江蘇省某監測點家畜來源腸致病性大腸埃希菌分離株分子特征分析

孔筱筱,韓 悅,周 璐,程曉慶,董 晨

腸致病性大腸埃希菌(enteropathogenicEscherichiacoli,EPEC)是導致發展中國家嬰兒腹瀉的一個重要原因[1],已從動物和動物食品中分離出來。將攜帶編碼緊密黏附素的eae基因,而不具有編碼志賀毒素的stx基因的致瀉性大腸埃希菌(diarrheagenicE.coli,DEC)定義為EPEC[2]。我國由DEC引起的5歲以下腹瀉兒童病例中,EPEC是常見病原體[3]。

動物一直被認為是EPEC的天然宿主[4]。EPEC可被動物無癥狀攜帶,通過糞便污染周圍環境,并在屠宰和加工過程中污染肉類,從而導致人類感染[1]。江蘇省在畜牧養殖業方面有著傳統優勢,家畜糞便攜帶的EPEC對于環境污染所引發的公共衛生安全問題不容忽視。本研究對某監測點家畜來源的EPEC進行全基因組測序,了解其血清型分布、毒力基因攜帶情況、ST型別特征以及與同期分離的產志賀毒素大腸埃希菌(shiga toxin-producingEscherichiacoli,STEC)之間的遺傳進化關系,進而評估其潛在的致病性,為感染性腹瀉的監測與防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株來源 37株EPEC分離株、68株STEC分離株均分離自2019年江蘇省產志賀毒素大腸埃希菌相關監測點牛羊家畜動物的糞便中,由江蘇省疾病預防控制中心急性傳染病防制所采用磁珠法-80 ℃保存。菌株的復蘇、純化及鑒定方法參照文獻[4]。

1.1.2 主要試劑和儀器 營養瓊脂培養基(北京陸橋技術有限公司)、ECC顯色培養基(法國CHROMagar公司)、細菌基因組DNA提取試劑盒(美國Promega公司)、PCR Master Mix(美國Promega公司)、PCR儀(美國Applied Biosystems公司)、毛細管電泳儀(德國Qiagen公司)、PCR引物(上海生工生物)。

1.2 方 法

1.2.1 全基因組測序、組裝 采用細菌基因組DNA提取試劑盒對測試菌株基因組進行提取。使用Illumina HiSeq PE150測序平臺構建成對雙末端測序文庫,全基因組測序工作由上海生工生物工程有限公司完成。通過fastp 0.21.0剔除reads首尾質量

1.2.2 EPEC菌株分子特征分析

1.2.2.1 血清型 將組裝完整的基因組序列與Center for Genomic Epidemiology(CGE)SerotypeFinder v2.0數據庫[5](https://cge.cbs.dtu.dk/services/SerotypeFinder/)進行比對,設置比對參數為:序列相似性≥90%,覆蓋度≥95%,獲得菌株O∶H血清型,如果基因組血清型未預測成功,再使用EnteroBase數據庫進行血清型預測。

1.2.2.2bfpA基因、毒力基因分析 將組裝完整的基因組序列與CGE VirulenceFinder v2.0數據庫[6](https://cge.cbs.dtu.dk/services/Virulence-Finder/)進行比對,識別bfpA及其他毒力基因,設置比對參數為:序列相似性>90%,覆蓋度≥90%。

1.2.2.3 MLST分型 使用EnteroBase數據庫對菌株基因組識別基于7個管家基因(adk、icd、fumC、rgyrB、purA、mdh和recA)的MLST分型,采用MEGA v7.0.26軟件構建最小生成樹。

1.2.2.4eae基因分型及進化關系分析 從組裝完整的基因組序列中提取eae基因的全長,從NCBI GenBank數據庫中獲得常見26種eae基因型別序列。使用NCBI中BLASTn套件[7](https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行eae型別比對,當序列同源性大于98%時,則認為該分離株eae與參考eae型別一致。

使用MEGA v7.0.26軟件中Clustal W進行多序列比對并對齊,采用最大似然法構建進化樹,分析37株EPEC分離株間eae基因關系。

1.2.2.5 基于cgMLST構建EPEC與同期分離的STEC系統發育樹 本研究利用Enterobase數據庫進行cgMLST分型來評估37株EPEC與當地同期分離的68株STEC菌株之間的進化關系。cgMLST核心基因組方案采用Enterobase數據庫中大腸桿菌2 513個核心基因組等位基因位點方案[8]。通過GrapeTree v. 2.2[9]程序使用MSTree v2算法構建最小生成樹(minimum spanning tree,MST),同時將簇定義為小于10個等位基因差異的菌株群。

2 結 果

2.1 血清型、毒力基因及ST型 37株EPEC分離株共分為10種不同O血清群和7種不同H型,組成10種不同O∶H血清型。從羊糞中分離的EPEC的優勢血清型為O145∶H2 (40.5%, 15/37),O182∶H25 (21.6%, 8/37),和O71∶H11 (10.8%, 4/37)(表2)。2株來源于牛糞的EPEC血清型同屬于O10∶H25。

37株EPEC中均為bfpA基因陰性,判定為非典型EPEC(atypical EPEC, aEPEC)。其他毒力基因分布情況詳見表1。

表1 EPEC分離株其他毒力基因分布Tab.1 Distribution of other virulence genes in EPEC isolates

根據MLST分型方法,37株分離株被分成9種ST型(圖1),其中ST17和ST300比例較高,分別為40.5%(15/37)和21.6%(8/37)。除ST29 包含有2種血清型(O71∶H11,O151∶H11)外,其余ST型對應單一的血清型。

圖1 EPEC菌株ST型別構建的最小生成樹Fig.1 Minimum spanning tree constructed on the basis of EPEC strain ST type

2.2eae基因分型及進化關系分析 37株EPEC分離株經比對后,共產生5種eae型別,分別為β1、ζ、θ、ε1和ο。其中最主要的型別為β1,占比62.2%(23/37),其次為ζ,占比21.6%(8/37),而θ、ε1和ο型分別為3株、2株和1株。見表2。

表2 37株EPEC分離株eae基因分型結果Tab.2 Genotyping results of eae in 37 EPEC isolates

35株羊來源的EPEC分離株存在5種eae型別(β1、ζ、θ、ε1和ο),而2株牛來源的EPEC分離株eae型別均為θ。見表2。

eae基因的聚類結果表明: 37株菌的eae基因共分為7個組,其中組1、組3、組4分別對應不同的β1型基因序列,組5包含2種不同的θ型eae基因序列,其余3組各對應ε1、ο、ζ型的1種基因序列。從和血清型的對應關系來看,組1為β1型,包含有15株菌,血清型為O145∶H2;組2為ε1型,包含有2株菌,血清型為O103∶H2;組3 為β1型,包含有3株菌,血清型為O178∶H7、O109∶H21;組4為β1型,包含有5株菌,血清型為O71∶H11、O15∶H11;組5為θ型,包含有3株菌,血清型為O3∶H8、O10∶H25;組6為ο型,包含1株菌,血清型為O85∶H4,組7為ζ型,包含有8株菌,血清型為O182∶H25。見表2和圖2。

圖2 采用最大似然法構建eae基因的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the eae gene with the maximum likelihood method

2.3 基于cgMLST構建EPEC與同期分離的STEC系統發育樹 37株EPEC和68株同期分離的STEC進化關系采用Enterobase數據庫中的cgMLST方案,如圖3所示。所有分離株間等位基因差異為0～2 148個。當采用10個等位基因差異的聚類閾值時,EPEC 中形成了3個簇,而STEC中形成了9個簇。每個簇包含有相同的血清型和ST型,菌株間的等位基因差異為1～5個等位基因。簇間的等位基因差異數至少為51個等位基因。EPEC中的優勢簇為簇10,由13株 O145∶H2 EPEC組成。在簇12中觀察到eae陽性O182∶H25 STEC菌株和O182∶H25 EPEC菌株之間有193個等位基因差異。

注:圓圈內的編號代表菌株血清型,圓圈間連線上的數字代表等位基因差異數。圖3 基于37株EPEC和同期分離的68株STEC核心等位基因差異構建最小生成樹Fig.3 Minimum spanning tree based on core allele differences between 37 EPEC strains and 68 STEC strains isolated in the same period

3 討 論

過去,血清型一直做為EPEC的鑒定依據。隨著高通量測序技術的發展,越來越多的EPEC的血清型被發現[10-11]。迄今為止,世界范圍內已經發現200多種血清型的EPEC菌株[12]。本研究的結果顯示,監測點分離的EPEC菌株的血清型呈現多樣性。建議在EPEC日常檢測中采用分子生物學方法。

bfpA基因是區分典型EPEC(tEPEC)和非典型EPEC(aEPEC)的主要依據[1]。本研究中,所有的EPEC均為aEPEC。這與其他文獻報道的相一致:即tEPEC的宿主只有人,而aEPEC在人和動物中廣泛存在[11]。近年來越來越多的研究發現,目前aEPEC在發展中國家和發達國家的存在的比例高于tEPEC[13],甚至有報道表明其存在率達100%[14]。我國的數據也表明,中國EPEC菌株中,aEPEC菌株所占比例也顯著高于tEPEC[12]。盡管aEPEC較tEPEC引起的腹瀉癥狀輕,不會造成脫水,但是其腹瀉時間延長,容易引起兒童慢性腹瀉、營養不良等[13]。本文中aEPEC毒力基因攜帶種類多樣。值得關注的是,Ⅲ型分泌系統基因espB(67.57%)、espF(100%)、espJ(100%)、非LEE效應基因nleB(100%)、毒素相關基因ehxA(89.19%)都是與EPEC致病相關的重要毒力基因[13]。MLST分型結果表明,本地監測點EPEC菌株ST型豐富,且與其他地區報道的家畜來源的大腸埃希菌ST型不同[14],說明此監測點家畜來源EPEC的傳播具有地區局限性的特點。

eae基因位于EPEC染色體的LEE(locus of enterocyte effacement)毒力島中,會對腸黏膜造成黏附/抹平(attaching and effacing,A/E)損傷[15],全長約2 800 bp[4]。由于eae基因5′端相對保守,而3′端差異較大,根據這種差異,將eae分為不同亞型,目前已發現超過30種不同型別,不同eae型別具有不同的宿主特異性和組織嗜性[16]。本研究中,β1型是eae基因主要的亞型。有報道表明,含有β1 型eae基因的EPEC 菌株在腹瀉病人中最為常見[4]?？梢姶吮O測點動物來源的EPEC具有一定的致病潛力,需要加以關注。eae基因的聚類結果顯示,同種血清型的EPEC菌株,具有同種的eae亞型,如圖2組1中,15株O145∶H2 EPEC菌株均為β1型;同時不同血清型的EPEC菌株也可能具有相同的eae亞型,如圖3,雖然其中包含的菌株eae亞型序列相同,均為β1型,但是他們的血清型不同。這個結果可以推測,相同的eae亞型可以在不同血清型的菌株中轉移[17]。

有研究表明,aEPEC在遺傳學上和攜帶有eae基因的STEC更為接近。本研究采用基于全基因組測序技術的cgMLST方法來構建EPEC與同期分離STEC的系統發育樹,以了解EPEC和STEC之間的遺傳進化關系。結果表明,基于不同的血清型和ST型,EPEC和STEC各自成簇。其原因可能是此監測點分離到的大多數STEC不含有eae基因。而1株eae陽性O182∶H25 STEC菌株與其他STEC菌株遺傳距離較遠,與同種血清型的 EPEC菌株之間有193個等位基因差異。有研究假設,在感染、分離或繼代培養過程中,攜帶eae基因的STEC菌株可以和EPEC菌株通過丟失或溶原化編碼Stx的噬菌體進行轉化[18]。因此,我們推測這株eae陽性O182∶H25 STEC菌株的編碼Stx的噬菌體在同種血清型的EPEC中可能發生了轉移。

綜上所述,本研究采用全基因組測序技術對江蘇省某監測點分離的家畜來源的37株EPEC菌株進行特征性分析,發現此監測點家畜來源的EPEC均為aEPEC,其血清型多樣、攜帶多種與腹瀉相關的毒力基因,ST型豐富且具有區域性特征,eae基因包含有5種亞型,有1種優勢亞型在腹瀉病人中最為常見,可見此監測點aEPEC對當地公眾健康構成潛在威脅。此外,我們推測此監測點的aEPEC與STEC存在通過噬菌體的轉移發生轉化的可能性,由于STEC是一類可引起暴發和嚴重疾病的最常見致瀉性大腸桿菌,所以我們認為不可忽視家畜傳播aEPEC的潛在風險,應在感染性腹瀉的監測工作中,加強對家畜糞便及養殖環境的監測。

利益沖突：無