基于網絡藥理學及分子對接技術探究黃連解毒湯治療膿毒癥的分子機制*

馬世河，惠普晟，龍 漫

1 重慶市開州區人民醫院，重慶 400000； 2 重慶醫科大學附屬第一醫院，重慶 400000；3 湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430000

膿毒癥是由于感染引起的全身性免疫反應失調而導致的器官功能障礙，因該病進展快、疾病診斷和治療不當，常引發膿毒癥休克，危及患者生命［1］?，F代醫學主要依賴控制感染源、液體治療、抗生素治療、糖皮質激素、免疫球蛋白、血管活性藥物及血液凈化等手段治療膿毒癥［2］。近年來，盡管新的治療策略不斷發展，但該病的死亡率仍處于高位，而這一形勢在醫療欠發達地區更為嚴峻［3］。

近年來，中醫在治療膿毒癥及改善患者臨床癥狀上優勢凸顯。中醫學中并無“膿血癥”這一病名，目前主要依據膿毒癥臨床表現的中醫特征，將其歸納至“溫病”及“外感熱病”范疇，以“熱、毒、瘀、虛”為其核心病機［4］。黃連解毒湯首見于《肘后備急方》，唐代王燾將其收錄至《外臺秘要》，是清熱解毒的代表方劑，在臨床上治療熱毒型膿毒癥每獲良效。黃連解毒湯由黃連、黃柏、黃芩、梔子組成，四藥合用、苦寒直折，主治三焦火毒證，證見大熱煩渴、錯語不眠或則熱病發斑。研究表明，黃連解毒湯可抑制膿毒癥引起的炎癥因子釋放；調整血小板活化功能，對降低膿毒癥死亡率有較大作用［5］。然而黃連解毒湯復方有效成分多樣，潛在分子機制尚不明確。本研究基于網絡藥理學“分子-靶點-通路-疾病”的理論，探究黃連解毒湯治療膿毒癥的生物學機制，為以后進一步實驗提供研究方向。

1 資料與方法

1.1 數據庫及軟件資源中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP；http：//tcmspw.com/tcmsp.php）；DisGeNET Database v5.0（http：//www.disgenet.org/）；Gene Card 數據庫（https：//www.genecards.org/）；OMIM數據庫（https：//omim.org/）；疾病靶點標準化數據庫（Uniport，https：//www.uniprot.org/）；美國國家生物信息中心數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）；Venny 軟件、STRING平臺、Cytoscapes 3.2.1軟件。

1.2 黃連解毒湯活性成分篩選在TCMSP 數據庫［6］中依次輸入活性成分及藥物作用靶點黃連、黃柏、黃芩、梔子，以口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18，血腦屏障透過率（BBB）≥-0.3為條件［7］，篩選活性成分。另外，在中國知網、PubMed及萬方3 個數據庫中搜索上述4 味藥物的藥理研究及化學成分，尋找可能與膿毒癥相關的活性成分，同時將未被列入TCMSP 數據庫或因上述篩選條件被刪除的作為補充。將篩選后的活性成分再次通過TCMSP 數據庫，以獲得活性成分相關作用靶點。

1.3 膿毒癥相關靶點挖掘以“sepsis”為搜索詞，在以下數據庫進行檢索，獲得膿毒癥相關靶點的信息：Gene Card 數據庫（https：//www.genecards.org/）；OMIM數據庫（https：//omim.org/）；DisGenet數據庫（https：//www.disgenet.org/）。

1.4 藥物活性成分靶點構建藥物-作用靶點網絡。利用上述步驟獲取的黃連解毒湯中有效活性成分的相關靶點及疾病相關靶點名稱，上傳至Uniport數據庫及美國國家生物技術信息中心數據庫，設置種屬為“Homo sapiens（Human）”，獲得靶點轉化后的基因名稱。利用Venny 2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）在線工具繪制黃連解毒湯活性成分靶點和黃連解毒湯靶點的韋恩圖，并得到交集靶點。利用Cytoscape 3.7.1 軟件其中的“Network Analyzer”功能對中藥化學成分-作用靶點網絡進行分析，運用上述方法識別黃連解毒湯中潛在的活性分子成分和靶點，構建活性成分-靶標-通路-疾病的網絡。

1.5 蛋白質互作網絡拓撲分析及篩選關鍵靶點將上述藥物-疾病交集靶點上傳至STRING 平臺，限定研究物種為“人（“Homosapiens”），最低相互作用評分設置為最高置信度［“highest confidence（0.900）”］，其余參數保持默認設置，得到黃連解毒湯作用于膿毒癥的藥物靶蛋白-疾病靶蛋白（protein-protein interaction，PPI）相互作用網絡。

1.6 GO功能分析及KEGG通路富集分析在DAVID（the database for annotation，visualization and integrated discovery）數據庫中導入黃芩、黃連、黃柏、梔子的作用靶標，限定物種為“Homo Sapiens”，將靶基因名修正為官方名稱（official genesymbol），設定閾值P＜0.05，進行基因本體（gene ontology，GO）生物過程分析、京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

1.7 分子對接虛擬篩選是快速發展的藥物篩選技術之一，而分子對接是必不可少的活性化合物篩選的手段。采用AutoDock 軟件對化合物-靶點-通路-疾?。≒PI）網絡中得分數最高的JUN 及TNF 蛋白質進行分子對接及三位結構模擬?；衔锛暗鞍踪|的三維結構從蛋白質數據庫（PDB）網站獲得。在AutoDockTools 軟件中對上述蛋白受體和配體進行加氫、加電荷處理，再用其插件Autogrid 得到對接活性位點，進行分子對接，得到結合能（affinity）。此外，配體與靶標的相互作用通過配體相互作用圖模塊進行可視化處理。

2 結果

2.1 黃連解毒湯有效化合物成分及靶點篩選采用“1.2”項下方法，刪除重復化合物后得到有效化合物206個，并通過在中國知網、PubMed等文獻數據庫中檢索，補充因篩選條件被刪除而對膿毒癥有一定作用的化合物，共得到有效化合物成分6個。將此化合物在TCMSP中再次輸入，得到對應靶點共211個，其主要活性成分見表1。

表1 黃連解毒湯活性成分（前20位）

2.2 構建網絡“活性成分-藥物”靶點網絡每一活性成分映射的對應靶點通過Cystoscopes 軟件繪制［8］，其中藍色代表復方，綠色代表中藥小分子，紅色代表在多味中藥中出現的小分子，黃色代表靶基因，節點（node）意為黃連解毒湯中所含藥物活性成分及其作用靶點；邊（edge）則表現了中藥成分和其作用靶點之間的聯系。見圖1。

圖1 “活性成分-藥物”靶點網絡

2.3 膿毒癥靶點基因采集通過“Gene Cards、OMIM、DisGenet”數據庫以疾病名稱“Sepsis”搜索，其中“Gene Card”數據庫獲得靶點1590 個，OMIM 數據庫篩選出301 個基因靶點，DisGenet 數據庫篩選出1264 個基因靶點，將上述靶點去重后共得到1891個靶點。

2.4 化合物及膿毒癥靶點標準化及篩選共同靶點的PPI 網絡構建。將上述“2.1”項及“2.2”項步驟中所得的靶點依次上傳至Uniport或NCBI數據庫，將蛋白轉換為標準基因名稱。然后運用Venny 2.1 軟件繪制兩者交集的韋恩圖，顯示兩者共有基因105 個，包含IL-10、CXCL8、CRP 等，見圖2。在STRING平臺進行數據處理后，網絡中有105個靶點之間存在蛋白相互作用。見圖3—4。

圖2 藥物-疾病靶點韋恩圖

圖3 PPI網絡圖

圖4 barplot圖

2.5 GO 及KEGG 分析結果105 個交集靶點得到的GO 條目以P值大小排序，主要影響的前20 個生物進程，主要包括細胞因子受體、細胞因子激活等。KEGG通路富集分析發現106個交集靶點基因顯著富集在152條通路上，按照P值從小到大的順序篩選前20 條，其中最有意義的20 條通路包括AGEs-RAGE通路、TNF信號通路、IL-17通路等，再將數據進行可視化處理。圓點越大則基因數量越多，顏色代表富集顯著性，顏色越紅則富集性越高。見圖5—6。

圖5 GO分析圖

圖6 KEGG信號通路圖

2.6 分子對接結果所有分子與蛋白質的結合能均小于0，且波動在-5.5～-11.9 KJ/mol 之間，表示所有配體可以自發地與受體結合其中吳茱萸次堿與TNF結合最好，進一步證明了黃連解毒湯中的活性成分在治療膿毒癥中起重要作用。見表2、圖7。

圖7 TNF-Rutaecarpine分子對接

表2 分子對接結果

3 討論

膿毒癥常發生于重大傷害或嚴重感染之后，由其引發的感染會引發循環衰竭，進而導致細胞和多器官代謝功能障礙，占膿毒癥預后不良原因的大多數［9］。王林等［10］研究表明，黃連解毒湯能明顯改善膿毒癥熱毒型患者體內白細胞、降鈣素原（procalcitonin，PCT）、C 反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）等炎癥因子水平。黃連解毒湯復方中藥制劑成分復雜，其作用途徑涉及靶點較多，從多維度、多層次針對疾病各個方面。本研究基于網絡藥理學技術，探討了中藥復方黃連解毒湯治療膿毒癥的作用機制。

在本次研究中，黃連解毒湯治療膿毒癥主要活性成分為小檗堿、黃連堿、黃芩苷、黃芩素、槲皮素等。REN 等［11］研究表明，黃連解毒湯主要的黃芩黃酮類化合物和環烯醚萜類化合物對炎癥模型大鼠具有協同抗炎作用，能明顯降低大鼠血漿中IL-6、IL-1β、MIP-2、TNF-α 表達水平。晉金蘭等［12］研究表明，小檗堿通過降低膿毒性心肌病模型大鼠心肌組織中Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）的上調，還降低了心肌組織中TNF-a 和IL-1β的含量。黃芩苷具廣譜抗菌、抗病毒活性，對多種細菌、真菌、病毒有抑制作用，其機制可能與干擾細胞壁合成、損傷胞漿膜、影響細胞蛋白合成、影響核酸合成、干擾遺傳密碼復制等有關［13-14］。另有研究表明，膿毒癥的發展中，活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）的產生和氧化應激起關鍵作用。這種氧化應激會損害細胞膜和其他細胞大分子，槲皮素是強大的抗氧化劑，抑制ROS 并激活肺細胞的酶促抗氧化系統，減輕由膿毒癥引起的肺損傷［15-16］。PPI分析表明，黃連解毒湯中有效成分可能是通過c-Jun 氨基末端激酶（jun kinase，JNK）、TNF、Akt 絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT serine/threonine kinase 1，AKT1）、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、IL-6 等靶標作用于膿毒癥。GO 生物過程分析提示，黃連解毒湯通過影響細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性、信號轉導受體激活劑等途徑，改善膿毒癥所致的機體炎癥及對器官組織的功能損傷。KEGG 富集分析顯示，黃連解毒湯作用通路主要涉及AGEs-RAGE通路、HIF-1通路、IL-17信號通路及TNF 信號通路等。晚期糖基化受體（RAGE）與晚期糖基化產物（AGEs）結合后在人體影響各組生物進程。CHEN 等［17］證實，晚期糖基化受體通過影響T 細胞的表達在炎癥反應的始動和持續作用中扮演重要角色，并且RAGE 參與T 細胞向Th1 表型的分化的過程。此外，研究證明，抑制RAGE 的活性對于腹腔感染、膿毒癥具有正面作用［18］。低氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）在機體對病理應激和環境適應的反應中發揮重要作用。當抑制糖酵解代謝時，LPS 處理巨噬細胞的炎癥反應減輕，IL-1β的產生減少，這表明抑制HIF-1α 介導的有氧糖酵解是逆轉膿毒癥過程的潛在靶點?？烧{控下游相關細胞因子發揮抗炎、抗氧化、抗凋亡作用，從而改善因膿毒癥導致的心肌等器官對的損傷［19-20］。IL-17a 作為宿主免疫的重要組成部分，對細菌、真菌、病毒和寄生蟲引起的感染具有強大的保護作用。一系列研究表明，膿毒癥患者IL-17a循環水平升高，調控IL-17a 的表達可降低全身促炎細胞因子或趨化因子水平，提高膿毒癥患者生存率［21］。TNF-α是關鍵的促炎因子，其通過細胞因子級聯反應，引發炎癥連鎖反應，產生“炎癥風暴”，從而引起心、肺、腎等組織器官損傷及功能障礙等［22］。在膿毒癥患者中，TNF-α 的濃度升高水平與膿毒癥的嚴重程度呈現正相關［23］。此外，劉雨濃等［24］證實，黃連解毒湯有效組分通過抑制Caspase-11 介導的細胞焦亡信號通路，進而發揮抗膿毒癥的作用。由此可見，黃連解毒湯主要發揮其抗炎、抗氧化應激等作用治療膿毒癥。

本研究基于網絡藥理學方法初步預測黃連解毒湯的活性成分、藥物靶點及藥物-疾病的相關通路，黃連解毒湯抗膿毒癥具有多靶點、多途徑、多通路的特點，其主要生物學機制可能與抑制各種炎癥通路如TNF-α、IL-1β及T 細胞的分化相關。當然，本研究尚存在一些局限，如對有效成分相關靶點的尋找和確認方法需要進一步優化，而且本研究未進行實驗驗證，此次靶點及機制預測的可靠性需進一步研究。