEPBx/y具有5種不同的pKa值。這表明,PEPBx/y可以在不同pH值下進行解離,釋放藥物,為后續清除MRSA生物被膜的研究提供了可行性。

圖2 PEPBx/y酸堿滴定曲線圖

2.1.3 PEPBx/y的MRSA生物被膜清除率 由圖3可知,與對照組比較,PEPB80/0組、PEPB64/22組、PEPB36/35組、PEPB22/68組和PEPB0/70組在pH 值為7.4和5.6時的MRSA生物被膜清除率分別約為5%和30%,10%和20%,65%和90%,68%和90%,10%和15%。這表明,PEPB36/35和PEPB22/68在酸性環境下均具有較好的生物被膜清除效果。在酸性環境下,PEPB36/35和PEPB22/68發生了質子化改變、電荷反轉,進而納米粒解體以及烷基鏈暴露,可以增強其清除MRSA生物被膜的能力。

圖3 PEPBx/y在不同pH環境下清除MRSA生物被膜的CLSM圖像

2.1.4 PEPBx/y的生物安全性 由圖4可知,當溶血率超過10%時,PEPB80/0、PEPB64/22、PEPB36/35、PEPB22/68和PEPB0/70的最低濃度分別為240、480、960、120和240 μg/mL。這表明,PEPB36/35具有最高的生物安全性?？紤]到PEPB36/35也具有較好清除MRSA生物被膜的能力,故選擇PEPB36/35作為TCS遞送的最優載體。

A.PEPB80/0;B.PEPB64/22;C.PEPB36/35;D.PEPB22/68;E.PEPB0/70。

2.2 PEPB36/35@TCS的質量評價

2.2.1 PEPB36/35@TCS的藥劑學性質表征 由圖5可知,PEPB36/35@TCS載藥納米粒的粒徑為(190.6±4.05) nm,電位為(0.317±0.18) mV,PDI為(0.172±0.017)。TEM結果顯示,PEPB36/35@TCS形成了均勻的納米球形結構。這表明,PEPB36/35@TCS載藥納米粒已成功合成。

2.2.2 PEPB36/35@TCS的體外釋放曲線 由圖6可知,在生理環境下,PEPB36/35@TCS中TCS在72 h內累積釋放率為31%。在酸性環境下,TCS在72 h的累積釋放率為73%。這表明,PEPB36/35@TCS在酸性環境下發生了質子化改變,納米粒解體,從而加速了TCS的釋放。

圖6 PEPB36/35@TCS在不同pH環境下的釋放曲線

2.3 PEPB36/35@TCS體外清除MRSA生物被膜的研究

2.3.1 PEPB36/35@TCS體外清除MRSA生物被膜內部細菌 由圖7可知,與對照組比較,PEPB36/35@TCS組在生理環境和酸性環境下生物被膜內部細菌存活率均顯著降低(P<0.01)。與PEPB36/35組、TCS組比較,PEPB36/35@TCS組在生理環境和酸性環境下生物被膜內部細菌存活率均降低(P<0.05)。與生理環境下的PEPB36/35@TCS組比較,酸性環境下的PEPB36/35@TCS組生物被膜內部細菌存活率降低(P<0.05)。這表明,PEPB36/35@TCS組在酸性環境下具有較好的清除MRSA生物被膜內部細菌的效果,PEPB36/35@TCS能夠將TCS轉運到MRSA生物被膜內部發揮清除細菌的作用。

A.菌落直方圖;B.平板菌落計數圖。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.3.2 PEPB36/35@TCS體外清除MRSA生物被膜 由圖8可知,與對照組比較,PEPB36/35@TCS組在生理環境和酸性環境下剩余生物被膜量均顯著降低(P<0.001)。與PEPB36/35組、TCS組比較,PEPB36/35@TCS組在生理環境和酸性環境下剩余生物被膜量均顯著降低(P<0.001)。與生理環境下的PEPB36/35@TCS組比較,酸性環境下的PEPB36/35@TCS組剩余生物被膜量顯著降低(P<0.001)。這表明,PEPB36/35@TCS組在酸性環境下具有較好的清除MRSA生物被膜的效果。PEPB36/35可以清除MRSA生物被膜,TCS可以清除內部細菌,從而使PEPB36/35@TCS具有更好的清除生物被膜及內部細菌的能力。

2.4 PEPB36/35@TCS體內清除MRSA生物被膜的研究 由圖9A～D可知,與PBS組、PEPB36/35組、TCS組比較,PEPB36/35@TCS組具有較好的促進創面愈合的作用。由圖9E、F可知,與對照組比較,PEPB36/35@TCS組創面細菌存活率顯著性降低(P<0.001)。與PEPB36/35組、TCS組比較,PEPB36/35@TCS組創面細菌存活率顯著性降低(P<0.01)。這表明,PEPB36/35@TCS組具有較好清除MRSA生物被膜內部細菌的作用。在體內細菌感染形成生物被膜的酸性環境下,PEPB36/35@TCS具有較好的清除MRSA生物被膜及內部細菌的效果,可以發揮一定的促進感染創面愈合的作用。

A.實驗過程示意圖;B.創面照片;C.創面面積變化;D.小鼠體質量變化;E.創面菌落直方圖;F.創面菌落計數圖。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

3 討論

細菌生物被膜是指在細菌生長過程中黏附于生物或者非生物的表面,由細菌自身產生的胞外聚合物形成的高度組織化的三維立體結構膜樣物[11]。生物被膜可起到天然物理屏障保護作用,使細菌能夠逃避抗菌藥物的殺滅,降低機體免疫細胞對細菌的吞噬作用[12]。因此,本研究選擇MRSA生物被膜作為研究對象,通過CLSM圖像、平板菌落計數法、結晶紫染色法以及小鼠背部創面感染模型法,考察清除MRSA生物被膜及內部細菌的效果。

納米載體可以很好地遞送抗菌藥物,但是在藥物靶向和清除生物被膜方面效果欠佳,因此需要更好的方法來解決這一問題[13]。本研究選用pH敏感型納米載體,在生理環境下保持納米粒的結構完整,在細菌感染形成的酸性環境下納米粒解體,釋放藥物,可達到清除MRSA生物被膜和內部細菌的靶向效果。

TCS是廣譜抗菌藥物,但對于具有形成生物被膜能力的細菌,抑制效果甚微[14]。體外實驗結果表明,在酸性環境下,PEPB36/35@TCS的生物被膜內部細菌存活率、剩余生物被膜量降低(P<0.05)。體內實驗結果表明,在微生物感染形成的酸性環境下,PEPB36/35@TCS的創面愈合較快、創面細菌存活率顯著降低(P<0.01)。這表明,PEPB36/35@TCS在酸性環境下發生了質子化改變、電荷反轉,進而納米粒解體以及烷基鏈暴露,可以增強其清除MRSA生物被膜及促進創面愈合的能力。

綜上所述,PEPB36/35@TCS在酸性環境下具有較好地清除MRSA生物被膜及內部細菌的效果,可以發揮一定的促進感染創面愈合的作用。但PEPB36/35@TCS廣譜抗菌應用還需要進一步研究,為抗菌藥物更好的發揮臨床療效提供更有效的策略。