基于網絡藥理學和分子對接技術探究腦絡欣通治療缺血性腦卒中的機制

李佩佩,劉 佳,郜 巒,吳元潔,胡建鵬

(1.安徽中醫藥大學中醫學院,安徽 合肥 230012;2.安徽中醫藥大學研究生院,安徽 合肥 230012)

缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS),是指腦供血動脈狹窄或閉塞導致組織缺血低氧、壞死的一種破壞性腦血管事件,現已成為中國居民死亡的主要原因之一[1]?，F代醫學治療IS主要有靜脈溶栓、動脈取栓以及神經保護等手段,雖取得較大的進展,但難以避免缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)損傷以及出血等不良反應[2]。IS屬中醫學“中風”范疇,益氣活血方腦絡欣通是新安醫家王樂匋基于“氣血—腦髓”理論創制的辨治“中風”的特色方劑,該方以黃芪為君,益氣扶正以帥血;川芎、三七為臣,活血通脈以載氣;以天麻、蜈蚣為佐,息風通絡;當歸、紅花為使,增強活血之力。全方共奏益氣活血通絡之功,臨床適用于氣虛血瘀型“中風”[3]。前期研究[4-5]結果表明,腦絡欣通能顯著改善IS患者血液流變學和神經功能缺損的情況,并能減輕腦缺血大鼠氧化應激、炎癥反應等,但其藥理機制尚未被完全闡明。因此,本研究基于網絡藥理學的研究方法,對腦絡欣通治療IS的有效成分與潛在作用機制進行挖掘,并結合分子對接技術從微觀角度對其主要成分與核心靶點進行驗證,以期為后續實驗研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 活性成分及作用靶點篩選 通過中醫藥系統藥理學平臺(TCMSP,https://tcmspw.com)、ETCM數據庫(http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index)及化學專業數據庫(http://www.organchem.csdb.cn)檢索7味中藥所含的化學成分,限制條件為口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug like,DL)值≥0.18,對不能直接獲取OB和DL值的化合物則通過SwissADME數據庫(http://www.swissadme.ch)進行預測并基于Lipinski原則進行篩選[6],同時結合文獻補充有效化合物。將符合條件的活性成分導入TCMSP和Swiss Target Prediction平臺(http://www.swisstargetprediction.ch)獲取作用靶點,通過Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org)轉換成對應的靶點基因名稱(人源)。

1.2 疾病靶點收集 以“ischemic stroke”“cerebral ischemia stroke”“cerebral infarction”為關鍵詞,分別從OMIM(http://www.omim.org)、DisGeNET(https://www.disgenet.org/home),GeneCards(https://www.genecards.org)、Drugbank(https://www.drugbank.ca)數據庫檢索關于IS的人類疾病靶點。然后將“1.1”項下獲得的靶點與疾病靶點通過Venny 2.1.0在線工具進行映射,取交集基因,即得到腦絡欣通治療IS的潛在作用靶點(共有靶點)。

1.3 蛋白—蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡構建及關鍵靶點的查找 將“1.2”項下獲得的共有靶點輸入STRING平臺(https://cn.string-db.org),下載“tsv”格式的蛋白互作關系文件,導入Cytoscape 3.8.2軟件,繪制PPI網絡。利用CytoNCA插件功能進行拓撲分析,根據節點的連接度(Degree)、介度(Betweenness)、緊密度(Closeness)參數值篩選核心靶點,并構建“中藥—活性成分—核心靶點—疾病”網絡。

1.4 基因本體(gene ontology,GO)功能與京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomics,KEGG)通路富集分析 基于R3.6.2軟件中“clusterProfiler”“enrichplot”“ggplot2”功能包對共有靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析。根據P值由小到大排列,采用微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn)將排名前10位的GO功能[生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細胞組分(cellular component,CC)]3個模塊繪制條形圖,并將排名前20位的KEGG生物途徑繪制氣泡圖。

1.5 MCODE模塊聚類分析 通過Cytoscape 3.8.2軟件中MCODE插件對腦絡欣通治療IS的共有靶點進行聚類分析,提取關鍵的子模塊,并參照“1.4”項進行GO-BP分析。

1.6 分子對接驗證 通過PDB數據庫(https://www.pdbus.org)下載核心靶點的晶體結構,利用PyMOL軟件進行去水、刪除配體等處理,導出PDB格式文件;同時檢索PubChem數據庫下載關鍵成分的“SDF”格式文件,導入Chem3D軟件中使其能量最小化,輸出PDB格式文件。借助Auto Dock Tools軟件對蛋白進行加氫、計算電荷數后保存,根據蛋白原配體位置設置分子對接活性口袋、Lamarckiam GA(4.2)算法進行虛擬對接[7]。PyMOL軟件實現對接最優結果可視化。

2 結果

2.1 腦絡欣通的活性成分及其作用靶點 通過多數據庫聯合及文獻篩選腦絡欣通的活性成分,分別得到黃芪24個,川芎10個,三七16個,天麻11個,蜈蚣6個,紅花20個,當歸5個,去除重復值后共得到78個活性成分,相應獲得靶點蛋白1 316個,經Uniprot數據庫標準化后去除無效和重復靶點,得到作用靶點538個。

2.2 腦絡欣通治療IS的潛在作用靶點 通過檢索4個數據庫共得到IS相關靶點1 089個。將活性成分作用靶點與疾病靶點進行映射,獲得共有靶點200個,即為腦絡欣通治療IS的潛在作用靶點,見圖1。

2.3 腦絡欣通治療IS的PPI網絡及核心靶點的篩選 腦絡欣通治療IS的初步PPI網絡圖見圖2A,共161個節點和789條邊,經拓撲分析后得到Degree、Betweenness、Closeness 3項參數的中位數分別為6、66.82、0.094,篩選3項同時在中位數以上的靶點作為核心靶點,共得到59個核心靶點,其中STAT3、JUN、MAPK1、RELA、TP53、PIK3R1、AKT1等排名靠前。將核心靶點按照Degree值構建PPI網絡,結果見圖2B。

圖2 腦絡欣通—IS共同靶點PPI圖(A)和關鍵靶點PPI圖(B)

2.4 “中藥—活性成分—核心靶點—疾病”網絡拓撲圖及可視化分析 借助Cytoscape 3.8.2軟件構建腦絡欣通與IS的“中藥—活性成分—核心靶點—疾病”網絡圖(見圖3)。網絡中有527個節點,每個節點的Degree值表示網絡中與節點連線的總條數,Degree值越大表示該化合物發揮作用的可能性越大[8]。對網絡圖進行拓撲學分析,Degree值排名前10的結果見表1,其可能為治療IS的關鍵化合物。由圖3可知,腦絡欣通中多個中藥活性成分協同作用于多個靶點,如黃芪、紅花共同成分山柰酚(kaempferol)與紅花、蜈蚣共同成分β-胡蘿卜素(beta-carotene)共同作用于靶點BCL2、JUN、CASP3,反映了復方多成分、多靶點配伍發揮協同效應的特點。

表1 腦絡欣通活性成分連接度Degree值排名

注:倒三角形表示藥物;正六邊形表示化合物;正八邊形表示疾病;菱形表示靶蛋白

2.5 GO富集分析和KEGG注釋分析 GO富集分析共得到BP 2 982條、MF 256條、CC 134條,根據顯著性選取排列前10的條目繪制條形圖(見圖4)。結果顯示,BP主要涉及藥物反應、脂多糖反應、氧化應激等;MF主要涉及DNA結合、轉錄因子結合、細胞因子受體結合等;CC主要涉及膜筏、膜微區、突觸前膜的組成部分、神經元胞體等。

圖4 BP、MF和CC中排名前10的條目

通過KEGG注釋分析共得到150條信號通路(P<0.05)。選取前20條通路,繪制氣泡圖,count表示富集在該通路上的靶點數目,見圖5。結果顯示,腦絡欣通可能作用的信號通路包括PI3K-AKT信號通路、HIF-1信號通路、FoxO信號通路以及神經營養蛋白信號通路等。

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖

2.6 MCODE聚類分析 通過Cytoscape 3.8.2軟件中MCODE插件對200個共有靶點進行聚類,圖6為評分前3的子模塊可視化圖,評分越高,該模塊在整個PPI網絡中發揮的作用越大。GO的BP分析結果見表2。模塊A主要參與對細胞死亡的正調控;模塊B主要參與對細胞遷移、運動的正調控;模塊C主要參與對轉移酶和蛋白質磷酸化的正調控。

表2 不同模塊的生物分析過程結果(前3)

圖6 共有靶點聚類結果評分前3的模塊可視化圖

2.7 活性成分和核心靶點的分子對接驗證 選取PPI網絡中的關鍵靶點與排名前3的活性成分進行對接,最低結合能(affinity)結果見表3。通過affinity評估對接結果,一般認為affinity<-4.25 kcal/mol表示成分與受體蛋白之間有一定的結合活性,affinity<-5.0 kcal/mol表示二者之間有較好的結合能力,而affinity<-7 kcal/mol則表明二者之間有強烈的結合活性[7]。結果表明,槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚與STAT3、JUN、MAPK1之間均有較好的結合活性。用PyMOL軟件對部分對接結果進行可視化分析,可見槲皮素能穩定地對接到STAT3蛋白的活性口袋中,二者通過氨基酸殘基ASP-369、LEU-438、LYS-370和ARG-379發揮氫鍵作用;山柰酚能穩定地對接到JUN蛋白的活性口袋中,二者通過氨基酸殘基ASN-42、LYS-122和ASP-215發揮氫鍵作用;β-谷甾醇能穩定地對接到MAPK1蛋白的活性口袋中,二者通過氨基酸殘基ASP-165發揮氫鍵作用。見圖7。

表3 腦絡欣通活性成分與核心靶點分子對接最低結合能

注:A.槲皮素(quercetin)與STAT3對接;B.山柰酚(kaempferol)與JUN對接;C. β-谷甾醇(β-sitosterol)與MAPK1對接

3 討論

本研究確定了腦絡欣通中的槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素和豆甾醇等活性成分可能為治療IS的關鍵化合物?，F代藥理學研究[9]表明,槲皮素具有抗氧化、抗炎以及清除自由基等多種生物活性,其通過調控PINK1/parkin通路蛋白的表達,激活線粒體自噬,抑制腦缺血損傷大鼠氧化應激及炎癥損傷,發揮神經保護效應;同時槲皮素可以減緩機體凝血過程,通過抑制血小板活化和炎癥因子的釋放,防止血液凝固[10]。山柰酚是一種多酚類抗氧化劑,可以顯著降低活性氧、超氧化物歧化酶、炎癥因子的表達,在IS中發揮積極作用[11]。β-谷甾醇和豆甾醇是三七、紅花、天麻、當歸的共有成分,同屬于固醇類化合物,研究[12]證明二者可以通過抗炎、抗氧化、抗凝等作用,減輕腦缺血再灌注損傷。木犀草素為紅花主要成分,能夠抑制腦缺血再灌注損傷后氧化應激、炎癥反應,其機制可能與抑制動力相關蛋白1活性改善自噬流過程,升高熱休克蛋白70表達水平,降低腦組織皮質區TNF受體關聯因子表達水平有關[13]。以上結果提示,腦絡欣通活性成分可能通過參與氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡及自噬等途徑在腦缺血中發揮作用。

基于PPI網絡及拓撲參數的分析,篩選出腦絡欣通治療IS的核心靶點,包括STAT3、JUN、MAPK1、TP53、AKT1、PIK3R1等,這些靶點與缺血性疾病密切相關。STAT3是信號轉導與轉錄激活因子3,磷酸化激活后可響應細胞質中不同細胞因子、生長因子信號,進而影響許多生理過程,包括細胞增殖、凋亡、分化等[14]。有研究[15]表明,在大鼠大腦中動脈阻塞模型中觀察到缺血區神經元和星形膠質細胞中STAT3顯著活化,調控JAK2/STAT3信號通路可以影響神經元、血管內皮細胞的凋亡、增殖和分化,還增加神經可塑性。血管內皮細胞損傷是腦缺血損害的基本動因,而TP53高表達是促進血管內皮細胞凋亡的重要原因之一。研究[16]表明,TP53可以提高內皮細胞Bax的表達,同時降低Bcl-2的表達水平。炎癥是IS損傷的關鍵驅動因素,JUN是核轉錄因子激活蛋白-1的成員,在生物體內通過多種途徑激活炎癥反應、應激誘導因子或病原體,與IS的發生發展密切相關[17]。MAPK1是絲裂原活化蛋白激酶信號通路中關鍵激酶,腦缺血會導致MAPK1時間依賴性活化,抑制MAPK1能減輕細胞凋亡和炎癥反應,對腦卒中小鼠發揮保護作用[18]。PIK3R1是PI3K的p85調節亞基,AKT1是AKT激酶家族的一員,二者通過調控細胞代謝、增殖等多種生物過程參與IS的治療[19]。研究[20]證實,激活PI3K、AKT可促進內皮細胞生長、遷移,促進血管生成。因此,腦絡欣通可能通過作用于STAT3、TP5減輕IS的細胞凋亡;作用于JUN、MAPK1減輕IS的炎癥反應;作用于PIK3R1、AKT1促進血管生成,改善IS的血液供應和營養支持。

GO富集的分子功能主要包括藥物反應、脂多糖反應、氧化應激等;氧化應激是缺血再灌注過程中導致神經元損傷的關鍵機制之一,通過損害線粒體ATP的產生并誘導細胞內Ca2+超載和ROS的產生,進而誘導細胞凋亡或壞死[21]。KEGG富集結果顯示,腦絡欣通治療IS主要涉及PI3K-AKT信號通路、HIF-1信號通路、FoxO信號通路等。PI3K-AKT信號通路是細胞代謝、生長、凋亡等生理活動的經典通路[22]。研究[23]顯示,該通路在IS發生發展和藥物干預治療中發揮關鍵作用,可通過抑制氧化應激、神經元自噬、血腦屏障紊亂等多種病理過程發揮神經保護作用。當組織缺血、低氧時HIF-1蛋白水平迅速升高,調控誘導型一氧化氮合酶、血管內皮生長因子等下游靶基因促進血液循環、葡萄糖運輸以及血管新生等,起到對低氧組織的保護作用[24];但HIF-1在低氧組織中的過表達并不一定發揮保護效應。有研究[25]顯示,大鼠腦缺血損傷后HIF-1上調導致血腦屏障破壞、水腫程度加重等,具有雙重作用。前期研究[26-27]結果表明,腦絡欣通能通過調節PI3K-AKT和HIF-1信號通路抑制腦缺血大鼠細胞凋亡,促進血管新生,發揮神經保護作用,與預測結果相符合。此外,FoxO信號通路也是調控細胞增殖、凋亡和代謝等生命過程的重要通路,包括FoxO1、FoxO3a、FoxO4和FoxO6 4個家族成員,其中FoxO1主要在氧化應激中調控細胞凋亡,FoxO3a在腦缺血中異常表達促進神經元自噬,而下調FoxO4能增加氧化應激時內皮細胞耐受,促進存活[28]。另外,本研究中筆者運用MCODE插件對200個共有靶點進行聚類分析,發現在共有靶點PPI網絡中發揮關鍵作用的子模塊主要參與細胞死亡、生長、運動和蛋白磷酸化等生物過程。

綜上所述,腦絡欣通可能通過槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素等活性成分,協同作用于STAT3、JUN、MAPK1等靶點,通過PI3K-AKT、HIF-1、FoxO等信號通路調控氧化應激、神經炎癥、細胞凋亡等生物過程,發揮對IS的治療作用。分子對接結果也證實腦絡欣通主要活性成分能與核心靶點之間穩定結合形成氫鍵。本研究初步揭示了腦絡欣通通過多成分、多靶點、多途徑治療IS的作用機制,但值得注意的是,有學者提出“槲皮素類現象”[29],即槲皮素類成分頻繁出現在網絡藥理學研究結果中,可能與其在植物中廣泛分布,且各種體內外藥效作用報道出現較多有關,此現象需引起重視,后續仍要結合體內外實驗驗證其網絡作用靶點和藥效機制。