蜚蠊改善錯配修復基因缺失腸癌細胞對氟尿嘧啶敏感性的機制研究

彭 雯，秦 琴，王 巧，譚詩生

大腸癌（colorectal cancers, CRC）的發病率及死亡率在我國呈逐年升高趨勢，嚴重危害人類健康[1]。由于大腸癌早期的臨床癥狀不典型，早篩的普及性較差，大部分患者就診時已經是中晚期，喪失了手術機會，所以化療仍然是大腸癌的主要治療手段之一。目前針對大腸癌的標準化療方案是以氟尿嘧啶為基礎的聯合方案[2]，但由于錯配修復基因缺失（deficient mismatch repair, dMMR），導致腸癌患者天然對氟尿嘧啶藥物不敏感[3-4]，以致患者不能從治療中獲益。以往研究顯示中藥土家蜚蠊對大腸癌具有抗腫瘤作用[5]。本研究將蜚蠊與氟尿嘧啶（5-FU）聯合作用于dMMR 腸癌細胞，探究蜚蠊聯合氟尿嘧啶對dMMR 大腸癌細胞的增效作用，并應用脂質組學技術挖掘相關通路及機制，以期為臨床提高dMMR 大腸癌患者的療效提供有效策略。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞 人源大腸癌HCT116、DLD1 細胞株購自美國ATCC 細胞庫，由四川大學生物治療實驗室凍存保管，前期研究證實HCT116 為MLH1 基因缺失細胞，DLD1 為MSH6 基因缺失細胞，均為dMMR大腸癌細胞[6]。

1.1.2 藥物蜚蠊脫脂精粉（生產批號：202040328-02）購于彌渡縣云峰美蠊養殖基地。蜚蠊含藥血清制備：1）SPF 級SD 大鼠，隨機分為2組，空白對照組（NC）和蜚蠊含藥血清組（FL），蜚蠊組按成人臨床等效劑量（15 g/60 kg）的10 倍來配制蜚蠊混懸液，藥物濃度為0.25 g/mL，按10 mL/kg 灌胃給藥，空白對照組以等劑量生理鹽水灌胃，1 次/d，連續飼養7 d。2）大鼠末次灌胃1 h 后，采集腹主動脈血，留取血清，分裝保存至-20 ℃冰箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT 法檢測蜚蠊對HCT116、DLD1 腸癌細胞增殖的抑制作用 將100 μL 配制好的蜚蠊加入96孔板中，每孔按總體積的1.5%、3%、6%、12%、24%比例加入5-FU，配置成0.6、1.25、2.5、5、10 μmol/L不同劑量，加入96 孔板中，FL+5-FU 根據上述劑量聯合作用于細胞，每組劑量重復3 次，作用24 h、48 h 和72 h 后進行MTT 測定，抑制率=[1－(實驗孔OD值－空白組OD 值]/(對照孔OD 值－空白組OD 值)×100%。

1.2.2 通過Calcusyn2.0 計算兩藥聯合治療指數（CI值） 藥物聯合治療目的是達到協同增效。聯合治療指數CI 是量化協同作用簡單的方法。本研究依據Calcusyn 軟件的Chou and Talalay[7]方法，分析用不同濃度蜚蠊和5-FU 藥物組合聯合共同處理48 h結直腸癌細胞的細胞毒性。CI＜0.75 為協同作用，0.75～1.25 為疊加作用，CI＞1.25 為拮抗作用。

1.2.3 基因本體論(gene ontology, GO)功能富集分析 GO 分析的主要作用是對差異表達的基因進行基因功能注釋分析，通過OmicShare 云平臺進入GO 數據庫，上傳二代測序獲得蜚蠊聯合5-FU 與5-FU 單藥間差異基因，用DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）對差異基因的功能進行注釋分析，尋找兩組之間的差異通路。

1.2.4 高效液相色譜質譜串聯儀（LC/MS）進行脂質檢測 藥物作用72 h 后對細胞進行脂相提取，Acquity UPLC 系統進樣分析[8]，利用Q-TOF 質譜(waters, manchester, U.K.) 進行全脂質組學的測定。在 數 據 庫 Lipid Maps Database 和 Human Metabolome Database 中，利用m/z 鑒定代謝物，最后將數據導入Progenesis QI（newcastle, UK1）進行校準。對代謝物進行非成對模式t 檢驗，篩選出有統計學差異的代謝物（P＜0.05）。

1.3 統計學分析 所有數據采用SPSS 19.0 和Graphpad prism 7.0 軟件進行分析及作圖，組間率的比較采取ANOVA 方法進行檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蜚蠊含藥血清對大腸癌細胞增殖的抑制作用MTT 實驗結果顯示，不同蜚蠊濃度對HCT116 和DLD1 細胞均顯示出抑制作用，但抑制率不隨濃度加大而升高，統計學無意義。蜚蠊濃度為6%時對HCT116 和DLD1 細胞抑制作用較為明顯。蜚蠊與5-FU 聯合作用HCT116 和DLD1 細胞后顯示出較好的抑制作用，且隨5-FU 濃度增加抑制率越好，差異均有統計學意義（P＜0.05，表1～4）。

表1 FL 在不同濃度及時間對HCT116 細胞的抑制率

表2 FL+5-FU 在不同濃度及時間對HCT116 細胞的抑制率

表3 FL 在不同濃度及時間對DLD1 細胞的抑制率

表4 FL+5-FU 在不同濃度及時間對DLD1 細胞的抑制率

2.2 蜚蠊聯合5-FU 對結直腸癌細胞的聯合治療指數（CI）值檢測 給予上述同劑量的蜚蠊與不同劑量5-FU 聯合作用HCT116 和DLD1 細胞后，在HCT116 細胞中，蜚蠊濃度在6%時與5-FU 10 μmol/L 組合的CI 指數為0.24。在DLD1 細胞中，相同劑量組合兩藥CI 指數為0.35，CI 指數明顯低于0.75，表明當蜚蠊濃度在6%時與5-FU 10 μmol/L結合時，協同抗增殖作用最強，見圖1。所以本研究選擇HCT116 細胞進行后續實驗研究。

圖1 蜚蠊與5-FU 聯合用藥后在HCT116、DLD1 大腸癌細胞中CI 值

2.3 基因測序檢測兩藥聯合后差異基因及KEGG富集分析 基因測序發現兩藥聯合與5-FU 單藥之間有3276 個基因發生顯著變化（FC＞1.5，FDR＜0.05），通過京都基因和基因組數據庫（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG） 分析顯示，最重要的富集通路在脂質代謝、自噬、黏附物連接和PI3K-AKT-mTOR 等通路（圖2）。

圖2 蜚蠊與5-FU 聯合用藥后在HCT116 細胞中差異基因及通路變化

2.4 GO 功能分析 GO 功能分析發現主要生物過程包括脂肪酸代謝、血管內皮改變、自噬調控、凋亡發生及細胞黏附等生物學過程發生主要改變（圖3）。對通路中顯著差異變化基因進行挖掘，脂肪酸代謝發現脂滴（LD）、去飽和酶1（SCD1）、Acyl-CoA 合成酶1（ACSL1）、Acyl-CoA 合成酶（ACSL4）、ELOVL6、ACAT1 基因發生顯著改變。凋亡通路中CDKN1A、CDKN2A 和FASLG 基因變化顯著（圖3）。

圖3 GO 功能分析HCT116 細胞中蜚蠊聯合5-FU用藥組與5-FU 單藥組主要生物學改變中基因情況

2.5 脂質組學檢測 蜚蠊聯合5-FU 處理HCT116細胞后，對脂質組學檢測出的差異代謝物進行鑒定，鑒定出153 個脂質分子，包括脂肪類（62 個分子）、鞘脂代謝物（11 個分子）、磷脂代謝物（47 個分子）和甘油酯（33 個分子），見表5。

表5 脂質種類和數量表達情況

3 討論

雖然已有越來越多的治療方法應用于大腸癌患者，但由于大腸癌屬于“冷腫瘤”，免疫治療效果欠佳，靶向藥物需要與化療藥物聯合應用才能發揮較大的抗腫瘤作用，所以化療仍然是大腸癌患者的主要治療手段之一。5-FU 為結直腸癌患者化療的基本用藥，應用于術后輔助治療及晚期患者多線治療。但dMMR 腸癌患者對5-FU“天然耐藥”或抵抗不能獲益，影響了患者預后，因此，如何提高5-FU 在dMMR 腸癌患者的療效是亟待解決的重要問題。有研究發現，美洲大蠊提取物對食管癌、胃癌細胞均有抑制作用[9]，并且可以逆轉人肝癌細胞的多藥耐藥性[10-12]。本研究應用中西醫結合治療理念，應用土家藥蜚蠊與5-FU 聯合用于dMMR 大腸癌細胞，探討中藥蜚蠊改善5-FU 在dMMR 腸癌細胞中療效的相關性，發現脂質代謝、自噬和凋亡等生物信號發生主要改變，兩藥聯合可能通過脂質代謝途徑逆轉耐藥，從而達到協同增效作用。

本研究發現，脂質代謝在兩藥協同增效上發揮重要作用，應用LC/MS 技術進行脂質組學檢測到磷脂和甘油酯代謝異常。膜磷脂（包括PC、PE、PI、PA和Cer）是調節細胞增殖和耐藥的重要信號分子，磷脂的代謝改變有助于腫瘤的進展和耐藥[13]。其中ACSL 是調節脂質代謝的關鍵酶，包括脂肪酸伸長、氧化分解、磷脂生成和蛋白質?；?，與轉移和不良生存預后相關[14]，脂滴（LD）由脂質核心（甘油酯和甾醇酯）組成, 研究證實抑制LD 的積累可以改善5-FU 的療效[15-16]。SCD1 是生成復合脂質如磷脂、甘油三酯和膽固醇酯的關鍵基質。敲除SCD1 可以抑制腫瘤細胞的侵襲性，使腫瘤患者對各種治療更敏感[17-18]。同時，本研究發現凋亡通路發生顯著改變，FASLG 基因是腫瘤壞死因子家族成員，CDKN1A、CDKN2A 在凋亡執行過程中發揮重要作用。磷脂代謝異常引起脂肪酸及神經酰胺代謝異常誘導凋亡的發生（圖4）。因此，蜚蠊改善5-FU 療效可能是通過脂質代謝改變誘導細胞凋亡達到協同增效作用。

圖4 脂質代謝通路示意圖

綜上所述，中藥蜚蠊作用于dMMR 腸癌細胞可以改善5-FU 的敏感性，可能與腫瘤細胞脂質代謝改變誘導凋亡發生有關。本研究利用現代醫學研究手段為中藥蜚蠊的抗腫瘤作用及聯合西藥抗腫瘤研究提供了一定的理論基礎。但仍然需要從更深層次的分子及基因水平探究其作用機制，將中西醫結合更好地應用于臨床。