OmniLogTM微生物鑒定系統在青海高原野生型鼠疫噬菌體宿主譜檢測中的應用研究

李存香,祁芝珍,張青雯,趙海紅,馬 龍,游陪松,楊建國,吳海生,馮建萍

噬菌體是地球上最具生物多樣性的生命體,通常超過細菌密度的一個數量級[1]。作為細菌的病毒性捕食者,噬菌體在微生物進化、生態學、細菌性疾病預防和治療、細菌鑒定與疾病診斷等方面扮演著重要角色[2-3]。特定細菌的噬菌體總體上類似,即細菌能夠被噬菌體特異性裂解,其特異性主要源于噬菌體與其宿主菌細胞壁上特異性受體的相互識別與吸附[4],而差異性主要在于宿主的特異性范圍[5]。不同噬菌體的吸附方式和特異性分子生物學機制各異,但目的都是為了將其核酸注射到宿主菌中,持續循環侵染宿主菌[6]。鼠疫噬菌體作為鼠疫耶爾森菌的病毒,除了大多數在特定溫度下可以裂解多數的鼠疫菌株,還有部分噬菌體能裂解某些大腸埃希氏菌、假結核耶爾森菌、痢疾志賀氏桿菌和豬霍亂沙門氏菌等[7-9]。噬菌體宿主的定義和結果因檢測方法的不同而不同[10-11]。自然環境中分離噬菌體時,除了分離時所用的宿主菌,觀察它對其他近屬的菌株是否感染,都需要通過不同的培養方法來檢測。國內外噬菌體敏感性試驗常見的培養方法大致分為兩類:半固體培養法和液體檢測法。另外,各種微生物鑒定系統也已在微生物鑒定和代謝研究、微生物群落分析等方面被廣泛應用[12-13],其中國內外研究者曾利用OmniLogTM微生物鑒定系統間接評估了炭疽芽孢桿菌及其噬菌體抗性突變體分別與6株炭疽芽孢桿菌噬菌體/噬菌體雞尾酒/組合抗生素存在環境下的細菌生長動力學特點,利用Bioscreen C微生物生長分析儀測定了銅綠假單胞菌噬菌體的活性、蠟樣芽孢桿菌噬菌體的宿主譜,都具有較好的應用價值[14]。本研究團隊同樣基于OmniLogTM微生物鑒定系統建立了鼠疫噬菌體在微量液體培養基中的生長方法[15],同時利用該方法成功檢測了青海高原分離的3株野生型鼠疫噬菌體的宿主譜,為今后噬菌體生態學研究和基于宿主范圍噬菌體分類研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗菌株 鼠疫疫苗株EV76、614F和假結核耶爾森菌PTB3、PTB5、大腸桿菌V517、小腸結腸炎耶爾森菌52302-2由青海省地方病預防控制所鼠疫菌專業實驗室提供。

1.1.2 噬菌體 072204號鼠疫噬菌體分離自2019年青海省同德縣鼠疫疫源地喜馬拉雅旱獺盲腸樣本,效價為10-6,087號鼠疫噬菌體分離自2019年青海省天峻縣鼠疫疫源地喜馬拉雅旱獺盲腸樣本,效價為10-6,476號鼠疫噬菌體分離自2020年青海省天峻縣鼠疫疫源地喜馬拉雅旱獺盲腸樣本,效價為10-7。診斷用鼠疫噬菌體由青海省地方病預防控制所鼠疫菌專業實驗室提供。

1.1.3 儀器 恒溫培養箱、空氣浴振蕩培養箱和OmniLogTM微生物鑒定系統由青海省地方病預防控制所鼠疫菌專業實驗室提供。

1.1.4 培養基和試劑 LB液體培養基、LB固體培養基由青海省地方病預防控制所鼠疫菌專業實驗室培養基室制備。四唑類染液購自于美國OmniLog公司。

1.2 方 法

1.2.1 點滴法 取6個LB固體培養基分別劃分為6等份,每一等份接種1株復蘇的試驗菌株,共6株菌。分別取已制備的15 μL被檢噬菌體點滴于已接種的試驗菌株上,使其自然滲入培養基。每株噬菌體培養2個平皿,分別置于28 ℃和37 ℃恒溫培養箱,20～24 h后觀察噬菌斑。

1.2.2 基于OmniLogTM系統微量液體檢測法 第2至6列孔加入 90 μL LB 液體培養基。第1列孔中加入實驗用噬菌體,按照10倍梯度稀釋至第5列孔,第5列孔棄去10 μL噬菌體稀釋混合液,參照文獻[15]檢測3株野生型鼠疫噬菌體對2株鼠疫耶爾森菌(鼠疫疫苗株EV76、614F)和4株非鼠疫耶爾森菌(假結核耶爾森菌PTB3、PTB5、大腸桿菌V517、小腸結腸炎耶爾森菌52302-2)的裂解情況。

2 結 果

2.1 點滴法培養結果 通過點滴法檢測3株野生型鼠疫噬菌體的宿主譜,發現以鼠疫疫苗株EV76、614F為宿主菌,476號鼠疫噬菌體在28 ℃和37 ℃時瓊脂培養基上產生清晰的噬菌斑,072204號鼠疫噬菌體在28 ℃和37 ℃時均不能在瓊脂培養基上形成可見的斑塊,這并不意味著缺乏生產性感染(通過雙層瓊脂平板法經37 ℃時培養24 h可見不透明的斑)。087號鼠疫噬菌體在28 ℃時不能在瓊脂培養基上形成可見的斑塊,但37 ℃時在瓊脂培養基上形成可見的斑塊。以4株非鼠疫耶爾森菌擬為宿主菌,476號噬菌體對假結核耶爾森菌PTB5有裂解作用,對其他3株非鼠疫耶爾森菌不裂解。087號和072204號噬菌體對4株非鼠疫耶爾森菌均未發現有裂解現象。如圖1、圖2。

圖1 3株鼠疫噬菌體經點滴法28 ℃作用24 h的生長情況Fig.1 Plaque formation after interaction of three plague phages with six intestinal bacteria, determined with the micro spot method on semisolid medium at 28 ℃ for 24 h

2.2 OmniLogTM系統檢測結果 3株噬菌體經OmniLogTM系統檢測其宿主譜結果顯示,以鼠疫疫苗株EV76、614F為試驗菌,3個檢測板實驗組第1列生長曲線幾乎呈一條橫線,且細菌濃度對數值不超過100,后續每孔中根據不同噬菌體效價的降低,宿主菌依次呈現對應S型生長曲線;試驗孔中四唑類染料的顏色隨著噬菌體數量的減少和宿主菌數量的增多而逐漸加深,說明3株噬菌體均能夠感染2株鼠疫疫苗株。以假結核耶爾森菌PTB5為試驗菌,僅476號噬菌體實驗組第1列生長曲線幾乎呈一條橫線,且細菌濃度對數值不超過100,后續每孔中根據不同噬菌體效價的降低,宿主菌依次呈現對應的S型生長曲線,試驗孔中四唑類染料的顏色隨著噬菌體數量的減少和宿主菌數量的增多而逐漸加深;而087號和072204號噬菌體實驗組每一行的前5孔與細菌對照第6孔均呈現幾乎對應的相同S型曲線,且試驗孔中四唑類染料的顏色與對應對照孔列相近,說明476號噬菌體能感染假結核耶爾森菌PTB5,087號和072204號噬菌體不能感染假結核耶爾森菌PTB5。以假結核耶爾森菌PTB3、大腸桿菌V517、小腸結腸炎耶爾森菌52302-2為試驗菌,3個檢測板實驗組每一行前5孔與細菌對照第6孔均呈現幾乎對應的、相近的S型曲線,說明3株噬菌體不能感染假結核耶爾森菌PTB3、大腸桿菌V517、小腸結腸炎耶爾森菌52302-2。由此可見,上述檢測方法可以作為生物學特性之效價監測和宿主譜檢測的依據之一。如圖3、圖4、圖5。

注: A、B、C、D、E、F、G、H行分別代表鼠疫弱毒菌EV76、鼠疫弱毒菌614F、假結核耶爾森菌PTB3、假結核耶爾森菌PTB5、大腸桿菌V517、小腸結腸炎耶爾森菌52302-2、新鮮LB液體培養基、鼠疫噬菌體476。1、2、3、4、5列分別代表被測鼠疫噬菌體不同的稀釋梯度,6列代表對應排的菌株對照組。圖3 鼠疫噬菌體476與6株腸道菌株經OmniLogTM微生物鑒定系統33 ℃作用48 h后的生長情況Fig.3 Growth curves and chromatic graph for interactions of six intestinal bacteria with plague phage 476, determined with the OmniLogTM microbial identification system, at 33 ℃ for 48 h

注: A、B、C、D、E、F、G、H行分別代表鼠疫弱毒菌EV76、鼠疫弱毒菌614F、假結核耶爾森菌PTB3、假結核耶爾森菌PTB5、大腸桿菌V517、小腸結腸炎耶爾森菌52302-2、新鮮LB液體培養基、鼠疫噬菌體087。1、2、3、4、5列分別代表被測鼠疫噬菌體不同的稀釋梯度,6列代表對應排的菌株對照組。圖4 鼠疫噬菌體087與6株腸道菌株經OmniLogTM微生物鑒定系統33 ℃作用48 h后的生長情況Fig.4 Growth curves and chromatic graph of interactions of six intestinal bacteria with plague phage 087, determined with the OmniLogTM microbial identification system, at 33 ℃ for 48 h

注: A、B、C、D、E、F、G、H行分別代表鼠疫弱毒菌EV76、鼠疫弱毒菌614F、假結核耶爾森菌PTB3、假結核耶爾森菌PTB5、大腸桿菌V517、小腸結腸炎耶爾森菌52302-2、新鮮LB液體培養基、鼠疫噬菌體072204。1、2、3、4、5列分別代表被測鼠疫噬菌體不同的稀釋梯度,6列代表對應排的菌株對照組。圖5 鼠疫噬菌體072204與6株腸道菌株經OmniLogTM微生物鑒定系統33 ℃作用48 h后的生長情況Fig.5 Growth curves and chromatic graph of interactions of six intestinal bacteria with plague phage 072204, determined with the OmniLogTM microbial identification system, at 33 ℃ for 48 h

3 討 論

鼠疫耶爾森菌作為鼠疫的病原體,在生物進化處于有利的生活條件下表現為一般性適應,在不利的生活條件下表現為特異性適應[16]。鼠疫噬菌體作為鼠疫的細菌病毒,不同環境分離的噬菌體有相對于其分離地環境的生理特征。噬菌體的宿主范圍作為噬菌體的核心特征之一,它是指能成功感染宿主的分類多樣性[17],由整個感染周期中噬菌體和宿主之間的一系列分子相互作用決定的[18]。從微生態學方面來說,當鼠疫噬菌體有除鼠疫菌外的其它宿主菌存在時,鼠疫噬菌體可以不依賴鼠疫菌生長繁殖。噬菌體宿主譜的維持和改變促進了自然界微生物基因的多樣性和基因的交換[19]。雖然許多經過充分研究的噬菌體模型似乎顯示出較窄的宿主范圍,但近期的生態學和宏基因組學研究表明,噬菌體可能具有從窄到寬的特異性[18-19]。噬菌體與宿主菌相互作用的機制及其進化對于理解噬菌體生態學和噬菌體在臨床、工業和生物技術中的應用具有非常重要的意義[2]。

本研究采用點滴法檢測087號和072204號鼠疫噬菌體的宿主譜,結果顯示二者在28 ℃時不裂解鼠疫疫苗株EV76、614F,但在37 ℃時087號噬菌體點滴于固體培養基上顯示噬菌斑,072204號噬菌體點滴于固體培養基上不顯示噬菌斑,但在雙層瓊脂培養基上顯示不透明噬菌斑。由此可見,087號和072204號噬菌體培養生長時具有溫度依賴性。476號噬菌體的裂解譜結果顯示,在28 ℃和37 ℃時對鼠疫疫苗株EV76、614F、假結核耶爾森菌PTB5均裂解,即有明顯的噬菌斑?；贠mniLogTM微生物鑒定系統3株噬菌體經微量液體培養法33 ℃培養,生長曲線圖及其顯色圖發現476號、087號和072204號噬菌體僅對鼠疫疫苗株EV76、614F均裂解,且476號噬菌體對假結核耶爾森菌PTB5也裂解。由此可見,基于點滴法在遇到如37 ℃不能產生可見噬菌斑的072204號噬菌體時,不能及時判斷其是否存在裂解能力,而基于OmniLogTM檢測系統的微效價宿主范圍測定法不需要目視檢查噬菌斑塊,可以在單一試驗中提供噬菌體宿主范圍和毒力特性的信息。OmniLogTM檢測系統在整個試驗過程中實時、連續和自動化監測噬菌體感染細菌生長方面具有明顯的優勢?；贠mniLogTM檢測系統的噬菌體宿主范圍測定法可以作為一種替代傳統檢測宿主范圍的測定方法,能夠提供更多關于菌株間高分辨率的抑菌信息。另外,本研究利用OmniLogTM檢測系統監測3株鼠疫噬菌體對6株細菌的裂解能力時,發現476號噬菌體具有寬宿主譜特性,這不僅在自然界微生態學研究中具有重要意義,而且可能為人類抗細菌感染提供另一種選擇性治療的手段。

利益沖突：無