溫州市食源性小腸結腸炎耶爾森氏菌毒力基因分布及遺傳多樣性研究

謝愛蓉,李 毅,樓輝煌,謝中必,章樂怡,胡玉琴,吳躍進

小腸結腸炎耶爾森氏菌為廣泛分布于環境、動物和食物中的人獸共患腸道致病菌。人感染后主要表現為胃腸道癥狀,多具有自限性。但是也可引起如心內膜炎、反應性關節炎、組織膿腫等一系列嚴重的并發癥,甚至引起敗血癥導致死亡[1]。為進一步了解食源性小腸結腸炎耶爾森氏菌致病性及遺傳進化多樣性,本研究對溫州市市售食品及腹瀉病人中分離出的小腸結腸炎耶爾森氏菌進行全基因組測序,分析其毒力基因攜帶情況,應用多位點序列分型(multi-locus sequence typing,MLST)、核心基因組多位點序列分型 (core genome multilocus sequence typing,cgMLST)對菌株進行分子分型,為溫州市食源性小腸結腸炎耶爾森氏菌的風險評估和溯源提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2020年3月至2021年11月,分離自溫州市市售相關食品樣本菌株64株;2021年3月至2022年3月,分離自溫州市食源性疾病主動監測哨點醫院就診患者(符合食源性疾病腹瀉病例定義)的糞便或肛拭標本菌株7株,共計71株小腸結腸炎耶爾森氏菌。所有菌株均經VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統及基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF MS)鑒定。

1.2 主要儀器與試劑 VITEK 2 Compact全自動細菌生化鑒定及藥敏分析系統(法國BioMérieux),基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀(德國Bruker),生化鑒定試劑購自青島海博生物科技有限公司,小腸結腸炎耶爾森氏菌分型血清采用丹麥SSI診斷血清和日本生研株式會社分型血清,微量細菌定量(MIC)藥敏試劑購自美國 Thermo公司,藥敏試驗質控菌株大腸埃希氏菌ATCC 25922購自中國工業微生物菌種保藏管理中心,細菌基因組 DNA 提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 生物、血清分型 參照文獻[2]按照生化反應的不同進行生物分型。采用玻片凝集法,進行血清分型(O∶1,2、O∶3、O∶5、O∶8、O∶9血清型),同時設生理鹽水作為對照。

1.3.2 藥物敏感試驗 采用微量肉湯稀釋法進行藥敏試驗,包括9類20種抗生素,即氨芐西林/舒巴坦(Ampicillin-sulbactam,AMS)、頭孢吡肟(Cefepime,FEP)、頭孢噻肟(Cefotaxime,CTX)、頭孢西丁(Cefoxitin,CFX)、頭孢他啶(Ceftazidime,CAZ)、氨曲南(Aztreonam,AZM)、亞胺培南(Imipenem,IMI)、美羅培南(Meropenem,MEM)、慶大霉素(Gentamicin,GEN)、阿米卡星(Amikacin,AMI)、卡那霉素(Kanamycin,KAN)、四環素(Tetracycline,TET)、多西環素(Doxycycline,DOX)、米諾環素(Minocycline,MIN)、環丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)、左氧氟沙星(Levofloxacin,LEV)、萘啶酸(Nalidixic acid,NAL)、復方新諾明(Trimethoprim-sulfamethoxazole,SXT)、磺胺異噁唑(Sulfisoxazole,Sul)、氯霉素(Chloramphenicol,CHL),結果判斷、質量控制參考美國臨床和實驗室標準化協會(The Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)抗微生物藥物敏感性試驗執行標準[3]進行。

1.3.3 全基因組測序及生物信息學分析

1.3.3.1 基因組測序 刮取適量新鮮菌落,參照DNA提取試劑盒說明書提取DNA,委托杭州微數生物科技有限公司進行全基因組測序。具體流程如下:采用Nanodrop及瓊脂糖凝膠電泳對DNA進行濃度、純度及完整性檢測后,用酶切法DNA建庫試劑盒構建文庫,隨后在Illumina NovaSeq 6000 PE150平臺上進行全基因組測序。

1.3.3.2 生物信息學分析 用FastQC軟件對測序數據進行質量控制,然后利用國家致病菌識別網高性能生物計算數據處理終端中基因組數據分析軟件進行de novo 組裝、拼接。通過細菌基因組分析平臺fIDBAC(http://fbac.dmicrobe.cn/)提交序列數據獲得毒力基因,并參考病原菌毒力因子數據庫VFDB(http://www.mgc.ac.cn)。將序列提交至Enterobase在線分析平臺(http://enterobase.warwick.ac.uk),進行多位點序列分型(MLST)和核心基因組多位點序列分型(cgMLST)。MLST分析參考McNally七基因方案:aarF、dfp、galR、glnS、hemA、rfaE、speA,獲得ST型,cgMLST采用MSTree V2算法并以GrapeTree進行可視化。

2 結 果

2.1 表型分型結果 71株小腸結腸炎耶爾森氏菌中,生物1A型67株,生物2型2株,生物3型和4型各1株。生物血清分型,除34株(47.9%,34/71)血清未定型(UN)菌株外,以1A/O∶5生物血清型占比最高(29.6%,21/71),其次為1A/O∶8生物血清型(16.9%,12/71),詳見表1。其中食品中檢出1株4/O∶3菌株,而腹瀉病人檢出1株3/O∶3菌株。

表1 不同來源小腸結腸炎耶爾森氏菌生物/血清型結果Tab.1 Bioserotype distribution of Yersinia enterocolitica from different sources

2.2 藥物敏感試驗結果 所有菌株對GEN、MIN、SXT敏感。對FEP、CTX、CAZ、AZM、IMI、MEM、AMI、KAN、TET、DOX、CHL敏感率達95.8%～98.6%。CFX耐藥率最高達39.4%(28/71),其次為CIP、NAL、Sul,耐藥率介于22.5%～25.4%,見表2。45 株菌株對至少1種抗生素耐藥,呈現 16種耐藥譜,其中多重耐藥率為 5.6%(4/71),腹瀉病人分離株未發現多重耐藥菌株。有1株菌株對6類11種抗生素耐藥。

表2 小腸結腸炎耶爾森氏菌藥物敏感試驗結果Tab.2 Susceptibility test results of Yersinia enterocolitica

2.3 主要毒力基因 71株菌株共檢出16種耶爾森氏菌主要毒力因子,包含126個毒力基因,詳見圖1。其中與鞭毛相關基因(flg、flh、fli、che、mot)多達49個,其次為Ⅲ 型分泌系統(TTSS)相關基因有37個。71株菌株均攜帶鞭毛相關基因,所有O∶8血清型菌株均含有O抗原相關基因galE和gmd。根據毒力基因攜帶情況,可見菌株YERS1025和YERB1001聚為一類,均攜帶TTSS相關基因、TTSS效應蛋白相關基因以及ail、psaA、yadA、ystA等基因。菌株YERS2012和YERS2070聚為一類,均攜帶Ysa TTSS相關基因,而缺失pla、yplA基因。而各菌株對Yst1 Ⅱ型分泌系統(T2SS Yst1)相關基因攜帶情況有所差別。

圖1 小腸結腸炎耶爾森氏菌毒力基因分布分層聚類熱圖Fig.1 Hierarchically clustered heatmap of the virulence gene distribution of Yersinia enterocolitica

2.4 遺傳多樣性分析 67株生物1A型菌株包含35種ST型,2株生物2型菌株均為ST296型,生物3/O∶3型、4/O∶3型菌株分別為ST429型、 ST18型,詳見圖2。所有ST型中ST3型最常見,占31.6%(12/38),其次為ST304型,占13.2%(5/38)。71株菌株經cgMLST分析,發現有70種CT型,除具有相同ST型的菌株外,其余菌株無明顯基因型簇形成。其中ST656型及ST726型,即包含食品分離株,也包含腹瀉病人分離株,且菌株間等位基因差異數均<10。據HC1490聚類,分為3個小分支,即HC1490_2、HC1490_10和HC1490_152 。其中菌株YERS1025和YERB1001屬于HC1490_2分支,菌株YERS2012和YERS2070屬于HC1490_152分支,其余菌株均為HC1490_10分支。

注:使用Enterobase HierCC層次聚類法進行聚類分析,每個節點圓圈的大小與菌株數量成正比,圓圈內的數字代表ST型,圓圈的顏色代表生物血清型,不同顏色的陰影表示HC1490聚類分型,標記★為腹瀉病人分離株。圖2 小腸結腸炎耶爾森氏菌cgMLST最小生成樹圖Fig.2 Minimum spanning tree of Yersinia enterocolitica cgMLST profiles

3 討 論

小腸結腸炎耶爾森氏菌根據生化反應結果的不同,可以被分為 1A、1B、2、3、4、5 型共 6 種生物型。根據 O抗原多糖反應,小腸結腸炎耶爾森氏菌可分為70余種血清型[2]。本次研究結果顯示,溫州市食源性小腸結腸炎耶爾森氏菌以生物1A型為主,占94.4%(67/71),生物血清型則以1A/O∶5占比最高,其次為1A/O∶8型,與我國其他地區食品檢出的優勢型別基本一致[4-5]。

71株小腸結腸炎耶爾森氏菌對20種抗菌藥物中的 14種抗菌藥物的敏感率達到 95.8%以上,說明大部分種類的抗菌藥物對小腸結腸炎耶爾森氏菌具有顯著的抗菌作用。研究中發現,菌株對頭孢西丁耐藥率達39.4%,低于國內相關報道[6-7],可能是因為不同地區、不同的食品類別及人群小腸結腸炎耶爾森氏菌的抗菌藥物敏感性存在差異。同時,調查發現仍有5.6%的菌株表現為多重耐藥,且其中 1株菌株對 6類 11種抗生素耐藥,在文獻[8-9]亦報告此類菌株,說明小腸結腸炎耶爾森氏菌中耐多種抗菌藥物的“超級細菌”已有所顯現,需引起關注。

本次研究中,71株菌株經注釋獲得了16種126個毒力基因。所有菌株均攜帶鞭毛相關基因,這些鞭毛相關基因(flg、flh、fli、che、mot) 在細胞侵襲、生物被膜形成、趨化機制以及動力中發揮著重要作用[10-11]。但各菌株攜帶Yst1 Ⅱ型分泌系統相關基因的情況不一,據悉所有耶爾森氏菌屬都至少具有一種T2SS(Yst1、Yst2),Yst1可能對小腸結腸炎耶爾森氏菌的致病性和環境生存適應性發揮雙重作用[12]。我們還發現有兩株菌株攜帶染色體編碼的Ⅲ型分泌系統——Ysa TTSS,其對上皮 M 細胞的早期感染和侵襲很重要,其他方面知之甚少[12-13]。生物1A型因其缺乏pYV毒力質粒和染色體上的某些毒力基因,被認為是非致病型。pYV質粒編碼完整的TTSS、耶爾森氏菌外膜蛋白 (Yop) 和耶爾森氏菌粘附素 (YadA)[14]。小腸結腸炎耶爾森氏菌通過TTSS將 Yops遞送到宿主細胞的胞質中,破壞宿主細胞信號通路并觸發預編程的代謝連鎖反應,導致細胞凋亡[15];yadA編碼粘附素Yad A,介導細胞粘附,誘導宿主細胞反應如細胞因子產生、自身凝集和血清抗性[16]。染色體毒力基因包括ail、psaA、ystA、invA等[14]。ail編碼Ail 的外膜蛋白,介導宿主細胞的附著和侵襲,以及血清抗性[14-16];psaA編碼主要的纖維亞基,包裹細菌表面,促進對腸細胞的粘附[16];yst編碼熱穩定性內毒素,ystA會導致腸粘膜損傷,導致人類腹瀉[11,17];invA基因編碼侵襲素 Inv(跨膜蛋白),通過“拉鏈”入侵機制,將細菌內化到上皮細胞中[15-16]。值得關注的是,我們研究中的2株菌株——食品分離 1株4/O∶3菌株和腹瀉病人分離1株3/O∶3菌株,攜帶上述毒力基因,為典型的致病性菌株。而據報道,4/O∶3型菌株為歐洲國家引起人食物中毒最常見的生物血清型[18],3/O∶3型則為我國5歲以下兒童感染小腸結腸炎耶爾森氏菌的主要血清型[19],因此我們需要警惕此類毒力菌株引起本地食物中毒暴發的風險。

本次研究中67株生物1A型菌株包含35種ST型、66種CT型,顯示了生物1A型菌株的遺傳多態性。同時,我們發現溫州市食源性小腸結腸炎耶爾森氏菌以ST3型最為常見,此型亦是生物1A型流行最廣泛的ST型[11]。EnteroBase 數據庫具有數據量大、分辨率高、認可度高的特點,而其基于cgMLST的HierCC 層次聚類法,對缺失基因進行了優化,大大提高了分析的精確度。我們以HC1490對溫州市食源性小腸結腸炎耶爾森氏菌進行cgMLST聚類分析,結果顯示分離株以HC1490_10分支為主,而2株致病性菌株——3/O∶3型與4/O∶3型菌株分屬HC1490_2分支,這與相關文獻報告一致[20],HC1490_10與生物1A型緊密相關,而HC1490_2與生物3、4、5型有較強相關性[20]。此外,我們還發現部分食品分離株與腹瀉病人分離株等位基因差異數<10,提示菌株間親緣關系密切,但遺憾的是,沒有相關流行病學信息用以證明他們之間的關聯性。今后可進行更廣泛的食品和腹瀉患者的調查,收集更多的流行病學信息,并深入分析菌株之間的關聯性,以便更好地預防和控制食源性小腸結腸炎耶爾森氏菌病的暴發,提升食品安全監管效果。

利益沖突：無