卵泡液外泌體miRNA對顆粒細胞糖酵解途徑介導多囊卵巢綜合征患者卵泡發育的影響及其作用機制

曹建平，張家寧，單會荃，劉宣，蘇杰，崔奎青

廣西大學動物科學技術學院亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧 530000

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是全球育齡女性常見的內分泌疾病，發病率高達10%，主要表現為卵泡發育不良、稀發排卵或無排卵、高雄激素血癥等［1］。PCOS 患者不孕率達70%，常伴隨2型糖尿病、肥胖、子宮內膜癌等，還廣泛存在抑郁、焦慮的情況，嚴重危害女性身心健康［2］。雖然PCOS 患者的臨床表征和生化指標具有極大異質性，但卵泡發育障礙仍是該病的典型特征，影響約10%的不育女性［3］。卵泡液（follicular fluid，FF）提供了卵泡發育的微環境，FF 的改變是卵泡發育障礙的主要原因。FF 內含包括外泌體在內的多種囊泡及分子物質，這些物質間的協調作用可促進卵泡發育和卵子成熟［4］。研究證明，FF中一些核酸和蛋白質與PCOS患者卵泡葡萄糖代謝、脂蛋白代謝、細胞增殖等過程密切相關［5］。因此，FF是PCOS患者卵泡發育障礙相關研究的重要切入點。外泌體可攜帶及轉運包括miRNA在內的非編碼RNA 和mRNA［6］，在多種體液或細胞培養基上清中穩定存在，且穩定性極強。研究證明，外泌體的RNA構成不同于其分泌細胞，但二者miRNA的表達卻高度相似［7］。在癌細胞中，外泌體miRNA是細胞間信息傳遞和信號交流的重要方式，可參與細胞遷移、細胞分化、免疫應答、抗原提呈、腫瘤侵襲等過程［8］。

能量是卵泡發育的首要條件，研究證明，PCOS患者常伴有葡萄糖代謝異常，顆粒細胞（granulosa cells，GCs）的糖酵解是卵泡發育的主要能量來源［9］，GCs的糖酵解產物乳酸是卵泡發育良好的環境刺激，GCs凋亡是PCOS 卵泡閉鎖的主要原因［10］。研究證明，FF外泌體主要由GCs分泌，可調節PCOS患者GCs的功能［11］。因此，探討FF外泌體miRNA 對GCs糖酵解途徑導致PCOS 患者卵泡發育的影響，對治療PCOS具有重要意義。目前，對GCs糖酵解調控因素的研究主要集中在內分泌激素、信號通路、非卵泡液miRNA等［12-14］，關于FF 外泌體miRNA 調控GCs 糖酵解的研究較少。本研究通過轉錄組學方法檢測PCOS 及非PCOS不孕患者FF外泌體miRNA的差異，以期為PCOS的治療提供潛在的新靶點。

1 材料與方法

1.1志愿者招募 于2020 年1— 6 月桂林醫學院附屬醫院生殖中心共招募6名接受體外受精-胚胎移植術（in vitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET）的志愿者，包括3名PCOS和3名非PCOS患者。經桂林醫學院附屬醫院倫理委員會批準（批準號：GLMUIA2019021），所有樣本均在患者知情同意后獲取。PCOS組納入標準：按《鹿特丹共識（2004）》定義PCOS組表型，確定PCOS組至少滿足以下2 種標準：①少排卵和／或無排卵（經期超過35 d或月經次數低于8次／年）；②高雄血癥體征（循環總睪酮升高超過45 ng／dL或患有多毛癥）；③卵巢形態超聲監測為卵泡超過12 個，但直徑均不超過9 mm的多囊特征。排除引起月經過少或體內高雄水平的其他發病原因，如遲發性腎上腺皮質增生和腎上腺雄激素分泌腫瘤。非PCOS組納入標準：卵巢形態及功能正常、規律的月經周期（26～35 d）、體內雄激素水平正常（＜45 ng／dL）、兩側的竇卵泡數為6～10個。共同排除標準：年齡超過35歲，卵巢囊腫及腫瘤、卵巢手術史或放化療史、子宮內膜異位癥、體內泌乳素過高、甲狀腺功能異常及染色體異常者；就診前半年內服用影響體內激素水平或影響糖脂代謝藥物者。

1.2藥物 人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，hCG）購自珠海麗珠制藥集團有限公司。

1.3主要試劑及儀器 QIAGEN exoEasy Maxi kit 購自德國QIAGEN公司；PBS購自生工生物工程（上海）股份有限公司；磷鎢酸購自山東西亞化學有限公司；Trizol試劑購自美國Thermo Fisher公司；HiScript ⅢRT SuperMix for qPCR 購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；NEBNext?Poly（A）mRNA Magnetic Isolation Module 購自英國New England Biolabs 公司；RiboZero Magnetic Gold Kit（Human／Mouse／Rat）、NEB Multiplex Small RNA Library Prep Set、TruSeq Rapid SR Cluster Kit及Illumina NextSeq 500 測序儀均購自美國Illumina公司；Agilent 2100 Bioanalyzer購自美國Agilent Technologies Inc。

1.4外泌體樣本的采集及鑒定 所有志愿者在促排卵前測定基線激素水平，于黃體期使用短效長方案促排卵，肌內注射hCG（2 000 U）觸發36 h后，穿刺取雙側直徑＞15 mm卵泡的無血清FF，1 500×g離心15 min，取上清，-80 ℃保存。采用QIAGEN exoEasy Maxi kit（超速離心法）提取FF中外泌體，用PBS（預先經0.2μm水相濾膜過濾）溶解外泌體，取20 μL，滴加至銅網上，用2%磷鎢酸（pH 5.0）負染60 s，置透射電鏡觀察外泌體形態。

1.5miRNA 測序 用Trizol試劑提取FF外泌體的總RNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop濃度測定儀檢測后，構建各樣品的文庫，用Agilent 2100 Bioanalyzer 測定其質量?；旌细鳂悠肺膸?，用0.1 mol／L NaOH 變性成單鏈DNA，在Illumina flow cell 上捕獲原位擴增簇（cluster），按說明書在Illumina NextSeq 500測序儀上進行循環測序，獲得的數據為raw sequencing data，經測序質控后，去掉Read 中接頭序列和過短序列產生的trimmed data，應用Bowtie 軟件將獲得的短序列與參考基因組GRCh38進行比對，將組內每百萬映射讀數（counts per million，CPM）均值≥1的RNA判為在分組中表達，并應用edge R語言包進行組間差異分析，以Fold Change ≥1.5（或≤0.67）且P＜0.05的標準篩選差異RNA并進行聚類分析。利用聚類Profiler R包進行差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）的GO 注釋分析和KEGG 路徑分析；應用Omnipath 數據庫對miRNA 進行互作分析。轉錄組測序由北?？党缮铮ㄉ虾＃┛萍加邢薰就瓿?。

1.6qPCR 檢測 根據GenBank 中登錄的基因序列，應用Oligo 6 軟件設計引物，引物序列見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。隨機抽取16個miRNA，采用Trizol 試劑提取所有外泌體樣本的RNA，經HiScriptⅢRT SuperMix for qPCR 試劑盒逆轉錄為cDNA，并以其為模板進行PCR擴增。PCR擴增條件為：95 ℃5 min；60 ℃10 s，95 ℃30 s，共40個循環；溶解曲線：65 ℃5 s，以0.5 ℃梯度遞增至95 ℃。以U6為內參，采用比較Ct法計算基因表達水平。

表1 qPCR檢測的引物序列信息Tab.1 Primer sequences for qPCR

1.7統計學分析 應用GraphPad Prism 8.0、IBM SPSS Statiatics 26或bioinformatics軟件（http：／／www.bioinformatics.com.cn／）進行數據分析，所有數據均以均數± 標準差（x±s）表示，組間及組內比較采用無配對檢驗或單因素方差分析，隨后采用Bonferroni事后檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1臨床表征差異 志愿者促排卵前基線激素水平檢測結果表明，PCOS組與非PCOS組志愿者的年齡、不孕年限、身體質量指數（body mass index，BMI）、促卵泡生成素（follicle-stimulating hormone，FSH）、催乳素（prolactin，PRL）、孕酮（progesterone，P）、空腹血糖等指標差異均無統計學意義（t=0.163 ～1.681，P均＞0.05），PCOS組的黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、抗繆勒管激素（anti-Mullerian hormone，AMH）、睪酮（testosterone）、竇卵泡數顯著高于非PCOS組（t=2.479 ～9.163，P均＜0.05），見圖1。表明納入的志愿者符合本研究的分組要求。

圖1 PCOS組與非PCOS組志愿者各項臨床指標的比值Fig. 1 Ratios of clinical indexes between PCOS group and non-PCOS group

2.2FF外泌體的鑒定 透射電鏡觀察結果顯示，2組FF 外泌體邊緣均清晰，中央淡染的杯口狀囊泡，直徑為100～150 nm，結構完整，符合外泌體特征，見圖2。外泌體濃度約為8×1010particles／mL。

圖2 FF外泌體形態的透射電鏡觀察Fig. 2 Transmission electron microscopy images of FF exosomes

2.3miRNA轉錄組差異分析 共獲得56 023 668個raw sequencing data，＞94.54%的堿基質量得分超過Q30，trimmed reads與參考基因組比對率約為60%，共發現928個miRNA。與非PCOS組比較，PCOS組外泌體中共篩選出59個差異miRNA（DEmiRNA），其中31個上調，28個下調，見圖3。為驗證轉錄組數據可靠性，隨機抽取16個miRNA 進行qPCR 檢測，結果表明，基因表達差異趨勢與miRNA 測序結果高度相似，證明miRNA 測序數據可靠，見表2。上述結果表明，與非PCOS組比較，PCOS組外泌體轉錄譜發生顯著改變。

圖3 差異表達miRNA的熱圖Fig.3 Heat map of differentially expressed miRNAs

表2 miRNA測序與qPCR檢測結果的對比Tab.2 Comparison of miRNA sequencing and qPCR results

2.4DEmiRNA 的GO 注釋分析及KEGG 路徑分析GO 注釋分析結果表明，與非PCOS 組比較，PCOS 組外泌體DEmiRNA 對糖酵解的負調節顯著上升，對葡萄糖的輸入和響應、蛋白激酶合成與活性、ATP 酶活性等與糖酵解和能量代謝有關過程的正調節均顯著下降，見圖4。KEGG路徑分析結果表明，在DEmiRNA調控的KEGG路徑中存在缺氧誘導因子-1、胰島素抵抗、卵母細胞減數分裂、壞死性凋亡等與細胞凋亡有關的顯著差異通路，見圖5。上述結果表明，在PCOS患者FF 外泌體中，通過miRNA 調控mRNA，可顯著改變GCs糖酵解效率和細胞凋亡狀態。

圖4 外泌體轉錄組DEmiRNA的GO注釋分析Fig. 4 GO annotation analysis of DEmiRNAs in exosomal transcriptome

圖5 外泌體轉錄組DEmiRNA的KEGG路徑分析Fig.5 KEGG pathway analysis of DEmiRNAs in exosomal transcriptome

2.5miRNA 候選靶基因調控網絡的生物信息 通過miRNA 互作網絡分析發現，PKM、PFKL、HK2是miRNA 調節GCs 糖酵解的關鍵靶基因，SLC2A1是miRNA調節GCs凋亡的關鍵靶基因，見圖6。這些關鍵靶基因構成了FF 外泌體miRNA 調控GCs 生物學過程的重要靶點。

圖6 miRNA的互作網絡分析Fig.6 Interaction network analysis of miRNAs

3 討論

本研究提取了2 組志愿者的FF 外泌體，并進行質量鑒定，外泌體轉錄組測序分析結果表明，PCOS患者FF外泌體miRNA可通過PKM、PFKL、HK2和SLC2A1等關鍵基因抑制GCs 糖酵解，并促進其凋亡，可減少糖酵解過程中產生ATP，降低終產物乳酸產量，最終造成卵泡發育障礙。

外泌體是經胞吐方式由組織或器官內各種細胞分泌的一種細胞外囊泡［15］，外泌體在透射電鏡下呈杯口狀，直徑為30～200 nm［16-17］，本研究對FF 外泌體的鑒定結果與上述一致。外泌體中含有大量miRNA等物質，miRNA 通過外泌體在細胞間轉移，從而發揮不同功能［18-19］。外泌體miRNA 在腫瘤發生發展中調節作用的相關研究較多，如乳腺癌細胞系釋放的外泌體miR-105可降低內皮細胞中zo-1基因的表達，從而促進腫瘤轉移［20-22］。本研究結果表明，外泌體miRNA可調控GCs攝取葡萄糖、糖酵解、蛋白激酶合成、ATP合成、細胞凋亡等生物學過程，這些生物學過程均與GCs 的糖酵解途徑密切相關。多項研究證明，外泌體miRNA 通過控制糖酵解關鍵酶的表達來調控瓦氏效應細胞糖酵解［23-25］，PCOS 患者的GCs 為一種瓦氏效應細胞，因此推斷，外泌體miRNA在GCs的糖酵解途徑中發揮重要作用。在PCOS中，FF外泌體miRNA可抑制GCs 的糖酵解關鍵酶活性，糖酵解整體水平下調，糖酵解過程ATP 產生減少，導致卵泡發育的能量供應不足，這是介導PCOS卵泡發育障礙的首要因素。糖酵解代謝產物乳酸水平是衡量瓦氏效應細胞代謝水平的標志［26］。研究發現，PCOS 患者的卵泡發育需要高濃度的乳酸刺激［27］。本研究結果表明，外泌體miRNA通過沉默GCs的糖酵解導致乳酸水平下降，減弱了卵泡發育的環境刺激，這是介導PCOS 卵泡發育障礙的另一重要因素。

PCOS 長期困擾女性的身心健康，卵泡發育障礙是PCOS 患者最顯著的特征，也是導致PCOS 患者不孕的重要因素。本研究揭示了FF 外泌體miRNA 調節GCs 糖酵解介導PCOS 卵泡發育障礙的機制，為PCOS 患者卵泡發育障礙的分子機制研究提供了實驗依據，也為該病的治療提供潛在的新靶點。