動物萊姆病診斷與防治技術研究進展

于驚蟄,邱建橋,周 嵐,方仁東,陳雪蕾

萊姆病(Lyme disease)又名伯氏疏螺旋體病,是一種由不同基因型伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferisensu lato)經蜱叮咬傳播引起的人獸共患自然疫源性疾病[1]。人、犬、貓、馬、牛、鹿等多種動物易感[2]。萊姆病分布范圍十分廣泛,遍布全球70多個國家和地區[3]。對人類和易感動物產生了極大威脅,現已成為全球范圍內均具有較高關注度的一類人獸共患病[4]。

萊姆病的發生和傳播極易損害畜牧業的發展,因此國內學者一直在關注萊姆病在動物中的流行情況。為了解青海省牛、羊萊姆病感染狀況,馬睿麟等[5]對青海省27個縣(市、區)中的畜牧場進行了萊姆病抗體調查,發現牛、羊血清陽性率分別為12.06%、9.98%。張衛忠等[6]采用間接熒光抗體法對采集自青海省部分草場的715頭牛血清和555只羊血清進行了萊姆病抗體檢測,結果顯示牛和羊的萊姆病平均感染率分別為12.45%和9.37%。葉鋒等[7]對新疆維吾爾自治區5種宿主動物(牛、綿羊、山羊、馬和犬)共814份血清樣品中萊姆病IgG抗體進行了檢測,檢測結果為牛、綿羊、山羊、犬和馬血清樣本的萊姆病IgG抗體陽性率分別為1.1%、4.4%、18.7%、60.5%和0%。畜牧動物可以被攜帶病原體的蜱蟲叮咬而感染萊姆病,臨床癥狀常表現為關節腫脹,跛行等,母畜感染萊姆病可導致其降低或停止產奶并出現繁殖障礙,影響家畜的生產和發育,從而對畜牧業的發展產生嚴重威脅。此外,張愛勤等[8]指出,感染后的動物宿主也會成為病原攜帶者,當人接觸到感染動物的排泄物、血液、乳類或肉和內臟時,均具有感染萊姆病的風險。因此,關注萊姆病在動物,特別是家畜以及寵物中的流行狀況并積極發展萊姆病的預防及診斷等技術,對畜牧業發展以及人體健康具有重要的現實意義。

當前,動物患萊姆病的臨床癥狀表現多樣,但尚無規范的診斷、治療方法,臨床上很容易造成誤診、漏診和治療不徹底的情況。因此,為了提高公眾對動物患萊姆病的關注并降低家畜以及寵物患萊姆病的概率,本文對動物萊姆病診斷和防治技術的研究進展作一綜述。

1 萊姆病概述

1.1 病原學 伯氏疏螺旋體是由單細胞疏松盤繞而成的左旋螺旋體,其4部分細胞結構分別為表層、外膜、鞭毛和原生質,細胞長度約為10～40 μm,直徑約0.2～0.3 μm[9],運動形式多樣,有旋轉、扭曲、抖動等[10]。

根據目前的相關研究,結合多種分型方法,伯氏疏螺旋體至少可分為23個基因型[1,12-13],且至少有以下10種對人具有致病性的基因型:B.afzelii、B.bavariensis、B.burgdorferis.s、B.garinii、B.mayonii、B.kurtenbachii、B.andersonii、B.bissettiae、B.lusitaniae、B.spielmanii[12-13]。此外,不同基因型的伯氏疏螺旋體在不同地區分布狀況存在差異。在我國,至少存在6種伯氏疏螺旋體基因型,其中B.afzelii和B.garinii是我國萊姆病的主要致病性基因型,且兩種基因型在我國的空間分布同樣存在差異,B.garinii主要分布于我國北方,而B.afzelii在我國北方和南方均存在[14-15]。

1.2 流行病學 萊姆病病原體的宿主動物較多,白足鼠和花栗鼠等小型嚙齒類動物以及野生鹿類是其主要宿主[16]。牛、馬等多種家畜,犬、貓等伴侶動物[17]以及包括兔、狐貍、狼、浣熊等在內的部分野生脊椎動物以及多種鳥類對萊姆病均有易感性,其中鳥類的易感性導致萊姆病可進行遠距離傳播[18]。由于人類的生產、生活方式復雜多樣,所以人類也具有感染萊姆病的風險。

萊姆病是主要的病媒傳播疾病之一,蜱,特別是硬蜱是伯氏疏螺旋體的主要傳播媒介。蜱在吸食具有帶菌動物的血時被感染,當帶病原體的蜱叮咬宿主時,粘附在蜱蟲中腸的伯氏疏螺旋體移動到唾液腺,并隨其唾液進入宿主體內[19],因此,萊姆病的流行與蜱蟲的活動密切相關。首先,此病多發于能成為蜱棲息地的山區、林區以及牧區;其次,此病隨蜱蟲的生活、繁殖周期而具有明顯的季節性,常見于氣候溫暖的季節(5-11月)。

此外,有研究表明伯氏疏螺旋體可以從感染動物的尿液、血液和初乳中檢測到,所以萊姆病可能還存在包括接觸傳播、血液傳播等非生物媒介的傳播方式[8]。張德才等[20]從黑線姬胎鼠體內分離到伯氏疏螺旋體,完善了伯氏疏螺旋體在鼠體內的垂直傳播途徑,說明萊姆病可能會進行垂直傳播。有關人類胎盤感染的相關研究顯示,伯氏疏螺旋體可導致不良妊娠結局,例如胎兒早期死亡、流產或心功能不全[9]。目前,伯氏疏螺旋體引起牛、馬和鼠等動物的胎盤感染已經得到了證實[21]。因此,伯氏疏螺旋體還具有在人和動物宿主中垂直傳播的能力。

1.3 臨床癥狀 萊姆病是一種全身感染性、多器官炎癥性疾病[22],其臨床表現多樣,在人和不同患病動物種屬之間也有較大差異,常與心臟、皮膚、關節以及神經系統等組織器官有關。根據病程的不同,可將萊姆病分為早期感染和晚期感染?；颊咴缙诟腥竞?蜱蟲叮咬后3～30 d內),會發生局部皮膚感染,表現為局部游走性紅斑。數周或數月后會出現播散性感染,伯氏疏螺旋體會進行血源性播散,紅斑會慢慢擴散到全身以及表現出流感樣癥狀如輕微發熱、關節痛、肌痛、頭痛、淋巴結病。晚期感染或持續性感染則多在疾病發生1年以后開始。

游走性紅斑是人萊姆病的典型癥狀,但游走性紅斑在患病動物體表極為罕見,只在感染牛、馬等動物的體表偶有局部皮膚斑疹,以及偶發局部癥狀如蹄葉炎、跛行、關節疾病,全身癥狀有發熱、疲乏、精神沉郁、厭食等[23]。此外,伯氏疏螺旋體通過全身循環進入各器官或神經系統時,如心臟、腎臟、關節等處,就會在相應的器官組織中引起病變或神經癥狀的發生。例如,犬感染后可能表現出的癥狀有發熱、嗜睡、厭食、多發性關節炎以及腎功能紊亂和神經癥狀等[24]。馬屬動物可能因患各種骨病特別是關節移位、關節炎性腫脹等引起散發性跛行,孕馬感染后可發生流產、產弱仔或死胎[9]。

2 診斷與檢測技術進展

快速可靠的診斷對萊姆病患者的治療至關重要。臨床上萊姆病的診斷比較困難,因此就需要根據臨床綜合診斷以及先進的實驗室診斷技術來進行綜合診斷與鑒別。

2.1 萊姆病臨床綜合診斷 可依據萊姆病的流行病學特點和患者或患病動物的臨床癥狀等特點進行初步判斷,需明確患者或患病動物是否在發病前有過疫區生活史,是否有蜱暴露或叮咬史[25]?；疾游锍１憩F出的非典型癥狀主要有流感樣癥狀、神經癥狀、關節炎、風濕病癥狀等。

2.2 實驗室檢查 目前,關于萊姆病檢測可應用到的檢測技術主要有病原學診斷技術、血清學檢查技術、特異性基因檢測和生物標志物檢測4大類型,表1為萊姆病現有的部分實驗室檢測方法。

表1 萊姆病實驗室診斷方法Tab.1 Laboratory diagnostic methods for Lyme disease

2.2.1 病原學檢測 在萊姆病的實驗室診斷中,病原學檢測是最好的診斷依據,病原學檢測包括病原的分離培養和特異性基因檢測。

2.2.1.1 伯氏疏螺旋體的分離培養 用改良的Barbour-Stoenner-Kelly培養基進行直接檢測是萊姆病確診的金標準[26],是伯氏疏螺旋體感染的明確證據。但在診斷上很難做到及時準確,因為伯氏疏螺旋體的特性復雜,分離率低,生長較緩,培養周期長[27]。因此,通常只有在萊姆病的調查研究中才會采用病原體分離培養。

第1步:螺旋體培養。無菌收集宿主血液、腦脊液、滑液、尿液或初乳,在暗視野顯微鏡下觀察,采用BSK培養基和經過改良的KP培養基培養病原。

第2步:熒光檢查。標本經吖啶橙染色,8～12周培養后,在熒光顯微鏡下觀察,觀察到螺旋體生長即判斷為陽性。伯氏疏螺旋體屬革蘭氏陰性菌,姬姆薩染色呈藍色,長度為10～40 μm,寬度為0.2～0.3 μm[28]。

2.2.1.2 特異性基因檢測 目前,萊姆病的特異性基因檢測并不是標準化的,僅適用于根據患者或患病動物臨床癥狀和發病階段采集合適的病例樣本,如患病動物的皮膚紅斑組織、滑膜液、血液或者腦脊液等樣本,繼而進行伯氏疏螺旋體的特異性核酸片段擴增檢查。常規PCR、巢式PCR、實時熒光定量PCR等都是目前常用的核酸檢測方法[29-30]。需要注意的是,核酸檢測陽性結果必須通過特異性分子生物學檢測方法(如探針雜交,擴增測序)來進行分析確認。

2.2.2 血清學檢測 臨床上多采用萊姆病的血清學免疫診斷方法,目前國際上公認的萊姆病確診方法是血清學的“兩步法”,也被稱為標準兩級檢測法(Standard two tiered testing,STTT)。即首先采用酶聯免疫分析(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)或免疫熒光試驗(Immunofluorescence assay,IFA)進行初步篩查,如果初篩結果呈陽性,則再用蛋白免疫印跡法(Western blot,WB)進行確診[31]?！皟刹椒ā钡脑\斷特異性高,具體步驟如下:

第1步:ELISA法檢測血清或腦脊液中的特異性抗體。利用ELISA法檢測識別IgM和IgG抗體在早期感染患者或患病動物的血清或者腦脊液中的含量,該法具有方便、快速、設備儀器要求低、成本低等特點,可以用于診斷蜱蟲叮咬后伯氏疏螺旋體的感染情況。一般IgM抗體多在游走性紅斑發生后的14～28 d產生,42～56 d達到高峰,多于120～180 d內降至正常水平,并且使用抗生素進行治療后IgM抗體普遍更高。IgG抗體多在發病后42～56 d開始升高,晚期感染階段,也就是120～180 d時達到高峰,絕大多數患者都會產生高水平IgG抗體反應并可持續數年以上[32]。目前,針對動物血清流行病學調查,已有學者建立了萊姆病抗體檢測的間接ELISA方法[33],并用于動物臨床血清樣本檢測。

第2步:WB法檢測血清或腦脊液中的特異性抗體。相對于上述ELISA法,它具有更好的特異性,并且不僅可以確認初篩試驗的結果,還可以通過免疫反應辨別萊姆病的早期和晚期,用于經ELISA法初篩陽性或可疑陽性患者或患病動物的確診[34]。

2.2.3 生物標志物檢測 多項研究顯示,一些與宿主免疫反應有關的分子可作為萊姆病診斷的生物標志物。趨化因子和細胞因子是炎癥和免疫細胞調節的關鍵信號分子。其中,腦脊液中由抗原呈遞細胞產生的趨化因子CXCL13水平被認為是神經性萊姆病(Lyme neuroborreliosis,LNB)的潛在生物標志物,且臨床上已有通過檢測腦脊液中CXCL13水平來進行LNB早期診斷的病例[35]。此外,腦脊液中的CXCL13含量水平還被證實,當機體進行抗生素治療后,其含量會迅速下降,因此也可將CXCL13的濃度水平用以反映機體進行抗生素治療的監測[36]。

有學者指出,在機體急性感染萊姆病時,血清中CXCL9、CXCL10和C-C基序趨化因子配體19 (C-C motif chemokine ligand 19, CCL19)的濃度水平隨感染嚴重程度的升高而顯著升高,但在接受一些治療手段后其水平通常會降低[37]。由于常規血清學檢測方法存在多方面的局限性,這些趨化因子的開發將為診斷和了解萊姆病以及優化治療方案提供更多重要依據。當前,現有針對生物標志物的研究僅聚焦于人體感染萊姆病,針對動物感染萊姆病的生物標志物開發鮮有報道。為提高動物,特別是畜牧動物感染萊姆病的確診率,尋找動物感染萊姆病后的生物標志物亟待進行。

除了監測上述趨化因子的水平外,近年來,隨著相關組學研究的發展,代謝組學分析也逐漸被應用于尋找和確定可作為特定疾病狀態的生物標記或生物特征的分子[38]。生物系統的代謝活動受到包括感染在內的環境因素的強烈影響。因此,改變的代謝譜可以反映一種疾病狀態,并可用于開發診斷方法[39]。采用光譜法和液相/氣相色譜串聯質譜法對患者或患病動物的尿液、血液或腦脊液中的相關化合物進行鑒定,有助于萊姆病的早期診斷[40]。Molins等[41]通過采集萊姆病患者血清,使用液相色譜串聯質譜法篩選出了44種代謝分子特征,可有效診斷出萊姆病早期患者。盡管目前基于代謝組學手段檢測萊姆病的方法尚不完善,但其高效、靈敏的優勢使其有巨大潛力成為人或動物患萊姆病的早期診斷方法。

3 防治技術研究進展

3.1 疫苗 與許多細菌性疾病類似,人和動物由于缺乏對萊姆病的持久免疫力,可能會發生重復感染。因此,如果被感染的蜱蟲叮咬,人和動物宿主可能會多次患萊姆病。疫苗免疫是預防萊姆病最有效的方式,采用疫苗來阻斷伯氏疏螺旋體傳播的經驗逐年增加,并且也取得了重要進展,由于致病性伯氏疏螺旋體的種類較多,今后研制安全有效的多價亞單位混合疫苗仍是重要的研究方向。

目前研制的疫苗主要有全菌疫苗、DNA 疫苗、亞單位疫苗、病毒載體疫苗等。但有研究顯示,動物機體內的萊姆病疫苗的有效性會隨著外界因素的改變而改變[24],因此,當前獸用萊姆病疫苗的開發形勢依然十分嚴峻。

3.1.1 全菌疫苗 目前,美國已經批準了幾種以全菌疫苗為主的犬用萊姆病疫苗投入市場[9]。但是采用直接滅活菌體的方法研制成的全菌疫苗,含有多種未知的菌體蛋白,會使動物機體受到大量菌體蛋白的刺激,產生許多無法控制的副作用,同時干擾后續的診斷結果。

3.1.2 DNA疫苗 DNA疫苗系通過重組技術,可在體內可以表達的質粒載體中插入編碼誘導機體產生保護性免疫反應的外源性抗原的細菌 DNA 成分,再將含外源性 DNA 插入片段的載體 DNA 直接接種到機體,使其在體內表達,進而刺激機體的免疫系統產生具有特異性的保護抗體。早期的萊姆病疫苗會以基因工程的方式來構建DNA疫苗,但DNA疫苗會以潛在危害身體的方式在機體內不斷進行復制和增殖[31]。

3.1.3 OspA疫苗 使用伯氏疏螺旋體外膜蛋白A(OspA)免疫小鼠可誘導其產生長期的保護性免疫應答[47]。當蜱蟲叮咬免疫小鼠后,在抗OspA抗體存在的情況下,伯氏疏螺旋體在蜱蟲的中腸內就被殺死了[48]。在20世紀90年代有學者開發了兩種基于OspA的疫苗[49-50],并通過了人[51]和犬[52]的臨床試驗,于1988年獲得了美國食品和藥物管理局(food and drug administration,FDA)批準。這種疫苗雖然有效,但在接種疫苗后高抗體滴度持續時間短,且需要添加疫苗增強劑來維持抗體滴度。

此外,還有學者對幾種基于OspA的犬用疫苗進行了比較,結果表明:相比于兩劑抗原接種,3劑疫苗接種程序顯著提高了抗體應答反應[53]。但是,在一些萊姆病患病率的調查中推翻了這一研究結果,關于OspA疫苗的有效性仍需進一步研究。

3.1.4 OspB疫苗 伯氏疏螺旋體的外膜蛋白B(OspB)在其進入蜱蟲腸道定植時起關鍵作用[54],一些研究表明,接種OspB疫苗可引起動物宿主對伯氏疏螺旋體的保護性反應[55]。并且,一種針對OspB的特異性抗體可以不依賴補體而直接對伯氏疏螺旋體產生殺滅作用[56]。該抗體能夠破壞伯氏疏螺旋體的外膜,導致其發生滲透性溶解,引起不依賴于補體的殺菌抗體反應。加之硬蜱機體內有幾種具有補體抑制特性的蛋白質[57],即使在沒有功能性補體的情況下,非補體依賴性殺菌抗體也可殺死蜱體內的伯氏疏螺旋體。這表明基于OspB疫苗的研發是可行的。

3.1.5 OspC疫苗 伯氏疏螺旋體外膜蛋白C(OspC)一直是萊姆病常用的候選疫苗。OspC的合成是在蜱蟲吸食過程中誘導產生的。在早期感染過程中,宿主抗體介導的對OspC的免疫可以阻止同源伯氏疏螺旋體向宿主傳播[58],由于OspC類型的多樣性,這種保護是菌株特異性的。然而,在世界范圍內已經鑒定出30多個不同的OspC類型[69]。所以,基于OspC疫苗的研究已經從最初只包含單一多態位點發展到包含多個多態位點[60]。還有其他研究表明,OspC具有免疫優勢和潛在保護性的表位位于高突變區[60],這種結構具有較高的免疫原性,并且可以誘導、識別8種合并的OspC表位的特異性抗體以及與補體依賴的殺菌活性相關的抗體同型[55]。這些結果表明了根據OspC表位來開發具有廣泛保護性的多價嵌合疫苗是可行的。目前,由OspC表位嵌合蛋白(嵌合體)和OspA組成的用于預防犬萊姆病的雙抗原疫苗已經得到了美國農業部的批準許可[59]。

3.1.6 脂質免疫原 除伯氏疏螺旋體外膜蛋白外,作為伯氏疏螺旋體膜成分的糖脂也是有前景的候選疫苗。目前,已有學者研究了小鼠和人體內伯氏疏螺旋體糖脂的作用,結果表明它們具有免疫反應性[55]。但是對于伯氏疏螺旋體糖脂的抗體是否具有保護作用還不清楚,這些機制問題仍有待于更深入的研究。

3.1.7 突變活疫苗 減毒突變體活疫苗已被證實對多種傳染病均能達到有效免疫。在萊姆病感染方面,伯氏疏螺旋體的弱毒無鞭毛突變體和p66突變體可引起小鼠部分或完全保護性免疫[61],這些活突變體比失活的螺旋體更有效。但這種活突變體不能在哺乳動物宿主體內建立感染,所以這種方法不太可能用于哺乳動物上。不過,它可以用于識別一些具有保護效力的個體靶點,用于開發新的重組候選疫苗。此外,這些突變體還可以用于開發其他宿主的靶向疫苗或其他動物疫苗。

3.1.8 阻斷傳播疫苗 人們已經探索了減少蜱數量、減少蜱體內伯氏疏螺旋體含量和切斷傳播途徑的生態學方法。阻斷傳播疫苗包括針對宿主的疫苗和針對蜱的疫苗,開發阻斷傳播疫苗有希望降低萊姆病感染率。隨著人們對潛在萊姆病風險或暴露的生態流行病學理解的深入,將有效的阻斷傳播策略作為控制萊姆病感染率的公共衛生工具變得更為可行。目前,阻斷萊姆病傳播的研究主要是借助蜱蟲蛋白誘導蜱蟲免疫。

“蜱蟲免疫”是指蜱蟲在遭受幾次感染后無法成功進食的現象,Trager W于1939年首次描述了這一現象[62]。有學者利用伯氏疏螺旋體的傳播媒介(肩胛硬蜱)和其宿主(豚鼠)的模型證明[63],針對蜱吸食后24 h內表達的唾液蛋白免疫足以引起宿主的獲得性蜱免疫,阻止蜱攝食,阻斷伯氏疏螺旋體的傳播。此外,還有研究發現,人和動物在反復被蜱叮咬后會出現即刻和遲發性皮膚超敏反應,使其感染伯氏疏螺旋體的可能性降低[64]。

這些觀察結果進一步指出,蜱蟲蛋白可作為疫苗用于阻斷萊姆病的傳播。借助蜱蟲蛋白免疫,在蜱蟲叮咬部位和/或蜱蟲內部誘導免疫應答,阻止蜱蟲叮咬也是一種設計萊姆病疫苗的新方法。

萊姆病的傳染方式是非傳染性媒介傳播感染。公共衛生的目標是保護人群免受高度傳染性疾病的影響,接種萊姆病疫苗是個人的自主選擇,對有風險的人和動物來說是可取的。決定是否接種疫苗應基于科學依據,例如暴露在萊姆病流行地區的人和動物應廣泛接種疫苗以防止萊姆病傳播,反之則不需要接種。

3.2 治 療

3.2.1 蜱叮咬后的處理 由于包括伯氏疏螺旋體在內的大量病原體是經蜱蟲口器傳播,所以當動物宿主被蜱叮咬后,需將附著在皮膚上的蜱連同其口器一并去除,并且應在當地獸醫的指導下使用抗生素進行預防。

3.2.2 藥物 動物萊姆病目前還沒有進行藥物臨床試驗。針對患萊姆病的動物,用藥標準主要是參照人類臨床藥物試驗結果以及患萊姆病動物的藥物治療經驗而得出?？股仡愃幬锎蠖嗄馨l揮有效作用,使用抗生素對處于急性期的患病動物進行早期治療,對晚期并發癥的預防起到一定作用,并可迅速有效地改善動物臨床癥狀。不過要注意的是,針對動物使用抗生素要注意其年齡、既往病史、用藥史、生產周期等,例如對懷孕牛、乳牛不能用四環素,可改用頭孢菌素。

3.2.3 支持治療 抗生素的使用不能逆轉動物機體的實質性損傷,只能抑制或殺滅血液和組織中的伯氏疏螺旋體。對于患有發熱、皮膚損傷處疼痛癥狀的患病動物可以采用解熱鎮痛劑進行支持治療。

3.3 綜合性防控措施 優化環境衛生管理和加強專業知識普及是降低萊姆病感染率的重要措施之一。林場、牧場等工作、養殖場所應加強環境衛生管理措施,加強滅蜱工作,避免蜱蟲感染;林區工人、農民及放牧人員應提高防護意識,做好動物體外驅蟲工作,預防家畜經蜱蟲叮咬感染萊姆病;完善動物養殖生活場所的生物安全措施,定期進行清掃和消毒,對于已經感染的動物應立即隔離并進行抗生素治療等相應措施,以防傳染病進一步擴散。

4 展 望

萊姆病是重要的蜱媒傳染病之一,其發病率和疫源地在全球范圍內呈增長和擴大態勢,我國對萊姆病的防控仍處于初級階段,直到2019年才發布了第一個職業性萊姆病的診斷標準,然而對于動物萊姆病,有關部門尚未發布統一的診斷標準與防治措施。隨著人們生活水平的日益改善,寵物犬貓的飼養逐漸普及,牧區養殖也逐漸規?；?。由于動物主人對萊姆病的專業知識了解程度較低,有關部門對萊姆病的防治措施宣傳較少,導致該病的感染率和發病率日益增加。并且,隨著我國城市綠化、旅游業以及野外露營產業的不斷發展,人們親近自然、接觸自然的意愿不斷增強,普通居民感染萊姆病的潛在風險也在不斷增大?？紤]到萊姆病可能對人及動物造成的不良影響,必須通過多學科多部門的通力合作來加強此病的宣傳與教育。對于畜牧業相關從業人員必須提高動物萊姆病的防治與診斷能力,促進家畜產業的健康發展。

利益沖突：無