旋毛蟲免疫逃避機制的研究進展

錢艷紅,宋 帥,溫肖會,賈春玲,呂殿紅,袁子國,羅勝軍

旋毛蟲(Trichinellaspiralis)是一種專性胞內寄生線蟲,呈世界性分布,宿主范圍超過150種動物,包括哺乳動物、鳥類和爬行動物等[1]。旋毛蟲感染宿主后可引發旋毛蟲病,旋毛蟲病屬于人獸共患病,被列為世界第七大食源性寄生蟲病,也被我國列為二類動物疫病[2]。旋毛蟲可以感染多種動物,并主要通過豬肉及豬肉制品傳播給人類,旋毛蟲感染人以后,可引起人類腹痛腹瀉、發燒、肌肉絞痛,嚴重時引起腦炎導致人死亡[3]。2005-2008年,中國5個省份屠宰場屠宰的豬中旋毛蟲感染率高達5.75%[4]。2009-2020年,中國報告了8次人旋毛蟲病暴發事件,共479例,其中2例死亡[5]。因此,旋毛蟲感染不僅是一個嚴重的公共衛生問題,而且對養殖業和肉類食品安全構成威脅。

旋毛蟲生活史復雜,主要分為肌肉幼蟲(muscle larva,ML)、成蟲(adult Worm,AW)和新生幼蟲(newborn larva,NBL)3個時期[6]。如圖1所示,宿主通過攝入含ML包囊的生肉或未煮熟的肉感染旋毛蟲,含有ML的包囊在宿主胃蛋白酶的消化下釋放ML,ML進入宿主腸道,那里它們穿透腸粘膜并經歷4次蛻皮,發育成為AW(雄性或雌性),AW經交配產生NBL,NBL穿透腸壁,進入淋巴系統,并通過血流遷移到橫紋肌,最后NBL侵入橫紋肌細胞成熟為ML[7-8]。

圖1 旋毛蟲生活史及調節宿主免疫反應示意圖Fig.1 Schematic diagram of the life history and regulation of the host immune response of Trichinella spiralis

旋毛蟲感染宿主后可與其長期共存,根據宿主的壽命不同,旋毛蟲可在嚙齒類動物體內持續存在直至宿主死亡,在高等動物或人體內存在數月至數年[9]。旋毛蟲之所以能夠在宿主體內長期存活和持續感染,不被宿主清除,是因為它可以通過各種逃避機制成功躲避宿主免疫系統的攻擊[10]。因此,對旋毛蟲逃避宿主免疫機制的深入認識和了解,將為開發有效防治旋毛蟲的藥物和疫苗提供重要幫助和理論基礎。

1 抗原變異

抗原變異是指病原體不斷改變自身抗原,產生新的變異體,使宿主已產生的抗體不再起作用。按照來源部位的不同,旋毛蟲的抗原主要分為表面抗原、蟲體抗原和代謝分泌抗原[11]。旋毛蟲表面抗原分子是構成蟲體表面角質層的主要成分,可直接暴露于宿主的免疫系統,并在旋毛蟲的蛻皮和生長過程中發生變化。旋毛蟲蟲體抗原是蟲體死亡后的可溶性部分,主要來自于蟲體內部,不易被宿主識別[12]。旋毛蟲代謝分泌(excretory-secretory, ES)抗原是蟲體分泌到體外與宿主機體直接作用的抗原,參與生命周期中的多種功能[13]。旋毛蟲發育史復雜,為了逃避宿主免疫系統的識別,旋毛蟲AW、NBL和ML的表面抗原、蟲體抗原和代謝分泌抗原發生了不同程度的變異,這種抗原變異體現在相同抗原占比的改變以及不同新抗原的產生。如Liu JY等[14]將旋毛蟲AW、NBL和ML裂解物中的蛋白質通過同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技術進行鑒定,在所有發育階段共鑒定出4 691種蛋白質,在成對(NBL與AW、AW與ML及NBL與ML)比較中,共發現146種蛋白質差異表達,階段特異性蛋白質的數量在ML與NBL中最高(352種蛋白質),是NBL與AW(93種蛋白質)的3倍。旋毛蟲抗原的變異延緩了宿主清除免疫的進程,有利于蟲體逃避宿主的免疫攻擊。

2 調節宿主的免疫反應

旋毛蟲從感染到形成包囊前的整個過程是其能夠在宿主體內建立長期感染的關鍵。在此期間,旋毛蟲暴露于宿主免疫系統中,宿主將啟動各種免疫反應阻止旋毛蟲侵入機體并將其清除。為了逃避宿主免疫系統的攻擊,旋毛蟲通過ES抗原誘導T細胞極化、抑制樹突狀細胞成熟以及調節巨噬細胞表型以抑制宿主的抗寄生蟲免疫反應(圖1)。

2.1 誘導T細胞極化 在健康宿主免疫系統中,Th1/Th2免疫反應處于平衡狀態,調控機體免疫狀態和免疫水平,有利于宿主抵抗外來病原體入侵。旋毛蟲感染宿主后,能通過ES抗原調控宿主免疫系統,引發Th2反應為主的Th1/Th2混合免疫反應,使宿主免疫反應失衡,導致宿主免疫功能受到抑制,以逃避宿主的免疫攻擊,保護自身不被清除[15]。

旋毛蟲在腸感染階段,宿主以γ-干擾素(IFN-γ)、白細胞介素-2(IL-2)和白細胞介素-12(IL-12)增加為特征的Th1免疫應答反應為主,在此期間抑制Th1型免疫將為旋毛蟲AW的入侵、發育和幼蟲的產生提供充足的時間[16]。在NBL移行階段和ML包囊形成階段,宿主免疫反應轉變為Th2型免疫應答反應,并占主導地位,其特征是產生高水平的細胞因子IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13,以協調杯狀細胞增生、粘蛋白產生增加、平滑肌收縮力增強和上皮細胞周轉延長等上皮細胞反應,有助于減輕蟲體給宿主造成的組織損傷并加強組織修復,維持旋毛蟲在宿主體內的慢性感染[17-18]。Song Y等[19]采用MSD電化學發光檢測技術和流式細胞術檢測旋毛蟲感染小鼠的免疫細胞和細胞因子譜。脾臟MSD結果顯示,感染后6 h至6 d時Th1免疫受到抑制,6 d時Th2免疫應答水平顯著升高;腸系膜淋巴結在3 d至 6 d時表現出 Th1/Th2 混合免疫應答,Th1在6 d時呈下降趨勢;流式細胞術分析顯示,感染后6 h,Th1細胞比例顯著降低,Th2細胞比例明顯升高,這些結果表明旋毛蟲誘導宿主產生Th2型主導的免疫反應。Gao X等[20]對旋毛蟲ML衍生的細胞外囊泡蛋白(Ts-ML-EVs)進行蛋白組學鑒定,并用純化的TS-ML-EVs皮下注射免疫BALB/c小鼠,在用旋毛蟲感染后,檢測TS-ML-EV誘導的細胞和體液免疫應答,結果表明,TS-ML-EVs能誘導以Th2為主的Th1/Th2混合免疫應答。

2.2 抑制樹突狀細胞成熟 樹突狀細胞(dendritic cells,DC)屬于專職抗原遞呈細胞,主要功能是識別、捕獲、處理和向T細胞呈遞抗原[21]。根據分化狀態的不同,DC分為前體樹突狀細胞、 未成熟樹突狀細胞、 遷移期樹突狀細胞和成熟樹突狀細胞,只有成熟樹突狀細胞才能刺激初始T細胞活化,誘導宿主產生T細胞反應。在宿主免疫反應過程中,DC既是始動者也是協調者,它可以通過多種模式識別受體激活途徑引導免疫應答,這是適應性免疫應答產生和極化的基礎。DC上廣泛表達的模式識別受體(如Toll樣受體、NOD樣受體以及C型凝集素受體等)是寄生蟲與宿主相互作用的重要靶點。旋毛蟲感染宿主后,宿主DC細胞受到抗原的刺激分化為成熟樹突狀細胞,誘導宿主產生免疫反應將其清除。為了逃避宿主的免疫清除,旋毛蟲通過ES抗原與DC上的多種模式識別受體相互作用,影響DC表面共刺激分子或相關蛋白的表達,抑制部分DC成熟或完全成熟,阻止宿主初始T淋巴細胞正常增殖分化及誘導輔助性T淋巴細胞(Th)極化,為自己能夠長期感染宿主創造有利條件[22]。Jin X等[23]為了研究NOD樣受體蛋白3(NLRP3)在旋毛蟲感染觸發的免疫反應中的作用,用旋毛蟲肌幼蟲代謝分泌抗原(ML-ES)處理野生型(WT)小鼠和NLRP3基因敲除小鼠,檢測、評估相關實驗指標,研究結果證明ML-ES可以通過NLRP3調節DC表型,使表面CD40表達水平增加,并增強宿主Th2和Treg 反應。Gruden-Movsesijan A等[24]用旋毛蟲ML-ES處理大鼠骨髓來源的 DC(BMDC)和DA大鼠,并用ELISA和流式細胞術技術檢測DC表面共刺激分子及相關細胞因子的表達水平,結果表明ML-ES刺激的大鼠骨髓來源的樹突狀細胞(DC)不完全成熟,并在體外和體內誘導Th2反應。

2.3 調節巨噬細胞表型 巨噬細胞(Macrophages,Mφ)是組織中單核吞噬細胞的主要群體,屬于先天性細胞,它可以破壞病原體、清除凋亡細胞體并調節宿主免疫應答反應[25]。根據活化狀態不同通常將Mφ分為兩類:經典活化巨噬細胞(M1)和交替活化巨噬細胞(M2)[26]。其中M1型巨噬細胞具有促炎作用,能夠分泌高水平的TNF-α、IL-6及IL-1β等促炎細胞因子,參與抗原呈遞,介導Th1免疫應答,在抗病毒、抗菌和抗寄生蟲反應中非常重要[27]。相反,M2型巨噬細胞具有抑炎作用,可以被IL-4、IL-13、IL-10以及TGF-β誘導并表達豐富的甘露糖受體(CD206)、IL-1受體拮抗劑(IL1Ra)和精氨酸酶-1(arginase 1,Arg1),能限制過度炎癥,抑制Th1反應,有利于傷口愈合和組織修復[28]。

旋毛蟲感染宿主后在其體內發育并移行,從消化道進入淋巴系統,最后隨血液遷移至肌肉組織,整個移行過程造成了機體嚴重的炎癥反應和組織損傷,此時宿主巨噬細胞分化為M1型,M1型巨噬細胞分泌大量促炎因子,介導機體產生Th1免疫反應,以達到清除旋毛蟲的目的。旋毛蟲為了保護自身不被宿主清除,各階段幼蟲通過ES抗原作用于Mφ,控制Mφ分化。在腸道感染階段,AW進入腸道上皮產生NBL,此時M1型巨噬細胞能促進AW幼蟲從腸道上皮組織排出,有利于旋毛蟲感染;在移行階段和形成包囊階段,旋毛蟲NBL和ML則抑制M1型巨噬細胞細胞因子的產生,促進M2型巨噬細胞相關標志物的表達,調節Mφ表型向M2型極化,以抑制抗炎癥反應和Th1型免疫應答,促進損傷組織的愈合,從而逃避宿主免疫系統的清除。Sun Q等[29]用流式細胞術和免疫熒光技術檢測旋毛蟲感染小鼠在不同感染階段的不同組織中巨噬細胞激活的動態變化。結果顯示,旋毛蟲感染在腸內階段,巨噬細胞向M1表型極化,M1型巨噬細胞在這一時期的成蟲排出中發揮重要作用;但在NBL遷移和包囊形成階段,組織和免疫器官中的巨噬細胞以M2型被激活,其主要功能可能傾向于促進組織修復和協助旋毛蟲免疫逃逸。Wu J等[30]用旋毛蟲幼蟲衍生的細胞外小泡(EV)與宿主相互作用,結果發現旋毛蟲幼蟲衍生的EVs表達的miR-1-3p和let-7-5p,可以促進骨髓巨噬細胞向M2b型的極化。Kang SA等[31]用旋毛蟲ES抗原預處理骨髓源性巨噬細胞,并將其轉移到小鼠體內,以制備小鼠疾病模型,結果發現,旋毛蟲ES蛋白抑制M1型巨噬細胞(M1)中iNOS的表達,誘導M2型巨噬細胞極化。

3 免疫隔離

當寄生蟲寄生于宿主免疫系統相對隔離部位(如腦、眼、淋巴結)或侵入宿主細胞內(如紅細胞、巨噬細胞),使宿主不對寄生蟲產生免疫反應的現象叫做免疫隔離。在包囊形成階段,旋毛蟲NBL遷移到宿主肌肉組織中,并侵入肌肉細胞內,NBL在肌肉細胞內迅速生長發育,整個過程導致宿主肌肉細胞嚴重損傷,從而激活宿主衛星細胞(成肌細胞)。宿主成肌細胞在正常生理狀態下會增殖和再分化為新的肌肉細胞,修復肌肉組織損傷和凋亡。而旋毛蟲感染能夠抑制這一過程,使成肌細胞增殖、分化相互融合或與蟲體侵入的肌肉細胞融合形成另一種細胞—保姆細胞(nurse cell,NC)[32]。幼蟲“隱藏”在NC內,成為肌期幼蟲,以逃避宿主的免疫清除[33]。此外,由于旋毛蟲入侵肌肉細胞會誘導宿主肌肉細胞自噬,宿主細胞可以通過自噬清除寄生蟲[34]。自噬是一種基本的代謝過程,通過溶酶體系統降解非必需或功能失調的細胞成分或外源微生物,以實現細胞穩態和保護[35]。因此,在旋毛蟲ML期間,蟲體沒有完全處于靜息狀態,而是不斷向包囊周圍釋放ES抗原。ES抗原不斷刺激宿主的免疫系統與免疫活性以及細胞間的相互作用,上調或下調自噬相關因子,以逃避宿主的自噬清除,并為其在包囊內長期存活提供適宜的生存環境,實現對宿主長期的慢性感染 。郭琨等[36]以 C2C12 細胞系作為細胞模型,用不同濃度的旋毛蟲肌幼蟲粗提物(Trichinellaspiralismuscle larvae crude worm extract,TMCWE)刺激 C2C12 細胞,通過檢測 C2C12 細胞增殖分化相關因子及信號通路,在體外評估 TMCWE 對小鼠成肌細胞增殖與分化的影響,結果顯示TMCWE能直接或通過激活PI3K/AKT/NF-κB 信號通路促進成肌細胞增殖和分化以及干擾 NC 的形成。Hu X等[37]為了探究ML-ES抗原對成肌細胞自噬的影響,體外培養C2C12細胞建立成肌細胞模型,體內用不同劑量的旋毛蟲感染BALB/c小鼠,電鏡觀察旋毛蟲感染小鼠膈肌自噬體的產生,采用qPCR和Western blotting等技術檢測體內和體外自噬特異性標志物表達水平的變化。結果顯示,旋毛蟲感染誘導宿主肌肉細胞自噬,而旋毛蟲ML-ES抗原則能夠抑制成肌細胞的自噬。

4 結 語

作為我國生豬屠宰必檢項目之一,旋毛蟲病嚴重危害生豬的生長和發育,且很容易通過食物鏈進入人類體內,嚴重威脅人類健康和我國生豬養殖產業,而對于旋毛蟲免疫逃避機制的研究有利于阻斷旋毛蟲病的傳播及消滅旋毛蟲。因此,通過總結近年來國內外學者的相關研究,本文從抗原變異、免疫調節和免疫隔離3個方面簡述了旋毛蟲免疫逃避機制的研究進展,其中對旋毛蟲各階段異性抗原及免疫調節作用的研究較多,而對于免疫隔離逃避機制的相關研究則較少。目前市場上還沒有針對旋毛蟲病的特效藥,對于旋毛蟲病的治療,一般選用阿苯達唑和甲苯咪唑,但這類藥物對NC中的旋毛蟲ML不起作用,因此研究影響旋毛蟲形成免疫隔離的關鍵因子,對阻止包囊的形成,以及治療旋毛蟲病新藥物的研制都起到促進作用。

利益沖突：無