結核分枝桿菌潛伏感染抗原Rv2628c-Rv1737c融合蛋白的原核表達與免疫原性分析

解建輝,李 昆,孫衛國,賀 雄,朱 琰,張靈霞

結核病(tuberculosis, TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)感染引起的一種慢性傳染性疾病,我國每年約3.7萬人死于結核病,是結核病高負擔國家之一,其中30 %的病例由于缺乏高靈敏度和特異度的診斷方法而無法確診,沒有得到適當的診斷和治療[1]。目前全世界將近有三分之一的人口可能感染有MTB[2]。結核病的發生、發展進程主要是由 MTB與機體免疫系統之間的相互作用所決定的,當MTB 逃避人體的免疫攻擊或者與人體免疫處于一種動態平衡后,可在體內處于持續感染或呈潛伏性感染(latent tuberculosis infection, LTBI)狀態,早期識別和預防結核潛伏感染成為結核病控制的一個重要組成部分[3]。MTB 潛伏感染定義為機體對MTB抗原刺激產生的持久性的反應,臨床上沒有任何活動性結核病征象[4]。研究發現,在LTBI者中,存在可能有5%～10%會因為免疫力低下、并發感染等原因發展為活動性結核病[5]。LTBI沒有特異性的臨床癥狀和實驗室診斷指標,目前尚缺乏統一的方法和金標準對其進行診斷;同時,針對LTBI還沒有有效的保護性疫苗阻止LTBI發展為活動期結核病。

在結核病的發病和發展過程中,人體的機體免疫功能發揮了關鍵作用[6], 在機體淋巴細胞的免疫應答過程中,T 細胞接觸結核分枝桿菌的特異性抗原后成為記憶性T細胞,當再次接觸MTB的特異性抗原時,T細胞將分化成為效應T細胞的同時釋放多種細胞因子,包括變化水平高的γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)。因此,可以通過檢測INF-γ 含量變化或者釋放INF-γ 的 T 淋巴細胞的數量來判斷生物個體是否感染MTB,MTB 基因組發現約4 000個開放閱讀框,編碼幾千種蛋白分子,選擇什么結核分枝桿菌刺激抗原就變得尤為重要,同時需要保證檢測抗原的敏感性和特異性。當結核分枝桿菌進入休眠期時,一些與潛伏感染有關的基因包括Dos R(dormancy survival regulon)調節子進行表達[7],這些MTB潛伏感染相關抗原幫助結核桿菌對抗宿主免疫活性細胞,在LTBI人群中,這類潛伏抗原激發機體產生免疫反應。Rv2628c、 Rv1737c是受 Dos R調控的潛伏感染相關抗原,研究發現Rv2628c、 Rv1737c 能誘導潛伏感染者產生較強的 IFN-γ 反應[8-9]。本實驗室前期以Rv2628c 抗原刺激樣本外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)也發現,Rv2628c 抗原在 LTBI 患者組中引起的IFN-γ分泌水平高于TB 患者組以及健康人群組[10]。同時,在BCG菌體內Rv1737c基因表達減弱,但在休眠期的結核桿菌內正常表達[11]。本研究根據結核分枝桿菌抗原刺激TB感染人群釋放INF-γ 原理,以ESAT-6/CFP10和MTB全菌裂解液蛋白為對照抗原,依據Rv2628c、 Rv1737c 抗原刺激特點,原核重組獲得Rv2628c-Rv1737c融合蛋白,驗證其可否特異性誘導MTB感染者PBMCs細胞產生高水平的IFN-γ,根據LTBI者中誘導的特異性IFN-γ水平顯著高于活動期感染者的特性,以期區分活動期病人和LTBI 者;同時證實Rv2628c-Rv1737c可被MTB 感染者尤其是LTBI 者外周血T細胞特異性識別,從而進一步研究用于TB融合蛋白疫苗構建的靶抗原可行性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集解放軍總醫院第八醫學中心結核病醫學部2021年住院的30例活動期肺結核病人,男性15例、女性15例,年齡32～52歲,平均40歲。排除糖尿病、高血壓等基礎疾病以及其他合并癥的臨床期,所有結核病患者均進行胸部X 線檢查,發現有浸潤性病變,符合活動性結核病(active tuberculosis, ATB)診斷標準[12]。潛伏感染者樣本選自總醫院第八醫學中心體檢中心,無發熱、咳嗽和咳痰等癥狀,影像學檢查肺部無病灶,通過干擾素釋放實驗判定為潛伏感染者,共 20 例,男女各10例,年齡34～48歲,平均39歲。同時,選擇體檢中心健康體檢者20例,男女各10例,年齡26～40歲,平均34歲,常規體檢項目和胸部X線檢查均顯示正常。本研究通過單位倫理委員會審批,所有受試者均已簽署知情同意書。

1.2 實驗動物 實驗動物SPF級雌性BALB/c小鼠30只,6～7周齡,體重16～18 g,從中國疾病預防控制中心實驗動物中心購進。動物實驗經單位倫理委員會審查通過。

1.3 試劑 大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)DH5α、BL21(DE3)菌株和載體pET24a本實驗室保存;全基因合成與測序由北京華大生物公司完成;限制性內切酶、T4連接酶、IPTG購自天根生化科技(北京)有限公司;淋巴細胞分離液Ficoll、Ni-NTA蛋白純化樹脂購自美國GE公司,本室灌裝柱;TB感染T細胞檢測試劑盒(TB-IGRA)購自萬泰生物藥業股份有限公司;蛋白質相對分子質量marker (美國sigma公司);RPMI-1640培養基和胎牛血清購于以色列BI公司;RIPA細胞裂解液購于美國Sigma公司;羊抗人IgG、酶標二抗、BCA蛋白定量試劑盒和牛血清白蛋白(BSA)購于北京索萊寶公司;SYBR熒光定量試劑盒和反轉錄試劑盒均購自TaKaRa公司;其它試劑為進口或國產分析純。

1.4 MTB抗原準備

1.4.1 Rv2628c-Rv1737c蛋白原核重組與純化 根據GenBank中公布的Rv2628c(Np-217144.1)和Rv1737c(Np-216253.1)蛋白氨基酸序列,參照E.coli體內表達密碼子喜好特點,采用Rv2628c-Linker-Rv1737c融合模式對所需融合蛋白對應核酸密碼子序列進行全基因合成,表達載體為pET24a,限制性酶切位點為NdeI和XhoI,柔性Linker氨基酸序列為GGGGSGGGGS。全基因核酸序列由北京華大基因公司合成,構建亞克隆表達載體pET24a-Rv2628c-Rv1737c,通過熱激法轉化E.coliBL21(DE3),融合蛋白的C端自帶有6×His標簽,通過柱上復性和親和純化對表達的重組蛋白進行純化。

1.4.2 MTB H37Rv全菌裂解液的制備保存 方法為將MTB臨床標準株H37Rv(ATCC 25618) 復蘇后用7H9培養基于P2實驗室37 ℃條件下進行液體培養3周,4 ℃條件下,5 000 r/min離心收集沉淀菌體,65 ℃條件下水浴30 min,再用無菌PBS進行充分重懸,冰浴條件下進行超聲破碎,12 000 r/min離心收集上清,為H37Rv全菌裂解液,BCA定量分裝后-80 ℃冰箱保存。

1.4.3 ESAT-6/CFP10多肽合成 由于無法購得標準品,同時前期實驗發現以重組ESAT-6-CFP10融合肽作為抗原刺激時產生較多的非特異性,本研究MTB抗原ESAT-6和CFP10多肽由北京賽百盛公司合成,其中每條多肽長度為15個氨基酸,相鄰片段重復5個氨基酸,共34條多肽[13],以PBS溶解保存。

1.5 人外周血單個核細胞的分離與刺激 采集各研究樣本抗凝血2 mL,按照等比比例以RPMI 1640基礎培養基稀釋,然后使用等比Ficoll密度梯度離心(室溫1 000×g,20 min),吸取中間細胞層獲取PBMCs,再加入10 mL RPMI 1640不完全培養液充分洗滌,離心(室溫400×g,5 min),棄上清,沉淀即為PBMCs?？乖碳r,按照1×106/mL接種PBMCs。實驗抗原刺激濃度分別為:Rv2628c-Rv1737c融合蛋白濃度為5 μg/mL;全菌裂解液(lysate)濃度為8 μg/mL;ESAT-6/CFP10多肽(pool)濃度為34 μg/mL(每條多肽濃度為1 μg/mL),刺激20 h后,收集細胞,加入Triozl,充分震蕩,使細胞溶解于Triozl,放置-80 ℃保存,實驗方法參照文獻[13]進行。

1.6 PBMCs細胞總RNA的抽提與cDNA合成 常規乙醇沉淀法提取總RNA:Triozl細胞混合物進行室溫融化,加入0.2 mL氯仿,劇烈振蕩15 s,室溫放置3 min;11 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min,取上清到無RNAase EP管內,加入異丙醇0.5 mL進行上下顛倒混勻,靜置15 min;11 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min,棄上清,使用冰浴的1 mL無核酸酶水稀釋的75%乙醇清洗RNA沉淀;干燥數分鐘后加入無RNase水20 μL,震蕩混勻;以Agilent 2100對RNA樣本的濃度、純度和完整性進行檢測,-80 ℃冰箱保存。吸取樣本RNA至10 μL反應體系中進行反轉錄成cDNA,反轉錄條件為:37 ℃溫浴15 min復制,85 ℃條件下5 s。將反應產物按1∶10進行稀釋后分裝,-20 ℃保存備用。

1.7 IFN-γ mRNA的檢測 登錄NCBI網站,借用primer-BLAST程序設計IFN-γ的熒光定量PCR引物,合成的序列如下: 上游5′-GAGTGTGGAGACCATCAAG-3′,下游5′-TGAGTTCATGTATTGCTTTG-3′;實驗以看家基因GAPDH作為內參,合成引物為: 上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,下游5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。以SYBR Green I 熒光定量試劑盒檢測mRNA的表達。反應體系為25 μL,包含cDNA模板2 μL,水9.5 μL,SYBR Green MIX 12.5 μL,上下游引物稀釋濃度為10 μmol/L,反應體系各加入0.5 μL。PCR反應條件為: 95 ℃變性5 min; 94 ℃變性15 s,60 ℃退火與延伸30 s,共計40個循環。

1.8 實驗動物分組及免疫 對30只16～18 g雌性BALB/c小鼠,隨機分為PBS、BCG、佐劑組(弗氏不完全佐劑)、融合蛋白(Rv2628c-Rv1737c)+佐劑組和BCG+融合蛋白+佐劑組,每組6只,經皮下2點注射免疫。用PBS配制2 mg/mL的融合蛋白,與DMT佐劑等體積混合,乳化,制備融合蛋白+DMT佐劑混懸液。BCG組注射1次;PBS和融合蛋白+DMT佐劑組每1周注射1次,共4次;BCG+融合蛋白+DMT佐劑組在免疫BCG1周后,用融合蛋白+DMT佐劑加強免疫3次,間隔1周。各組每次注射劑量均為100 μL/只,BCG注射劑量約為1×106CFU/只。免疫后6周,將各組小鼠處死,取脾臟提取淋巴細胞,摘眶采血,收集血清。

1.9 ELISA法檢測小鼠血清結核特異性抗體水平

取融合蛋白以包被緩沖液進行稀釋至10 μg/mL,96孔酶標板每孔加100 μL,酶標板置濕盒中放置4 ℃過夜;取出酶標板,吸去包被液,洗板3次;每孔加入1∶100稀釋的血清100 μL,37 ℃孵育2 h;洗板3次;將HRP標記的羊抗鼠IgG抗體1∶2 000稀釋,每孔加入100 μL,37 ℃孵育2 h;洗板3次;加入等比混合的顯色液A、B液,每孔100 μL,避光放置30 min;每孔加入終止液50 μL,以空白孔為零點,在酶標儀檢測波長450 nm的吸收值。

1.10 ELISA法檢測小鼠脾細胞培養上清中抗原特異性Th1型細胞因子水平 在24孔板中每孔加入2.5×106個小鼠脾細胞,RPMI 1640培養基、MTB全菌裂解液、融合蛋白分別作為陰性、陽性和實驗組刺激物。陰性對照孔加入RPMI 1640完全培養基,20 μL/孔;實驗孔加入20 μL融合蛋白,終濃度為10 μg/孔;陽性對照孔加20 μL MTB全菌裂解液,終濃度為10 μg/孔。置37 ℃培養48 h,400×g離心10 min,收集上清。采用鼠細胞因子ELISA檢測試劑盒進行檢測,具體操作按說明書進行。

2 結 果

2.1 潛伏感染抗原Rv2628c-Rv1737c原核重組與純化 對Rv2628c-Rv1737c蛋白密碼子核酸序列根據原核系統表達特點進行優化,全基因合成后,克隆到表達載體為pET24a,測序正確,成功構建原核表達載體pET-28a-Rv2628c-Rv1737c,轉化E.coli感受態細胞BL21(DE3)進行原核重組表達,以12%SDS-PAGE電泳發現重組蛋白以包涵體的形式存在(圖1)。包涵體經尿素溶解后,進行柱上復性,以120 mmol/L咪唑洗滌目的蛋白,12%SDS-PAGE電泳分析純度。結果如圖2所示,純化后的重組蛋白純度在90%以上,分子量大約為57 kDa(Rv2628c分子量為13 kDa、Rv1737c分子量為43 kDa)同預期結果一致,BCA蛋白濃度測定融合蛋白濃度為2.5 mg/mL。

注:M.低分子量蛋白標準;1.未誘導的全菌體; 2.誘導的全菌體; 3.超聲沉淀; 4.超聲上清。圖1 Rv2628c-Rv1737c蛋白原核表達形式SDS-PAGE分析Fig.1 Analysis of Rv2628c-Rv1737c protein expression in a prokaryotic system

注:M.低分子量蛋白標準;1.上樣前溶解的包涵體; 2和3.純化后Rv2628c-Rv1737c。圖2 Rv2628c-Rv1737c 蛋白柱上復性與親和純化 SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of Rv2628c-Rv1737c protein after column renaturation and affinity purification

2.2 健康者外周血PBMCs受不同MTB抗原刺激前后IFN-γ mRNA表達差異 刺激前健康者IFN-γ mRNA表達量為3.9±1.2,經ESAT-6/CFP10(pool) 和Rv2628c-Rv1737c抗原刺激后,PBMCs中 IFN-γ mRNA表達量分別為4.0±1.3(t=1.44,P=0.16)和3.9±1.3(t=0.008,P=0.99),刺激前后差異無統計學意義(P>0.05);但健康者PBMCs經MTB全菌裂解液混合物刺激后,PBMCs中 IFN-γ mRNA表達量出現明顯上升,由刺激前的3.9±1.2上升到刺激后的14.7±3.5(t=17.8,P<0.001)。見圖3。

圖3 健康者PBMCs 經不同 MTB 抗原刺激前后IFN-γ mRNA表達差異Fig.3 IFN-γ mRNA expression differences in PBMCs from healthy individuals after stimulation with diverse MTB antigens

2.3 ATB患者PBMCs 受不同MTB抗原刺激IFN-γ mRNA表達差異 活動期結核病患者PBMCs經不同的MTB抗原刺激后,IFN-γ mRNA的表達量均出現明顯變化,其中經ESAT-6/CFP10(pool) 抗原多肽刺激后,PBMCs中 IFN-γ mRNA表達量上升為16.7±5.3;經潛伏感染相關抗原Rv2628c-Rv1737c刺激后,PBMCs中 IFN-γ mRNA表達量上升為128±18.9;經MTB全菌裂解液刺激后,PBMCs中 IFN-γ mRNA表達量上升為217±34.1。ATB患者PBMCs 經不同抗原刺激,IFN-γ mRNA 的表達量差異有統計學意義(F=175.1,P<0.001)。結果見圖4。

圖4 ATB患者 PBMCs 經不同 MTB 抗原刺激前后IFN-γ mRNA 表達差異Fig.4 IFN-γ mRNA expression differences in PBMCs in patients with ATB after stimulation with diverse MTB antigens

2.4 LTBI者PBMCs 受不同MTB抗原刺激IFN-γ mRNA表達差異 與活動期結核病患者PBMCs相似,潛伏感染結核病患者PBMCs 經不同的MTB抗原刺激后,IFN-γ mRNA的表達量均出現明顯變化,其中,經ESAT-6/CFP10(pool)抗原多肽刺激后PBMCs中 IFN-γ mRNA表達量上升至14.7±4.9;經潛伏感染相關抗原Rv2628c-Rv1737c刺激后,PBMCs中 IFN-γ mRNA表達量上升至150±28.3;經MTB全菌裂解液刺激后,PBMCs中 IFN-γ mRNA表達量上升至198±31.6。LTBI者PBMCs 經不同抗原刺激,IFN-γ mRNA 的表達量差異有統計學意義(F=369.9,P<0.001)。結果見圖5。

圖5 LTBI者PBMCs 經不同MTB抗原刺激前后IFN-γ mRNA表達差異Fig.5 IFN-γ mRNA expression differences in PBMCs in patients with LTBI after stimulation with diverse MTB antigens

2.5 Rv2628c-Rv1737c刺激不同人群血清PBMCs后IFN-γ mRNA表達差異 與刺激前相比,ATB和LTBI者的PBMCs在經過Rv2628c-Rv1737c刺激后,IFN-γ mRNA的表達量均出現顯著升高,分別上升到128±18.9(t=28.17,P<0.001)和150±28.3(t=26.11,P<0.001),3組樣本經Rv2628c-Rv1737c 刺激后, IFN-γ mRNA 的表達量差異有統計學意義(F=486.2,P<0.001)。見圖6。

圖6 Rv2628c-Rv1737c刺激不同人群PBMCs IFN-γ mRNA表達差異Fig.6 IFN-γ mRNA expression differences in PBMCs in different populations after stimulation with Rv2628c-Rv1737c antigens

2.6 各組小鼠血清中抗原特異性IgG抗體水平 免疫后6周,處死小鼠,用MTB全菌裂解液和 融合蛋白分別檢測各小鼠血清抗體水平。PBS組小鼠用MTB全菌裂解液和融合蛋白檢測,均無明顯特異性 IgG 抗體產生;用融合蛋白檢測,BCG組抗體水平與PBS組差異無統計學意義(t=1.23,P>0.05),融合蛋白+DMT佐劑組和BCG+融合蛋白+DMT佐劑組抗體水平較PBS組顯著升高(t融合蛋白+佐劑=15.92,tBCG+融合蛋白+佐劑=16.02,均P<0.01)。用MTB全菌裂解液檢測時,BCG組、融合蛋白+DMT佐劑組和BCG+融合蛋白+DMT佐劑組與PBS組比較,抗體水平均有顯著提升(tBCG=12.5,t融合蛋白+佐劑=6.6,tBCG+融合蛋白+佐劑=16.9,均P<0.01),結果如圖7所示。

圖7 Rv2628c-Rv1737c免疫小鼠產生IgG抗體值分析Fig.7 Analysis of IgG antibody levels in mice immunized with Rv2628c-Rv1737c

2.7 各組小鼠脾細胞特異性Th1型細胞因子水平 處死小鼠后分離、培養脾淋巴細胞,用MTB全菌裂解液和融合蛋白刺激時,PBS組均分泌最低水平的IL-2、IFN-γ 和 TNF-α;佐劑組與PBS組分泌IL-2(t=2.02,P>0.05)、IFN-γ(t=1.16,P>0.05)、TNF-α(t=1.47,P>0.05)無差異,其他各組分泌 IL-2(tBCG=5.8,t融合蛋白+佐劑=30.5,tBCG+融合蛋白+佐劑=42.5)、IFN-γ(tBCG=30,t融合蛋白+佐劑=30.5,tBCG+融合蛋白+佐劑=42.5)和TNF-α(tBCG=8.8,t融合蛋白+佐劑=12,tBCG+融合蛋白+佐劑=39)與PBS組差異均有統計學意義(均P<0.05)。融合蛋白刺激時,BCG組分泌各細胞因子水平均低于融合蛋白+佐劑組(tIL-2=3.56,tIFN-γ=17.4,tTNF-α=6.67,均P<0.05)和BCG+融合蛋白+佐劑組(tIL-2=4.38,tIFN-γ=25.6,tTNF-α=15.0,均P<0.05)。MTB全菌裂解液刺激時,融合蛋白+佐劑組分泌各細胞因子水平均低于BCG組(tIL-2=2.9,tIFN-γ=6.8,tTNF-α=12.5,均P<0.05)和BCG+融合蛋白+佐劑組(tIL-2=5.6,tIFN-γ=11.0,tTNF-α=4.0,均P<0.05)。實驗結果見圖8。

圖8 各組小鼠脾細胞分泌抗原特異性IFN-γ(A)、TNF-α(B)和IL-2(C)水平Fig.8 Antigen specific IFN-γ(A),TNF-α(B), and IL-2(C) levels secreted by spleen cells from mice in each group

3 討 論

LTBI無特異性的癥狀和體征指標,實驗室診斷缺乏統一的方法和金標準。雖然LTBI者無傳染性,但當機體因為消瘦、疲勞和其他并發癥導致免疫力降低時,會導致 MTB大量增殖,發展為活動性結核,嚴重情況下引發全身播散性結核,如消化道結核、骨結核,尤其是引起結核性腦膜炎[14-15]。尋找快速、有效的診斷方法鑒別LTBI者并對其進行預防性治療,是減少活動性結核發生的有效途徑。IFN-γ 是機體對抗結核分枝桿菌感染的一類重要的Th1型細胞因子,主要由活化的T細胞和NK細胞產生[16],IFN-γ 對阻礙和殺滅機體胞內 MTB有重要作用。研究發現,IFN-γ 受體缺乏則可能使人群對TB 的易感性升高[17]。結核病患者在不同感染狀態具有特異性的抗原特征譜,通過免疫分析可以區分不同感染狀態[18]。本項研究中,選擇 Rv2628c-Rv1737c融合蛋白作為 TB患者靶抗原,通過刺激不同樣本人群PBMC細胞IFN-γ mRNA水平的檢測,發現相對于刺激前,其可特異性誘導 MTB 感染者PBMC細胞產生高水平的 IFN-γ,尤其在LTBI者中誘導的特異性 IFN-γ水平顯著高于ATB 感染者。實驗發現,Rv2628c-Rv1737c相對于ESAT-6/CFP10抗原多肽具有較高的敏感性,對MTB全菌裂解液而言又具有較強的特異性,同時ATB和LTBI人群PBMCs受Rv2628c-Rv1737c融合蛋白刺激時,IFN-γ mRNA表達均出現上調,分別上升到128±18.9和150±28.3,利用Rv2628c-Rv1737c抗原刺激IFN-γ 表達差異特性以區分TB患者臨床活動性期與潛伏感染期。本實驗中出現樣本受Rv2628c-Rv1737c抗原刺激后出現假陰性現象,存在原因可能是受試者因為自身免疫力低下的原因造成,同時樣本的受融合抗原刺激后,陽性樣本的IFN-γ 表達出現明顯的個體差異,這需要在后續實驗中進行條件優化,提高檢測的平行性。

蛋白亞單位疫苗是研究新型有潛力的結核疫苗之一,篩選出能夠被MTB感染者T 細胞免疫識別的潛力靶抗原,是構建更強保護力的新型TB 亞單位疫苗的保證[19]。目前多數進入臨床試驗的TB蛋白疫苗保護性有限。MTB感染者中含有大量LTBI人群,對這類人群進行預防保護,阻止發展成為ATB患者,是2035年消滅結核病的關鍵一環。目前認為結核抗原誘導Th1 型免疫應答水平(尤其是抗原特異性IFN-γ水平)與抗TB 保護性密切相關[20]。誘導效應性和記憶性CD4+和CD8+T細胞產生高水平 IFN-γ和 IFN-γ/IL-2 多功能應答效應,成為評價候選疫苗靶抗原免疫原性的重要依據[21]。Arroyo等[22]比較Dos R、重組融合蛋白ESAT-6-CFP10(E6-C10)和結核菌素(PPD)抗原刺激潛伏感染人群和活動性結核患者的外周血單核淋巴細胞,檢測細胞上清液 IFN-γ 水平,認為 pfkB 是區分LTBI和活動性感染組的最優單一抗原,作為Dos R調控蛋白,Rv2628c、Rv1737c均屬于潛伏感染相關抗原,本實驗鑒于IFN-γ釋放試驗和潛伏感染抗原的免疫特點,通過原核系統重組、表達和純化獲得Rv2628c-Rv1737c融合蛋白,去刺激ATB和LTBI人群均檢測到IFN-γ mRNA表達水平在兩者具有差異和較強特異性,在鑒別ATB和LTBI人群上具有潛在應用價值。另外實驗小鼠模型中,Rv2628c-Rv1737c/DMT和BCG+Rv2628c-Rv1737c/ DMT免疫小鼠均可誘導出IFN-γ、TNF-α和IL-2因子的高水平分泌,以及產生特異性 Ig G。TNF-α 參與了肉芽腫的形成,其協同 IFN-γ共同誘導單核細胞和粒細胞向感染病灶的遷移,控制MTB感染[23],因此重組Rv2628c-Rv1737c/DMT 誘導小鼠產生以Th1型細胞反應為主的免疫應答。實驗數據證實,重組Rv2628c-Rv1737c/DMT的免疫效果低于BCG組,這也佐證BCG作為減毒活菌疫苗,能在較長時間內持續刺激機體免疫反應,引起的免疫反應比單一抗原或組合抗原引起的免疫反應要強,而BCG+Rv2628c-Rv1737c/DMT組比Rv2628c-Rv1737c/DMT組及BCG的免疫效果都要強,說明Rv2628c-Rv1737c組合蛋白能增強BCG的免疫效果,可以用于構建重組卡介苗,或者用于卡介苗接種后的加強接種。

本研究獲得的Rv2628c-Rv1737c蛋白能刺激TB患者尤其是 LTBI 者外周血 T 細胞特異性識別,誘導小鼠產生以Th1 型細胞反應為主的免疫應答,而且可以增強卡介苗的免疫應答,因此可作為靶抗原用于構建融合多肽抗原的TB 增強保護型亞單位疫苗及重組卡介苗。

利益沖突：無