5個種屬血白蛋白多克隆抗體的制備及其效果評價

張建敏，周長明，李瀟，胡宇馳，王鐵松，趙璇

北京市藥品檢驗研究院國家藥品監督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室國家藥品監督管理局創新藥安全研究與評價重點實驗室，北京 102206

人血白蛋白（human serum albumin，HSA）是一種從健康人血中分離純化制成的血液制品［1］，是由585個氨基酸組成的單鏈非糖基化蛋白，含有17 個二硫鍵，呈球狀結構，相對分子質量約66 000，等電點為4.7～4.9。HSA常用于急救、感染、凝血障礙等危重患者的治療，SARS-CoV-2疫情流行期間推薦在COVID-19的診療方案中與靜注人免疫球蛋白聯合使用［2-4］。HSA的分離純化方法主要包括低溫乙醇沉淀法、層析法及兩種方法結合［5］，目前，我國已上市的HSA產品均采用低溫乙醇沉淀法生產。目前，HSA 的需求量極大［6-10］，供需矛盾突出［11］，且批簽發管理辦法規定血液制品均需法定檢驗機構進行檢驗及摘要審核，取得批簽發證書后才能上市［12］，申報數量大且呈逐年上升趨勢。近年，國家藥品監督管理局為加快緊急使用血液制品上市，對其實施同步批簽發政策，僅2020年上半年，HSA同比增長43.15%，這對企業質檢放行和檢驗機構的批簽發時限均是嚴峻的挑戰［11］。

《中國藥典》三部（2020版）及進口注冊標準均規定，采用免疫雙擴散法對HSA制品進行鑒別檢查［13］。該方法需使用中國食品藥品檢定研究院提供的抗血清鑒別試劑盒進行檢測。由于HSA檢測的需求量極大，抗血清鑒別試劑盒供應出現嚴重不足，無法滿足日益增長的檢測需求，另外，HSA 抗血清純度及特異性較低，較難應用于HSA 抗血清快檢方法的研發。本研究通過生物信息學方法篩選出人、牛、羊、豬、馬血白蛋白多肽抗原區域的特異性非同源表位，人工合成多肽，經免疫新西蘭大白兔獲得多克隆抗體［14］，并檢測其效價及特異性，以期為HSA 快速檢驗試劑盒的研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1樣品 HSA 購自山西康寶生物制品股份有限公司。

1.2主要試劑及儀器 鑰孔血藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、完全福氏佐劑（complete Freund′s adjuvant，CFA）、不完全福氏佐劑（incomplete Freund′s adjuvant，IFA）及氨基黑10B 均購自美國Sigma 公司；預染蛋白質marker購自美國Themo scientific公司；HRP標記的羊抗兔IgG（H+L）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；新生牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；Protein A 層析柱購自武漢金斯瑞生物科技有限公司；抗血漿鑒別試劑盒購自中國食品藥品檢定研究院；PVDF 膜（0.45 μm）購自德國Merck公司；Synergy Mix 酶標儀購自美國BioTek 公司；高效液相色譜儀購自日本島津公司。

1.3實驗動物 普通級新西蘭大白兔，雄性，9 周齡，體質量約2 kg，購自曲周縣超琦牧業有限公司，動物合格證號為：SYXK（京）2021-0067。本實驗對兔的所有處理均以科研為目的進行養殖和使用，按照動物倫理相關規定進行。

1.45個種屬血白蛋白多肽抗原設計及合成 在PubMed數據庫檢索人、牛、羊、豬、馬血白蛋白基因編碼的氨基酸序列，應用DNAstar 7.1 軟件進行生物信息學分析，篩選出一段包含14個氨基酸的多肽序列［4］，并采用固相化學法合成，高效液相色譜儀測定純度。將合成的多肽分別與載體蛋白KLH 進行偶聯，得到用于制備其多克隆抗體的5 個種屬血白蛋白多肽抗原，均由合肥國肽生物科技有限公司制備。

1.55 個種屬血白蛋白多克隆抗體的制備 分別取不同種屬血白蛋白多肽抗原約2 mg，用2 mL PBS 溶解，取抗原溶液0.5 mL，與CFA 按1∶1 的體積分數進行充分乳化，用相同方法將抗原與IFA 進行乳化。將5 種CFA 乳化抗原經新西蘭大白兔背部皮下多點免疫，200μg／（400μL·只），2 只／種；初次免疫后14 d，用IFA 乳化抗原進行加強免疫，免疫途徑同初次免疫，劑量減半；加強免疫后14 d，用IFA乳化抗原經新西蘭大白兔背部肌內多點免疫。末次免疫后7 d，經耳靜脈采血，分離血清，通過Protein A 親和層析柱純化后，獲得5個種屬血白蛋白的多克隆抗體。

1.65個種屬血白蛋白多克隆抗體效價的檢測 采用ELISA法。5個種屬血白蛋白多肽抗原均用PBS稀釋為4μg／mL，分別加入96孔板，100μL／孔，4 ℃包被過夜；用含3%脫脂奶粉的PBST于37 ℃封閉1 h；PBS洗滌5次，分別加入5種多克隆抗體（1∶10 000～1∶160 000稀釋），同時設陰性對照孔（未免疫的新西蘭大白兔血清）和空白對照孔（PBS），100μL／孔，37 ℃孵育1 h；PBS洗滌5次，加入HRP標記的羊抗兔IgG（H+L）（1∶1 500稀釋），100μL／孔，37 ℃孵育1 h；PBS洗滌5次，加入底物顯色劑，100μL／孔，37 ℃孵育15 min；加入終止液，50μL／孔，用酶標儀檢測A450。樣品孔A450≥陰性對照孔A450的2倍，且與陰性對照孔A450之差＞0.2時的最高稀釋倍數作為抗體效價。

1.75個種屬血白蛋白多克隆抗體特異性的檢測 采用Western blot法。分別取人、牛、羊、豬、馬血白蛋白（抗血漿鑒別試劑盒）25μL，經15%SDS-PAGE 分離后，轉移至PVDF 膜上，用含5%新生牛血清于4 ℃封閉過夜；分別加入5 個種屬多克隆抗體（均1∶2 000 稀釋），室溫孵育2 h；PBST 洗滌3 次，每次5 min，加入HRP 標記的羊抗兔IgG（H + L）（1∶500 稀釋），室溫孵育2 h；PBST洗滌3次，每次5 min；ECL法顯色。

1.85個種屬血白蛋白多克隆抗體的應用 取人、牛、羊、豬、馬血白蛋白（抗血漿鑒別試劑盒）1 mL，分別加入3 mL生理鹽水，搖勻；取1.5%瓊脂糖溶液50 mL，倒置（10×20）cm2玻璃板上，冷卻后打7個孔，共制備5塊板，每塊板中間孔分別加入5 種屬血白蛋白多克隆抗體，周圍5 孔均加入HSA 稀釋液，剩余1 孔分別加入HSA樣品及牛、羊、豬、馬血白蛋白稀釋液，20μL／孔，37 ℃孵育24 h；用0.9%生理鹽水充分浸泡瓊脂糖凝膠板，除去未結合蛋白質，置0.5%氨基黑10B 溶液中染色5 min，再用脫色液脫色至背景無色，沉淀線呈清晰藍色為止。

1.9數據采集及分析 應用Excel 2010 軟件進行數據采集及分析，Cytoscape軟件作圖。

2 結果

2.15 個種屬血白蛋白多肽抗原合成及純度 人工合成的人、牛、羊、豬、馬血白蛋白多肽片段的14 個氨基酸殘基序列見表1，高效液相色譜法鑒定其純度達91%以上，滿足用于動物免疫的要求。

表1 人、牛、羊、豬、馬血白蛋白氨基酸序列Tab.1 Amino acid sequences of serum albumin of human，cattle，sheep，pig and horse

2.25個種屬血白蛋白多克隆抗體的效價 人、牛、羊、豬、馬血白蛋白多克隆抗體的效價均為1∶160 000，見表2。

表2 ELISA 法檢測5個種屬血白蛋白多克隆抗體效價（1∶x）Tab.2 Detection of titers of polyclonal antibody of five species of serum albumin by ELISA（1∶x）

2.35個種屬血白蛋白多克隆抗體的特異性 人、牛、羊、豬、馬血白蛋白多克隆抗體均可與相應種屬血白蛋白發生特異性結合，且于相對分子質量約66 000處可見特異性結合條帶，見圖1。

圖1 Western blot法檢測多克隆抗體的特異性Fig. 1 Detection of specificity of polyclonal antibodies by Western blot

2.45個種屬血白蛋白多克隆抗體的應用 HSA僅與HSA 多克隆抗體產生沉淀線，與馬、牛、豬、羊血白蛋白多克隆抗體均不產生沉淀線，見圖2。

圖2 5個種屬血白蛋白多克隆抗體用于免疫雙擴散法檢測HSA的效果Fig.2 Effect of polyclonal antibodies against serum albumin of 5 species on detection of HSA by immuno-double-diffusion method

3 討論

HSA 的鑒別是采用免疫雙擴散法，其原理是于瓊脂糖凝膠上打孔，在相鄰兩孔內分別加入抗原、抗體，若其相互結合則會形成免疫復合物沉淀線，以此對供試品的特異性進行鑒別檢查［13］。目前，用于HSA 鑒別的試劑盒均由中國食品藥品檢定研究院提供，試劑盒中分別含有1.0 mL／支的人、豬、馬、牛、羊血白蛋白。由于HSA 申報批數逐年升高，審批量增速加快，建立高通量、大規模、快速、準確檢測方法已成為亟需解決的關鍵問題［15-16］。本研究通過生物信息學方法預測并人工合成耦聯KLH的人、牛、羊、豬、馬血白蛋白多肽片段，并以其為抗原，與佐劑混合后免疫大白兔，制備相應的多克隆抗體［17-18］。該方法通過刺激網狀內皮系統，增加免疫活性細胞，促進T細胞與B 細胞的相互作用，進而增強抗體的產生，可實現高通量制備抗體。與傳統原核表達目的蛋白制備的抗原比較，人工合成多肽的純度更高，操作更簡便，且獲得的抗體特異性更強，靈敏度更高，耗時更短［19］。Western blot特異性檢測及免疫雙擴散的鑒別試驗表明，本研究制備的多個種屬多克隆抗體具有良好的特異性，且制備過程簡單快速，適合大量生產，可用于HSA鑒別試劑盒的制備。

為提高監管部門打擊假冒偽劣HSA 的能力，急需一種快速、簡單、高通量的HSA檢測方法［15］。本研究制備的多個種屬多克隆抗體純度高、特異性強，用其制備的HSA 鑒別試劑盒也可用于HSA 真偽的快速檢測。今后本課題組還將對制備的多克隆抗體進行HRP 及膠體金標記，以期用于HSA 的質量控制和快速鑒別檢驗工作。