特勒凱比爾沙門菌臨床血流分離株的毒力研究

鄭恩惠,邱玉鋒,陳建輝,高亞東,黃夢穎,李曲文,林 杰,翁順太

非傷寒沙門菌(Non-typhoid salmonella, NTS)是導致急性胃腸炎的主要食源性病原之一,具有廣泛的宿主范圍。當它感染嬰幼兒、老年人和免疫功能低下的群體,可導致侵入性的臨床疾病[1]。Sell J等[2]研究報道,2011年美國胃腸炎感染患者中,11%是由NTS感染引起的,NTS感染是住院甚至死亡的主要原因。

2019年,課題組從患者血液中分離出1株罕見血清型的沙門菌菌株,經血培養、生化鑒定、血清學和飛行質譜等系列鑒定,確認病原為G群特勒凱比爾沙門菌,經數據庫比對為福建省內、亦是國內首次檢出人感染沙門菌血清型[3]。

由于人類大多數沙門菌感染病例是由動物源性食物引起的,人們對了解沙門菌如何與動物宿主相互作用、如何突破宿主屏障并操縱宿主細胞使其自身受益,產生了濃厚的興趣,開始對宿主體內感染動力學的進一步研究[4]。但目前大部分研究是利用少數典型菌株進行,不清楚不同血清型之間的體內代謝差異有多大[5]。為掌握該血清型沙門菌的致病特點,我們建立ICR小鼠模型,研究感染后宿主體征、組織病理學變化特點,對豐富沙門菌流行病學和防控策略意義重大。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SPF級ICR小鼠120只,雌雄各半,購自北京華阜康[SCXK(京)2019-0008],體重22～26 g。ABSL-2實驗室備案號為2022105532, 本實驗室保存的特勒凱比爾沙門菌菌株號為2018103,動物倫理審查號為No.PZ2022043。

小鼠受試前用 5 mg/mL鏈霉素腹腔注射0.5 mL/只,連續 2 d,后正常飼養 1 d,實驗前禁水禁食 8 h。實驗組及對照組每組10只、雌雄各半,實驗組腹腔注射菌液0.5 mL/只,對照組接種PBS液0.5 mL/只。統計小鼠死亡數,計算LD50。

1.3 組織病理、透射電鏡和淋巴細胞免疫組化實驗 接種后,生物安全柜內采集死亡、存活和對照組小鼠的肝、脾、肺、心、腎和空腸等組織,稱重。組織一分為二,一份用2.5%戊二醛浸泡固定用于透射電鏡實驗,另一份用4%多聚甲醛浸泡固定進行病理HE、免疫組化實驗。

1.4 排菌周期觀察 取小鼠新鮮糞便2～3粒于SBG增菌液中,37 ℃培養18 h并劃線于DHL平板上,37 ℃培養24 h后,挑取沙門菌典型菌落接種于雙糖斜面上。挑取雙糖斜面上少許菌苔,用沙門菌丹麥診斷血清進行凝集實驗,驗證是否為特勒凱比爾沙門菌。

1.5 組織細菌載量測定 用LD50劑量接種小鼠,對照組接種PBS液,每只0.5 mL。感染后第3 d、6 d、9 d、12 d、15 d,每組隨機處死3只小鼠,同樣采集上述6種組織,稱重后置EP管中,加入1 mL PBS液和1粒無菌不銹鋼球進行勻漿。勻漿液依次10倍稀釋,取100 μL于3個DHL中,37 ℃培養18 h后進行。菌落計數,計算不同組織在不同感染時間的平均細菌載量。

1.6 小鼠菌株分離培養與實驗室評價

1.6.1 分離培養無菌 取LD50實驗組小鼠新鮮糞便2～3粒置SBG中,37 ℃培養24 h。挑取SBG增菌液于DHL上,37 ℃培養24 h。

1.6.2 飛行質譜鑒定 分別挑取人分離株和小鼠分離株DHL平板上單個菌落,均勻涂抹MALDI MSP靶板圓孔,晾干后每孔滴加1 μL 70%甲酸溶液和1 μL HCCA基質液,干燥后上機檢測。

1.6.3 生化鑒定 分離出的菌株采用VITEK2 Compact予以鑒定。

1.6.4 血清型鑒定 小鼠分離株采用沙門菌丹麥診斷血清進行凝集實驗。

1.6.5 PCR檢測毒力基因 引物由上海尚亞合成,cdtB-F: GAAACAAGTCAGGCATTGCC,cdtB-R: GAATGGCTCATAAACACGCC,pltA-F: GT-GGGACTATCATCGTGCAG,pltA-R: AGGGTGATCAACGTAACCAC,pltB-F: GCCGGAAGTACCTGTGTTAT,pltB-R: AGTAGTGAAAA-CCCATCGCG。按照試劑盒說明書提取特勒凱比爾沙門菌基因組,-20 ℃保存。PCR反應總體積為20 μL,其中2×Taq PCR Premix Taq(TaKaRa公司)10 μL,F和R引物(20 μmol/L)各0.4 μL,DNA模板3 μL,ddH2O 6.2 μL。PCR反應步驟:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸70 s,30個循環;72 ℃延伸5 min。然后對PCR擴增產物進行測序。

1.6.6 PFGE實驗 小鼠分離株與人分離株和5株其它血清型沙門菌進行分子分型實驗。

1.7 測序和生物信息學分析 細菌全基因組測序由北京諾禾致源生物科技有限公司完成。測序后的序列通過VFDB進行生物信息學分析(http://www.mgc.ac.cn/cgi-bin/VFs/v5/main.cgi?func=VFanalyzer)和Center for Genomic Epidemiology (http://www.genomicepidemiology.org/services/)。NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP) 用于注釋已拼接組裝的基因組完成圖,NCBI GenBank登入號:CP111029,人源菌株基因組框架圖NCBI登入號:SAMN16287684。

1.8 統計分析 采用SPSS 20.1軟件對實驗數據進行統計分析,實驗數據以平均值±標準差表示,組間比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 感染小鼠臨床和解剖癥狀 原液及10-1～10-4實驗組感染小鼠后0.5 h即出現臨床癥狀,卷縮、眼神呆滯、被毛松亂。原液及10-1實驗組接種4 h后死亡,持續24 h。10-2～10-4實驗組感染后12 h開始死亡,持續72 h。死亡小鼠因腹瀉致肛周被毛沾染稀便,臨死前倒地抽搐。10-5～10-6實驗組感染后出現短暫嗜睡外,無其它不適反應。死亡小鼠解剖發現小腸充血嚴重,空腸、回腸、盲腸可見較多氣泡、積液,盲腸壞死;肝尖點狀變性,腎臟表面有壞死灶,肺臟蒼白、局部壞死,脾臟萎縮。對照組均正常。

2.2 感染小鼠健康狀況 感染后各組小鼠死亡數與成活數見表1。

表1 感染后各組小鼠死亡數與成活數Tab.1 The number of deaths and survival of mice in each group after infection

2.3 半數致死量(LD50)測定 在10-9稀釋濃度接種營養瓊脂培養基后進行菌落肉眼計數,3次有效菌落計數分別為42 CFU、39 CFU、46 CFU,菌落平均計數為42.3 CFU。結合表1中半數致死濃度,按Korbor法公式算出特勒凱比爾沙門菌的LD50為2.67×108CFU/mL,95%可信限上限為 7.99×108CFU/mL,95%可信限下限為8.92×107CFU/mL。

2.4 組織病理、投射電鏡、淋巴細胞免疫組化實驗結果(以心臟、空腸為例)

2.4.1 組織病理學結果 對照組心肌細胞正常均勻、無炎細胞浸潤。10-1組、10-2組、10-3組心肌細胞排列規整,輕微炎細胞浸潤。原液組心肌間質小灶狀炎細胞浸潤,毛細血管擴張充血。見圖1。

注:A.原液;B.10-1;C.10-2;D.10-3;E.對照。圖1 不同稀釋度下特勒凱比爾沙門氏菌接種的小鼠心肌組織HE染色 (200×)Fig.1 HE staining of myocardial tissue in mice at different dilutions with Salmonella Telelkebir(200×)

注:A.原液;B.10-1;C.10-2;D.10-3;E.對照。圖2 不同稀釋度下特勒凱比爾沙門氏菌接種的小鼠空腸組織HE染色(200×)Fig.2 HE staining of jejunum tissue in mice at different dilutions with Salmonella Telelkebir(200×)

對照組絨毛排列整齊,環壁、黏膜上皮正常。原液組、10-1組、10-2組絨毛斷裂、脫落,腸壁變薄,黏膜上皮不同程度損傷,伴炎細胞浸潤,10-3組腸壁變薄,伴炎細胞浸潤。見圖2。

2.4.2 空腸超微結構檢查結果 腸黏膜上皮細胞輕微水腫,個別細胞器明顯腫脹。微絨毛(MV)輕微水腫,上皮細胞緊密連接(TJ)、中間連接(ZA)可見,橋粒(De)存在,細胞間隙狹窄。細胞核(N)近似圓形,核周隙略微增寬,異染色質邊集,核仁(Nu)居中。線粒體(M)數量一般,嵴輕度擴張。粗面內質網(RER)輕度擴張,表面可見核糖體附著。高爾基體(Go)囊膜輕中度擴張。胞內可見少量溶酶體(Ly)結構。見圖3。

圖3 10-2劑量組空腸超微結構檢查結果Fig.3 The results of transmission electron microscopy of jejunum tissue of 10-2 group surviving mice

注:A.原液;B.10-1;C.10-2;D.10-3;E.對照。圖4 不同稀釋度下特勒凱比爾沙門氏菌接種的小鼠心臟組織免疫組化檢測結果(200×)Fig.4 Immunohistochemical test results of mouse heart tissue at different dilutions with Salmonella Telelkebir(200×)

注:A.原液;B.10-1;C.10-2;D.10-3;E.對照。圖5 不同稀釋度下特勒凱比爾沙門氏菌接種的小鼠空腸組織免疫組化檢測結果(200×)Fig.5 Immunohistochemical test results of mouse jejunum tissue at different dilutions with Salmonella Telelkebir(200×)

2.4.3 免疫組化檢測結果 通過對小鼠組織中的CD3檢測,與對照組相比,10-3、10-2、10-1、原液組中的CD3含量顯著增多,且呈遞增狀態。見圖4、圖5。

2.5 感染后小鼠排菌周期檢測結果 10-5、10-6劑量組排菌僅2周左右,而10-1～10-4劑量組排菌時間可超100 d,但排菌量逐漸下降,糞便油性呈褐色。喹諾酮藥物干預后恢復正常。見表2。

表2 感染后小鼠排菌周期檢測結果Tab.2 Test results of bacterial excretion cycle of mice after infection

2.6 感染后小鼠相關組織細菌載量測定結果 小鼠脾臟、腎臟、肺臟、肝臟、空腸細菌載量感染后3 d達到高峰,而心臟第6 d達高峰,之后呈動態變化。見圖6。

圖6 感染后不同時間小鼠相關組織細菌載量(lgCFU/g)Fig.6 Bacterial load in related tissues of mice at different times after infection (lgCFU/g)

2.7 實驗室評價結果

2.7.1 菌株分離與鑒定 小鼠糞便DHL平板培養均出現約1 mm左右中心黑色、周邊半透明菌落。挑取典型單菌落進行全自動生化與飛行時間質譜鑒定,結果均為沙門菌屬。進一步使用丹麥沙門菌診斷血清凝集實驗確認為特勒凱比爾血清型。

2.7.2 PCR毒力基因檢測 為確認感染小鼠后菌株的致病力沒有改變,使用PCR擴增鼠源特勒凱比爾沙門菌cdtB、pltA和pltB3個毒力基因,結果與人源株一樣具有3個毒力基因(圖7)。

注:2、5、8分別為人源cdtB、pltA、pltB; 3-4、6-7、9-10分別為鼠源cdtB、pltA、pltB。圖7 PCR毒力基因檢測結果Fig.7 PCR virulence gene test results

2.8 全基因組測序和生物信息學初步分析 基因組組裝結果顯示菌株擁有唯一的環狀染色體,大小為4 610 213 bp,GC含量52.22%(圖8),無任何類型的質粒。NCBI注釋表明基因組共含有4 432個基因,其中包含4 204個編碼蛋白基因、110個假基因、22個rRNAs、84個tRNAs、12個ncRNAs和2個短重復序列(CP111029)。使用CGE ResFinder-4.1(標準參數設置,下同)發現菌株攜帶氨基糖苷類耐藥aac(6′)-Iaa和磷霉素耐藥基因fosA7,并且喹諾酮耐藥決定區發生parC:p.T57S突變。使用CGE MLST-2.0 Server 鑒定該菌株為ST5494型,使用CGE SPIFinder 2.0預測沙門菌毒力島(SPI),該菌株擁有SPI1-SPI5、SPI9、SPI13-14和1個未知SPI。把該菌基因組與細菌致病菌毒力因子(VFDB)數據庫比對,發現存在cdtB、pltA、pltB、菌毛粘附決定因子基因、分泌系統基因等,其中pltA和pltB基因位于毒力島SPI1上,cdtB、pltA、pltB3個基因與PCR檢測結果一致。

3 討 論

近年來,利用動物模型開展相關傳染病研究日漸增多,對增強傳染病流行病學特征研究發揮重要作用。雷占東等[6]以BALB/c小鼠為實驗對象,采用灌胃方法接種御成門沙門菌,確定LD50為5×102CFU/mL。王偉等[7]以ICR小鼠為對象,采用灌胃法接種腸炎沙門菌,其LD50為1×105.67CFU/mL。研究表明,高劑量干預可能會突破宿主的免疫防疫系統,侵入到宿主各組織器官造成病理損傷,引起動物死亡。朱春紅等[8]以BALB/c小鼠為對象,通過腹腔注射感染腸炎沙門菌,確定其LD50為19.95 CFU/mL。姚營等[9]研究發現,感染鼠傷寒沙門菌后,小鼠可誘發全身性的炎癥反應;空腸黏膜下層出現嚴重的水腫和單核細胞炎性浸潤;透射電鏡顯示腸道絨毛部分斷裂,上皮細胞線粒體空泡化,嵴和膜消失;腸道淋巴細胞大量增殖。

本研究以ICR小鼠為實驗對象,采用腹腔注射方式感染特勒凱比爾沙門菌,LD50為2.67×108CFU/mL。感染后0.5 h即可出現臨床癥狀,卷縮、被毛松亂;死亡小鼠解剖發現小腸充血嚴重,可見較多氣泡、積液,盲腸壞死,肝尖點狀變性壞死,腎臟表面有壞死灶、肺臟局部壞死。實驗組各組織均可見炎細胞浸潤。實驗組小鼠心肌毛細血管擴張充血;肝細胞大面積空泡變樣,部分肝細胞變性、壞死,靜脈內皮下輕度水腫,肝竇輕度擴張伴出血;脾竇擴張明顯,分區模糊,部分區域纖維化明顯;腎小球基膜增厚、毛細血管增生,腎小管擴張,管腔增大,腎小球不同程度萎縮;氣管、纖毛上皮部分剝脫、氣管黏膜皺嬖增多、變長;空腸組織絨毛斷裂、萎縮、脫落、消失,腸壁變薄,黏液層、黏膜上皮不同程度損傷。對照組小鼠各組織均正常。免疫組化檢測結果表明,隨著感染劑量增大,小鼠組織中的CD3含量呈遞增狀態,免疫系統受到刺激和炎癥反應愈加強烈。

本研究發現在急性感染時,小鼠脾臟萎縮變小,死亡小鼠脾臟更小,而恢復期小鼠脾臟變粗大。這與Mshelbwala FM等[10]研究結果明顯不同。Mshelbwala FM等通過對尼日利亞3個州的家禽養殖場感染沙門菌死亡的雞及14 d天小母雞進行不同血清型沙門菌感染實驗發現,無論是自然感染還是實驗室感染,雞的肝臟、脾臟、腎臟出現明顯增大的病變過程,這種明顯不同,應該與感染宿主、感染劑量有一定關系,宿主自身免疫狀態是引起感染后果的原因。

聶晶晶等[11]研究發現,感染后24 h可在大鼠模型糞便中檢出腸炎沙門菌,持續排菌時間為1～15 d不等。本研究10-1～10-4劑量組排菌時間持續100 d以上,無藥物干預時動物呈現漫長的排菌過程,對動物影響趨小,成為“健康帶菌者”,排菌時間越長,動物模型可利用周期也越長。在不同感染階段采用喹諾酮藥物對相關實驗組成活小鼠進行治療,劑量為20 IU/只,連用3 d,效果明顯,第4 d起即停止排菌。而10-5～10-6劑量組小鼠感染后排菌時間僅持續10 d(表2)。不同感染時間的不同組織的細菌負荷以感染后第6 d的心臟最高,其次是肝臟。感染后死亡小鼠心臟平均細菌載量為46.59 lgCFU/g,高于存活小鼠心臟28.41 lgCFU/g(t=119.41,P<0.05);高于存活小鼠的肝臟34.76 lgCFU/g(t=15.56,P<0.05)。

Miki T等[12]使用鏈霉素小鼠模型對沙門氏菌結腸炎進行腸道內穩態研究,發現RegⅢβ可促進鼠傷寒沙門菌的持續腸道定殖,延長病程。RegⅢβ是一種殺菌凝集素,是由腸上皮細胞分泌到腸腔中的抗菌劑[13-14]。Kilroy S等[15]研究腸炎沙門菌鞭毛在母雞輸卵管定殖中的作用,發現缺乏功能性鞭毛的突變體在母雞輸卵管定殖的效率更高,通過下調腸炎沙門菌鞭毛蛋白來避免宿主免疫應答。這些可能都構成特勒凱比爾沙門菌長時間定殖小鼠體內的主要機制。

從全基因測序和PCR結果分析,特勒凱比爾沙門菌小鼠分離株與人分離株一樣含有cdtB、pltA、pltB等沙門菌毒力因子。提示我們不能忽視較少報道的某些沙門菌血清型,它們也攜帶獨特的毒力因子而導致不良的臨床表現甚至死亡。程瓊等[16]研究表明,不同沙門菌對小鼠致病力表現與其毒力基因的分布存在相關性,但病原體的致病力除了毒力基因還與其他因素有關,這有賴于后期對全基因組更深入的研究與分析,包括轉錄組分析等。

人分離株和LD50小鼠模型分離株DHL平板上生長菌落經飛行質譜鑒定均為Salmonellasp.,得分分別為2.24、2.08,均屬極好的鑒定結果;生化鑒定結果兩者完全一致,符合沙門菌特征,均為非常好的鑒定。說明在建模研究中排除了其它微生物影響,小鼠模型對特勒凱比爾沙門菌進行了準確的表達、反應。

毒力是一種復雜的表型,只有在宿主體內與病原體相互作用時才能充分表現出來[17]。本研究首次利用ICR小鼠建立特勒凱比爾沙門菌動物模型,再現了細菌感染、復制、宿主免疫和病理過程,證明了ICR小鼠特勒凱比爾沙門菌模型是成功的。該模型的建立,可為今后在體內水平加強特勒凱比爾沙門菌“單一”或“多重”耐藥分子病理機制、產生機制研究,為噬菌體技術、抗耐藥藥物研發、益生菌研發、疫苗研發等提供有效的動物模型,同時為該血清型沙門菌的藥物治療、藥效評價和生物學評價提供臨床幫助。

利益沖突：無