重組人白細胞介素-1受體拮抗劑免疫大鼠ELISA抗體陽性血清中和抗體活性檢測方法的建立及驗證

彭炳淮，劉景會，劉玉林，孫中濤，孫基偉，梁冠橋，俞露

長春生物制品研究所有限責任公司，吉林長春 130062

重組人白細胞介素-1 受體拮抗劑（recombinant human interleukin-1 receptor antagonist，rhIL-1Ra）可與IL-1 特異性結合，抑制IL-1 介導的各種炎性反應［1］。重組蛋白類藥物在臨床應用過程中需多次、長時間給藥，可誘發免疫應答，產生中和抗體，影響藥物的有效性［2-4］，甚至可改變藥物的藥代動力學和藥效學特性［5］。因此，對中和抗體的檢測和分析是了解患者潛在免疫反應的有效方法［6］。在重組蛋白臨床前研究階段的動物安全評價中，動物血清中和抗體與重組蛋白活性位點的相互作用可干擾藥物的活性和生物學功能，進而影響藥物的毒理學研究［7-8］。因此，需要開發有效方法用于檢測重組蛋白重復給藥動物血清中的中和抗體。

抗體的檢測方法包括ELISA 法、乳膠微球雙色免疫層析法、快速側流檢測法、高通量成像細胞術等［9-12］，但生物學活性試驗可更直觀地反映抗體對藥物藥效的抑制作用［13］。本研究以SD 大鼠為研究對象，采用基于D10G4·1 細胞的生物學活性試驗對經ELISA 篩選為rhIL-1Ra 抗體陽性血清進行中和抗體活性確證，并對驗證方法的專屬性、靈敏度及精密性，以期建立一種靈敏、高效的用于rhIL-1Ra 重復免疫大鼠血清中和抗體檢測的方法。

1 材料與方法

1.1細胞 D10G4·1 細胞購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2主要試劑及儀器 rhIL-1Ra 標準品購自上海百邁博制藥有限公司；rhIL-1Ra 注射劑、rhIL-2、兔抗rIFN-2b 單抗、兔抗rhIL-1Ra 單抗均由長春生物制品研究所有限責任公司提供；RPMI1640 培養基購自美國Gibco 公司；胎牛血清購自浙江天航生物科技公司；IL-1β 購自美國R&D 公司；β-巰基乙醇購自美國Sigma 公司；其他試劑均為國產分析純；Protein A 層析柱購自博格隆生物技術有限公司；熒光素酶檢測系統購自美國Promega 公司；96 孔帶蓋透明細胞培養板購自美國Corning 公司；96 孔白色底透酶標板購自上海晶安生物科技有限公司。

1.3實驗動物 SPF級SD大鼠，12 ～13日齡，體質量20～36 g，共440 只，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物質量合格證號為：11001-1211109385542、11001121107563746、11001121110-8684445。本實驗均以科研為目的進行動物的養殖和使用，并獲得北京市科學技術委員會批準［文件號為：SYXK（京）2019-0006］。

1.4細胞培養 將D10G4·1 細胞用完全培養基（含10%胎牛血清、100 U rhIL-2、0.05 mmol／L β-巰基乙醇、100μg／mL Hygromycin B 的RPMI1640），于37 ℃培養至融合度達80%，按1∶3的比例進行細胞傳代，2 d后選擇對數生長期細胞用于后續試驗。

1.5陽性血清的篩選 采用ELISA 法。將rhIL-1Ra注射液分別按3、20、100 mg／kg經皮下注射SD 大鼠（低、中、高劑量組），同時設空白對照組（不給藥），每組10 只，雌雄各半，每天給藥2 次，間隔至少4 h，連續給藥13 周。于給藥2 周（D15）、4 周（D29）、8 周（D57）、13周（D92）及恢復期2 周（D106）、恢復期結束（D120）時，經大鼠頸靜脈采血，分離血清，送北京昭衍新藥研究中心股份有限公司采用ELISA 法檢測抗體滴度，將篩選的陽性抗體血清樣本經13 201×g離心30 min，取上清，經Protein A層析柱純化，用PBS調節pH為7.0～7.5，濃縮至初始體積，于-80 ℃保存。

1.6中和抗體活性檢測方法的建立 采用D10G4·1細胞生物學活性試驗。將濃度為2μg／mL的rhIL-1Ra注射劑及rhIL-1Ra標準品（以20μg／mL為起始濃度，進行4 倍系列稀釋，共8 個稀釋度）加入96 孔帶蓋透明細胞培養板，30 μL／孔，再加入等體積分數的血清，同時設細胞對照（完全培養基）、PBS 對照（僅含PBS）、陰性對照（僅含血清）、陽性對照（4μg／mL的兔抗rhIL-1Ra單抗）、rhIL-1Ra對照（5μg／mL的rhIL-1Ra注射劑），60μL／孔，于37 ℃，5%CO2細胞培養箱孵育1 h；各孔樣品取50μL，轉移至96孔白色底透酶標板。調節對數生長期D10G4·1 細胞濃度至（2.0～2.5）×105個／mL，加入IL-1β至終濃度為3 ng／mL，混勻，同時設無IL-1β的空白對照，100μL／孔，37 ℃，5%CO2細胞培養箱培養20～24 h；加入熒光素底物，80μL／孔，避光振蕩2 min，用酶標儀測定熒光值（RLU）。以rhIL-1Ra 標準品濃度為橫坐標，RLU為縱坐標繪制標準曲線。陰性對照與1μg／mL rhIL-1Ra標準品RLU偏差應≤20%；無IL-1β 的細胞對照組應與陰性對照一致，有IL-1β的細胞對照及PBS對照RLU與rhIL-1Ra標準品第8個稀釋孔RLU的均值偏差應≤20%；rhIL-1Ra對照與rhIL-1Ra 標準品第1 個稀釋孔RLU 的均值偏差應≤20%。滿足上述條件判定試驗成立。以陰性對照組RLU 的均值作為陰陽性判定臨界值，若高于臨界值，判為中和反應呈陽性，即對應血清樣本中含有rhIL-1Ra中和抗體。

1.7方法的驗證

1.7.1專屬性分別取兔抗rIFN-2b單抗（4μg／mL）及其與rhIL-1Ra標準品（20μg／mL）混合物（37 ℃孵育1 h），另取兔抗rhIL-1Ra單抗，按1.6項方法檢測，并與rhIL-1Ra標準品的四參數回歸曲線進行對比。

1.7.2靈敏度將兔抗rhIL-1Ra 單抗稀釋為12 000、2 400、1 200、800、600、480、400、342.86 μg／mL，分別與濃度為2μg／mL 的rhIL-1Ra 標準品進行孵育，每個濃度設8個復孔，按1.6項方法進行檢測。以抗體濃度對數為橫坐標，RLU 均值對數為縱坐標，建立四參數回歸曲線，獲得回歸方程。將濃度為1μg／mL rhIL-1Ra標準品的RLU 作為臨界值代入回歸方程，得到的陽性抗體濃度即為方法靈敏度。

1.7.3精密性 將兔抗rhIL-1Ra 單抗稀釋為1 200、600、300μg／mL，分別與濃度為2μg／mL的rhIL-1Ra標準品進行孵育，按1.6項方法進行檢測，每個濃度設5個復孔，由2名實驗人員于3 d進行3次重復檢測，計算每名實驗員重復檢測3次RLU的CV及2名實驗員對每個濃度重復檢測6次RLU的CV，CV均應≤20%。

1.8方法的應用 采用建立的方法檢測經ELISA 篩選為rhIL-1Ra抗體陽性大鼠血清的中和抗體，同時設陰性對照（未免疫小鼠血清）及陽性對照（兔抗rhIL-1Ra單抗），并按下式計算抗體中和率。

抗體中和率（%）=（樣品RLU-陰性對照RLU）／（陽性對照RLU-陰性對照RLU）×100%

1.9數據采集及分析 應用Gen5 GHS 3.08 軟件進行數據采集、分析及作圖。

2 結果

2.1大鼠血清的篩選 給藥13 周后，空白對照組血清抗體大部分為陰性，個別動物檢測到陽性抗體（＜1∶100），可能與基質中存在非特異性干擾有關；低、中、高劑量組大鼠對rhIL-1Ra 注射液均產生了免疫反應，且性別差異較小。給藥后D15，隨著給藥次數的增加，抗體滴度逐漸增強，至恢復期D106 和D120仍有抗體存在，且滴度較高。高、中劑量組的抗體滴度略低于低劑量組。見表1和表2。

表1 雄性大鼠血清抗體的檢測結果Tab.1 Detection results of serum antibody in male rats

表2 雌性大鼠血清抗體的檢測結果Tab.2 Detection results of serum antibody in female rats

2.2方法的驗證

2.2.1專屬性 兔抗rIFN-2b單抗+rhIL-1Ra標準品及rhIL-1Ra標準品的四參數回歸曲線均呈倒S形，上下平臺完整，具有明顯的劑量效應關系，二者曲線基本重合。兔抗rIFN-2b 單抗的曲線不呈倒S 形，無上下平臺，無劑量效應關系，表明該抗體無中和效應。兔抗rhIL-1Ra 單抗曲線與rhIL-1Ra 標準品曲線基本平行，且曲線明顯右移，表明兔抗rhIL-1Ra單抗對IL-1Ra 有明顯的中和作用，見圖1。表明該方法具有良好的專屬性。

圖1 專屬性驗證結果Fig.1 Verification for specificity

2.2.2靈敏度 兔抗rhIL-1Ra單抗濃度為12 000、2 400、1 200 μg／mL 的RLU 相似，因此選擇1 200 μg／mL為曲線模擬的起始點，將臨界值代入曲線方程獲得靈敏度為171.93μg／mL，見圖2。

圖2 靈敏度驗證結果Fig.2 Verification for sensitivity

2.2.3精密性 每名實驗員重復檢測3次1 200、600、300μg／mL兔抗rhIL-1Ra單抗RLU的CV為2.56%～18.1%，均≤20%，見表3。2名實驗員對各濃度（1 200、600、300μg／mL）兔抗rhIL-1Ra單抗重復檢測6次RLU的均值分別為3 828.56、986.44、408.68，SD分別為151.06、63.11、29.07，CV分別為3.95%、6.40%、7.11%，均≤20%。表明該方法具有良好的精密性。

表3 精密性驗證結果Tab.3 Verification for precision

2.3方法的應用 經檢測，ELISA 篩選的陽性抗體血清對rhIL-1Ra 注射液均可產生中和效應，與ELISA檢測結果相符。見表4和表5。

表4 雄性SD大鼠血清中和抗體檢測結果Tab. 4 Detection results of neutralizing antibody in serum of male SD rats

表5 雌性SD大鼠血清中和抗體檢測結果Tab. 5 Detection results of neutralizing antibody in serum of female SD rats

3 討論

本研究參考FDA指導原則中關于治療性蛋白藥物免疫原性檢測方法，采用抗體篩選和確證的分層式方法對rhIL-1Ra 重復給藥大鼠血清中和抗體進行分析［14］。動物重復給藥毒性試驗的血清樣本數量較大，本研究建立的方法能夠對樣品進行較高通量的快速檢測［15-16］。預試驗結果顯示，血清成分對檢測細胞的生長有影響，會對rhIL-1Ra 的生物學檢測造成干擾。為減少血清樣本的干擾，一般會對樣品進行前處理，處理方法包括單獨酸解離法、藥物靶標法、親和捕獲洗脫法、酸解離固相萃取法、沉淀結合酸解離法及生物素化藥物提取結合酸解離法等［17-18］。本研究參考MCCUTCHEON 等［19］提出的Protein A 層析柱純化血清預處理方法，將血清中的抗體成分純化后再進行檢測。

本研究在報告基因法檢測rhIL-1Ra 活性模型的基礎上建立中和抗體活性確證的方法，并進行了驗證。報告基因法由于靈敏度較高，操作簡便、周期短、成本低、高通量、變異度小、且可模擬制品的生物學作用等優點已逐漸發展為平臺化技術［20-22］。本研究確立了臨界點的范圍和評判標準，可快速高效對結果進行判定，并確定該方法靈敏度為171.93μg／mL。專屬性驗證結果顯示，建立的方法對其他藥物抗體不產生中和反應，僅對兔抗rhIL-1Ra 單抗產生中和反應，表明該方法具有良好的專屬性。精密性驗證結果顯示，不同實驗員不同時間檢測結果的CV均＜20%。

綜上所述，本研究建立的rhIL-1Ra 免疫大鼠血清中和抗體活性檢測方法具有良好的專屬性、精密性及較高的靈敏度，且操作簡單、可行性強，可用于rhIL-1Ra 重復給藥動物血清中和抗體活性的檢測。