組分百日咳抗原中間品中內毒素含量動態顯色定量檢測方法的建立及驗證

趙明，劉婷，馬昱，吳麗潔，付慧，李世慧

北京生物制品研究所有限責任公司，北京 100176

百日咳是由百日咳桿菌引起的呼吸系統疾病，癥狀為長久的陣發性咳嗽，會導致嚴重的肺損傷，甚至危及生命，是兒童最常見的傳染病之一［1-2］。我國在1995 年成功研制出無細胞百白破聯合疫苗（diphtheria，tetanus and acellular pertussis combined vaccine，DTaP）［3］，目前研制的吸附無細胞百（三組分）白破聯合疫苗是DTaP 的更新換代，由百日咳類毒素（pertussis toxin，PT）、絲狀血凝素（filamentous hemagglutinin，FHA）和百日咳黏附素（pertactin，PRN）抗原組成，經發酵、純化［4］、脫毒、吸附后制備成原液，進而配制成疫苗。百日咳抗原中間品脫毒后，抗原在后續的原液吸附及半成品配制過程中不再經過去除內毒素的步驟，因此脫毒后抗原中細菌內毒素含量的高低直接影響最終疫苗成品中內毒素的含量。疫苗中內毒素含量較高時，注射進入人體內易引起發熱、微循環障礙、內毒素休克及播散性血管內凝血等副反應［5-6］，因此，建立一種靈敏度更高、能夠定量檢測組分百日咳抗原中間品中內毒素含量的方法，對于吸附無細胞百（三組分）白破聯合疫苗生產過程中內毒素含量的質量控制至關重要。

《中國藥典》三部（2020 版）＜1143 細菌內毒素檢查法＞中的內毒素檢測方法有凝膠法和光度測定法，凝膠法分為凝膠限度試驗和凝膠半定量試驗，光度測定法分為濁度法和顯色基質法，顯色基質法根據檢測原理又分為終點顯色法和動態顯色法［7］。目前組分百日咳抗原中間品內毒素含量的檢測方法為凝膠法之一的凝膠限度試驗，通過將待測樣品進行適宜倍數的稀釋后進行檢測，從而判斷供試品的內毒素含量是否高于限值，該方法的弊端是不能準確測定出其具體含量，不利于進行中間品內毒素含量的過程控制以及成品吸附無細胞百（三組分）白破聯合疫苗的質量控制。動態顯色法是一種檢測反應混合物的吸光度或透光率達到某一預先設定的檢測值所需要反應時間或檢測值增加速度的方法［7］，已在食品、注射用水、血液等細菌內毒素檢測的研究中廣泛應用［8-12］，但較少應用于生物制品中。該方法的優勢在于其鱟試劑只需根據顯色反應即可定量檢測內毒素，準確度高、檢測范圍廣，無需蛋白原凝固，抗干擾能力強，特別適用于生物樣本的檢測［13-15］。吸附無細胞百（三組分）白破聯合疫苗的組分百日咳抗原中間品的內毒素檢定尚未采用此方法。

本研究旨在建立動態顯色法檢測吸附無細胞百（三組分）白破聯合疫苗的組分百日咳抗原中間品脫毒后內毒素含量，并進行驗證，以期更好地對組分百白破疫苗進行質量控制。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 脫毒后的組分百日咳抗原中間品PT、FHA 和PRN 由北京生物制品研究所有限責任公司提供；Pyros Kinetix?Flex 96（PKF 96）細菌內毒素定量檢測系統、動態顯色法美洲鱟試劑（LAL，批號：2042103，靈敏度λ = 0.001 EU／mL）、葡聚糖抑制緩沖液（批號：1207080，規格：5 mL／瓶）、細菌內毒素工作標準品［（control standard endotoxin，CSE），批號：249035，規格：10 ng／瓶，10 EU／ng］、無熱原水［（LAL reagent water，LRW），批號：AF29565799，規格：50 mL／瓶］、硼硅酸鹽玻璃反應試管（8 mm×75 mm）和硼硅酸鹽玻璃稀釋試管（12 mm × 75 mm）均購自美國Associates of Cape Cod 公司。

1.2溶液的配制

1.2.1鱟試劑溶液 取葡聚糖抑制緩沖液3.2 mL，滴加至裝有LAL 干粉的Pyrochrome?小瓶中，LAL 干粉在幾分鐘后進入溶解狀態，完成復溶。在試驗過程中按照樣品體積0.2 mL，添加0.05 mL的鱟試劑。

1.2.2標準曲線溶液根據Cape Cod 公司的動態顯色法細菌內毒素工作標準品標準化COA 文件制備50 EU／mL 的標準品貯備液：用2 mL 無熱原水溶解1 瓶內毒素標準品（10 ng／瓶，10 EU／ng），充分振蕩1 min，制成濃度為50 EU／mL 的標準品貯備液。用無熱原水將50 EU／mL的內毒素標準品貯備液稀釋成濃度為5、0.5、0.05、0.005 EU／mL 的標準品工作溶液。

1.2.3供試品溶液 將脫毒后PT、FHA、PRN分別添加無熱原水，稀釋不同倍數，PT：10、100、1 000倍；FHA：3 000、5 000、10 000倍；PRN：50、75、100倍。

1.2.4陽性對照溶液 取1.2.3 項制備的供試品溶液各0.9 mL，與0.1 mL 5 EU／mL 內毒素標準品溶液混合，作為供試品陽性對照。

1.3方法的建立分別取制備的標準曲線溶液、供試品溶液和陽性對照溶液200 μL 至硼硅酸鹽玻璃反應試管中，以無熱原水作為陰性對照。在Pyros?EQS v1.2檢測軟件上編輯檢測序列，向每個反應試管滴加50 μL 鱟試劑溶液，振蕩混合3 ～5 s，快速放入儀器內檢測。待序列全部顯示檢測完成后，停止數據采集。軟件自動計算供試品檢測值、回收率［（陽性對照溶液內毒素濃度-供試品溶液內毒素濃度）／0.5×100%］和變異系數（CV）。

1.4方法的驗證

根據《中國藥典》三部（2020 版）＜9101 分析方法驗證指導原則＞的相關要求，對百日咳抗原中間品中內毒素含量動態顯色測定方法進行線性、專屬性、準確性、精密性驗證。試驗采用0.005 ～5 EU／mL標準曲線計算供試品溶液內毒素含量。

1.4.1線性范圍 對0.005 ～5 EU／mL 4個濃度的標準品工作溶液進行線性驗證，以內毒素濃度為橫坐標，反應時間的對數為縱坐標繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程，結果應呈現為線性相關系數的絕對值（|r|）≥0.98，CV＜20%，各濃度的標準品工作溶液回收率在80%～120%之間，陰性對照的反應時間小于0.005 EU／mL標準品溶液的反應時間。試驗重復3次。

1.4.2專屬性 先按下式確定最大有效稀釋倍數（maximum valid dilute double，MVD）。

式中L 為脫毒后百日咳抗原中間品中細菌內毒素限值（檢測濃度／蛋白質濃度= 500 EU／mg），λ為標準曲線最低濃度（0.005 EU／mL），c 為百日咳抗原中間品的蛋白質濃度（mg／mL）。

選擇標準曲線中靠近中點的濃度（0.5 EU／mL）作為加標濃度（λm），取3 種不同稀釋倍數的供試品0.9 mL，與5 EU／mL 內毒素標準品溶液0.1 mL 混合作為供試品陽性對照，無熱原水為空白對照，進行干擾試驗，計算回收率。

1.4.3準確性 確定脫毒后PT、FHA、PRN的無干擾濃度后，選擇其中1個濃度用無熱原水稀釋（PT 100倍、FHA 10 000倍、PRN 50倍），各取0.9 mL，與5 EU／mL內毒素標準品溶液0.1 mL 混合作為供試品陽性對照，按確定的方法操作，每個樣品重復檢測6次，計算回收率（應在50%～200%之間），驗證方法的準確性。

1.4.4精密性

1.4.4.1重復性 取脫毒后PT、FHA、PRN，分別用無熱原水稀釋100、10 000、50 倍后，各取0.9 mL，與5 EU／mL 內毒素標準品溶液0.1 mL 混合作為供試品陽性對照，按確定的方法操作，每個樣品重復檢測6次，計算CV（應＜20%）。

1.4.4.2中間精密度 按上述方法制備供試品溶液及陽性對照，由不同操作人員于不同時間分別測定3次，計算CV。

1.5動態顯色法定量檢測與凝膠法檢測結果的對比選取經凝膠法測定合格的脫毒后PT、FHA、PRN 各3批，分別用無熱原水稀釋100、10 000、50倍后，采用動態顯色法檢測內毒素含量，檢測結果應小于脫毒后百日咳抗原中間品中細菌內毒素限值（500 EU／mg蛋白），且回收率應在50%～200%之間。

1.6數據采集及分析 脫毒后PT、FHA、PRN 稀釋后作為供試品溶液，放入細菌內毒素定量檢測系統中檢測，使用Pyros?EQS v1.2 軟件編輯序列，并進行數據采集及分析。

2 結果

2.1方法的驗證

2.1.1線性范圍 用無熱原水稀釋標準品溶液后，得到標準曲線的|r|均大于0.99，每個標準品濃度對應的回收率均在90%～115%之間，CV均小于6%，見表1。表明該方法在0.005 ～5 EU／mL 范圍內線性良好。

表1 線性范圍驗證結果Tab.1 Linear range verification results

2.1.2專屬性 各供試品稀釋對應的濃度回收率均在90%～120%之間，符合標準，見表2。表明百日咳抗原中間品脫毒后PT、FHA、PRN在對應稀釋倍數下對細菌內毒素的含量檢測無干擾，專屬性良好。

表2 干擾試驗結果Tab.2 Interference test results

2.1.3準確性 脫毒后PT、FHA、PRN 測定結果的回收率分別為125%、110%、99%，均符合可接受標準，見表3。表明該方法準確性良好。

表3 準確性和重復性驗證結果Tab.3 Accuracy and reproducibility verification results

2.1.4精密性 重復性驗證脫毒后PT、FHA、PRN 測定結果的CV分別為7.21%、8.31%和5.84%，均小于20%，符合可接受標準，見表3，表明該方法重復性較好；中間精密度驗證脫毒后PT、FHA、PRN 測定結果的CV分別為6.04%、16.29%和12.23%，符合可接受標準，見表4，表明該方法中間精密度較好。

表4 中間精密度驗證結果Tab.4 Intermediate precision verification results

2.2動態顯色法定量檢測與凝膠法檢測結果的對比采用動態顯色法檢測脫毒后PT、FHA、PRN供試品各3批的行內毒素含量，結果均小于脫毒后百日咳抗原中間品中細菌內毒素限值，且回收率在50%～200%之間，見表5，兩種方法檢測結果一致。

表5 動態顯色法定量檢測結果Tab.5 Quantitative detection results of kinetic chromogenic assay

3 討論

細菌內毒素檢查法已在一些領域中應用與研究［16-19］，其中的光度測定法作為能夠定量檢測細菌內毒素含量的方法，已逐步應用于生物制品的內毒素檢測研究［20-24］。光度測定法中的動態顯色法具有能夠定量、靈敏度高等優勢，只需根據顯色反應即能快速定量檢測內毒素，靈敏度高達0.001 EU／mL，檢測范圍廣，與鱟試劑配套的葡聚糖抑制緩沖液能有效消除干擾因素，操作簡便［25］。因此，本研究建立了動態顯色法檢測百日咳抗原中間品的內毒素含量，并對該方法進行了驗證，結果顯示，在0.005 ～5 EU／mL范圍內得到的標準曲線|r|均大于0.98，每個標準品濃度對應的回收率均在90% ～115%之間，CV均小于6%，表明該方法線性較好；脫毒后PT 稀釋倍數為10、100、1 000，FHA稀釋倍數為3 000、5 000、10 000，PRN稀釋倍數為50、75、100，對細菌內毒素含量檢測均無干擾作用；準確性和精密性驗證結果均符合可接受標準。采用動態顯色法對3 批脫毒后PT、FHA、PRN 進行細菌內毒素定量檢測，其結果與凝膠法檢測的同批供試品結果一致，證明該方法可行。

目前組分百日咳抗原中間品內毒素含量檢測應用的是凝膠法，該方法不能準確定量，只能判斷內毒素含量是否高于限值，不利于進行中間品內毒素含量的過程控制。本研究采用動態顯色法檢測組分百日咳抗原中間品脫毒后樣品中的內毒素含量，能夠進行定量，且方法具有良好的線性、專屬性、精密性，檢測靈敏、準確性高、范圍廣，與凝膠法相比，不僅能夠判斷結果是否合格，還能定量，且克服了凝膠法的主觀判斷因素，動態顯色法也能應用于發酵、純化、中間品及成品中百日咳抗原生產全過程的內毒素含量測定。建立的組分百日咳抗原中間品中內毒素含量定量檢測方法，對組分百白破疫苗中間品生產的過程控制及成品的質量控制至關重要。