基于AMPK通路探究電針結合有氧運動對肥胖大鼠的作用機制

周 騫,向麗婷,史賽君,田夢影,龍 專,宋 洋

(1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院,湖南 長沙 410007;2.湖南體育職業學院,湖南 長沙 410000;3.湖南中醫藥大學,湖南 長沙 410000)

隨著社會經濟的快速發展,人們生活水平的提高,肥胖已成為重要的社會公共衛生問題,全球近1/3的人口已被確定為肥胖或超重[1]。肥胖作為一種常見的臨床綜合征,在遺傳和環境因素的共同作用下,人體脂肪含量過高及異常分布,可引發心血管疾病和各種內分泌代謝紊亂[2]。肥胖的治療包括飲食干預、生活方式干預、藥物治療和手術等,藥物和手術治療因技術問題以及產生的不良反應,難以在臨床應用和推廣[3-4]。而運動療法作為一種治療肥胖安全有效的方法,一直是醫學、體育學等領域的研究熱點。大量研究表明,多數有氧運動可以達到消耗能量的目的,是促進機體健康的有效手段。針灸療法具有疏通經絡、調節陰陽、扶正祛邪之功效,在治療肥胖方面取得了顯著的臨床效果,且應用方便、經濟安全[5]。腺苷酸活化蛋白激酶(adenine monophosphate activated protein kinase,AMPK)是調節組織能量代謝的主要靶點,由肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)激活,在脂質代謝中發揮關鍵作用[6-7]。乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase,ACC)是AMPK的下游靶點,在脂肪酸合成過程中有著重要作用。研究[8]發現,激活LKB1/AMPK通路有明顯的降脂作用。因此,本研究建立了高脂飲食肥胖大鼠模型,通過檢測AMPK/ACC通路相關指標來探究電針結合有氧運動調節肥胖大鼠的可能機制,為臨床治療提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Infinite M100全波長多功能酶標儀:瑞士Tecan公司;Vibra Cell型超聲波破碎儀、電子分析天平(0.1 mg,120 g)、Fresco21高速低溫離心機、渦旋混合器、TS-1脫色搖床、DM1000 LED生物顯微鏡:德國徠卡生物科技公司;WB凝膠成像系統:BIO-RAD公司;石蠟包埋機、切片機:湖北泉林醫療設備有限公司;37 ℃恒溫箱:上海精宏公司。

1.2 試劑 總膽固醇(total cholesterol,TC)試劑盒(批號 CB11076-Ra)、三酰甘油(triglyceride,TG)試劑盒(批號 CB10370-Ra)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)試劑盒(批號 CB10309-Ra)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)試劑盒(批號 CB10309-Ra)、大鼠白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)試劑盒(批號 CB10218-Ra)、大鼠白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)試劑盒(批號 CB10218-Ra)、大鼠三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate,ATP)試劑盒(批號 CB10218-Ra)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號 PC0020):北京索萊寶科技有限公司;SDS-PAGE上樣緩沖液、凝膠制備試劑盒(貨號 CW0027S):江蘇康為世紀科技有限公司;p-LKB1、p-AMPK、LKB1、AMPK、ACC、GADPH抗體(批號分別為ab63473、ab92701、ab15095、ab32047、ab109368、ab8245):Abcam公司。

1.3 動物 SPF級雄性SD健康大鼠45只,200～220 g,由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供,實驗動物生產許可證號:SCXK(湘)2022-0005。所開展的動物實驗均遵守“3R”原則及國際實驗動物倫理學要求,實驗過程中對動物的各種處理均遵照《關于善待動物的指導性意見》的有關規定。SD大鼠飼養于實驗動物房,飼養溫度為20～24 ℃,濕度為(55±10)%,保持12 h照明/12 h黑暗。

2 方法

2.1 模型復制及分組 從45只SD大鼠中隨機挑選8只作為空白組,其余37只大鼠用高脂飼料(45%脂肪、35%碳水化合物、20%蛋白質)喂養8周建立肥胖模型,將采用高脂飼料喂養的大鼠體質量高于空白組大鼠體質量的30%作為模型復制成功的標準。剔除模型復制失敗的5只大鼠,其余32只隨機分配到模型組(高脂飼料)、電針組(高脂飼料聯合穴位電針)、運動組(高脂飼料聯合運動)、電針聯合運動組(高脂飼料聯合穴位電針及運動),每組8只。

2.2 干預方法 電針組:參考文獻[9]定位大鼠“關元”“天樞”“豐隆”“足三里”穴,將大鼠固定于固定架后,用一次性無菌針直刺在腹部(“關元”“天樞”定位在大鼠臍下25 mm處)和下肢部(“足三里”“豐隆”定位在大鼠膝關節外)穴位,深度為4 mm,連接電針儀,頻率為2/100 Hz,脈沖寬度為0.5 ms,行針以大鼠出現輕微顫抖為宜,留針30 min,治療5 d休息2 d,共干預8周。運動組:大鼠每日進行45 min的無負重游泳運動,水溫為30～32 ℃,水深55 cm左右,每周5 d,共8周,運動前1周應進行適應性訓練,且游泳時應時刻觀察大鼠動態,以防大鼠溺水死亡[10]。電針聯合運動組:電針方法同電針組,大鼠每日上午進行電針后6 h,再進行45 min無負重游泳訓練。模型組:將大鼠固定后不予處理?？瞻捉M:正常飲水、飲食,不予任何干預。

2.3 大鼠體質量 每周固定時間記錄每只大鼠的體質量,評估不同干預方法對大鼠身體狀況的影響。

2.4 ELISA法檢測大鼠血脂、炎癥因子、ATP水平 干預8周后,腹主動脈取血5 mL,分離血清,4 ℃離心(3 500 r/min,15 min)。取上清液并于-80 ℃冰箱保存。使用大鼠ELISA試劑盒檢測大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C,炎癥因子IL-1β、IL-6和能量指標ATP水平。

2.5 蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察大鼠肝組織脂肪形態 取大鼠肝組織,用4%中性多聚甲醛溶液固定,樣本經脫水、包埋、切片、脫蠟、水洗后,采用HE染色、封片,光學顯微鏡下觀察。

2.6 Western blot法檢測大鼠肝組織p-LKB1、p-AMPK、ACC蛋白表達水平 精密稱取大鼠肝組織,加入RIPA裂解液提取總蛋白,再用研磨儀于冰上勻漿,離心30 min后取上清。按照BCA蛋白定量法測定蛋白濃度,配制SDS-PAGR凝膠,每孔上樣20 μg;80 V電泳,300 mA電轉,5%脫脂牛奶中封閉搖床孵育90 min進行封閉;一抗孵育:根據目的蛋白分子量將印跡膜裁剪成一定寬度的條帶,加入用5% BSA配制好的一抗[GAPDH(1∶1 000)、p-AMPK(1∶1 000)、AMPK(1∶1 000)、p-LKB1(1∶1 000)、LKB1(1∶1 000)、ACC(1∶2 000)]浴液,放置4 ℃冰箱孵育過夜;加入HRP標記的IgG二抗(1∶10 000),室溫孵育1 h,取適量ECL-A液和ECL-B液等容積混合,配制成化學發光檢測工作液進行顯影。

3 結果

3.1 5組大鼠體質量比較 與空白組比較,模型組大鼠體質量顯著增加(P<0.05),表明高脂飲食可以顯著增加大鼠體質量;與模型組比較,電針聯合運動組大鼠體質量顯著減少(P<0.05),表明電針聯合運動能夠顯著抑制大鼠體質量增長。見圖1。

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.2 5組大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平比較 與空白組比較,模型組大鼠血清TG、TC、LDL-C水平顯著升高(P<0.05),HDL-C水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,電針聯合運動組大鼠血清TG、TC、LDL-C水平顯著降低(P<0.05),HDL-C水平顯著升高(P<0.05)。見圖2。

注:A.空白組;B.模型組;C.電針組;D.運動組;E.電針聯合運動組;與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.3 5組大鼠血清炎癥因子、ATP水平比較 與空白組比較,模型組大鼠血清IL-1β、IL-6水平顯著升高(P<0.05),ATP水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,電針聯合運動組大鼠血清IL-1β、IL-6水平顯著降低(P<0.05),ATP水平顯著升高(P<0.05)。見圖3。

注:A.空白組;B.模型組;C.電針組;D.運動組;E.電針聯合運動組;與空白組比較,?P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.4 5組大鼠肝臟組織形態比較 空白組大鼠肝細胞內細胞核分布均勻,細胞大小均一,沒有脂肪顆粒浸潤,肝組織結構完整;模型組大鼠肝小葉結構紊亂,出現明顯的脂肪空泡,肝細胞排列紊亂,細胞邊界不清晰;相較于模型組,電針組、運動組大鼠肝細胞脂肪體積減少,但有部分的脂肪滴;電針聯合運動組大鼠肝細胞內幾乎看不到脂肪顆粒,且細胞排列整齊,邊界清晰。見圖4。

注:A.空白組;B.模型組;C.電針組;D.運動組;E.電針聯合運動組

3.5 5組大鼠肝組織p-AMPK、p-LKB1、ACC蛋白表達水平比較 與空白組比較,模型組大鼠肝組織p-AMPK、p-LKB1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),ACC蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,電針聯合運動組大鼠肝組織p-AMPK、p-LKB1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),ACC蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖5。

注:A.空白組;B.模型組;C.電針組;D.運動組;E.電針聯合運動組;與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

4 討論

肥胖是由于飲食不節、缺乏體力活動等多種原因導致的體內膏脂過多,使體質量高于一定范圍,或伴有其他癥狀的一種疾病[11-13]?！端貑枴て娌≌摗吩?“此肥美之所發也,此人必數食甘美而多肥也?！薄秱浼鼻Ы鹨健芬灿小帮柺臣磁P,乃生百病”的告誡,提示飲食失節是導致肥胖的關鍵[14-15]。因此,本研究采用高脂飼料喂養誘導肥胖大鼠模型,模擬因過度飲食和缺乏運動而引起的肥胖。結果表明,高脂飲食可以顯著增加大鼠體質量(P<0.05),血清TG、TC、LDL-C水平顯著升高(P<0.05),HDL-C水平顯著減少(P<0.05),并伴有動物動作緩慢,毛發油膩,提示肥胖大鼠模型構建成功。

肥胖主要與脾胃功能失常引起的膏脂、水濕、痰飲聚集有關[16-18]。關元是人體培補元氣的重要穴位,針刺關元既能培補脾胃后天之本,又能溫補腎臟先天之本[19];天樞是足陽明胃經的腧穴,也是大腸募穴,能將人體清氣運輸到胃,把濁氣轉運到腸,促進食物消化;豐隆為足陽明經的絡穴,是益氣壯陽、健脾祛濕化痰的要穴[20];足三里為補虛強壯之要穴,可增強運動耐力,增強體內代謝[21-22]。本研究對肥胖大鼠“關元”“豐隆”“天樞”“足三里”進行電針干預,并結合有氧運動,實驗結果表明,電針聯合運動對肥胖大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平有顯著改善作用(P<0.05),能達到健脾益氣、減肥降脂的作用。肥胖通常被認為一種全身的慢性低度炎癥狀態,在白色脂肪細胞增生肥大時,會分泌促炎因子IL-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α等[23-24]。本研究結果顯示,電針聯合運動可顯著降低大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β水平(P<0.05),提示電針聯合運動對改善炎癥具有較好的效果。

肝臟是機體調節糖脂代謝的重要器官之一。據報道[25-26],AMPK是細胞能量感受器,主要作用于糖代謝、脂代謝、線粒體生物合成和自噬等方面。在哺乳動物中,LKB1為級聯反應中的重要上游激酶,p-LKB1可與AMPK-α亞基172位蘇氨酸磷酸化位點結合,使AMPK活化,并通過ACC的磷酸化和失活,讓機體開始分解代謝ATP,使之有效應對機體低能量狀態和線粒體損傷[27]。不僅如此,AMPK可激活ACC,抑制膽固醇和脂肪合成。有研究[28]表明,激活AMPK可明顯降低胰島素抵抗大鼠TG、長鏈游離脂肪酸水平,提高HDL水平,降低腹型肥胖,由此推斷激活AMPK可以糾正大鼠脂質代謝紊亂。

綜上所述,電針聯合運動組干預效果要優于其他單一療法組,可以顯著改善肥胖大鼠體質量、脂質水平,降低炎癥因子水平,增加ATP含量,推測其機制可能與激活LKB1/AMPK通路有關。