黃連解毒湯對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化炎癥及主動脈斑塊穩定性作用的機制研究

楊秀君,左 強,毛龍燕,張 軍,戴小華

(1.安徽中醫藥大學研究生院,安徽 合肥 230012;2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院,安徽 合肥 230031;3.安徽省中醫藥科學院心血管病研究所,安徽 合肥 230031;4.國家中醫心血管病臨床醫學研究中心分中心,安徽 合肥 230031)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種慢性、漸進性血管病變,以其為主要病理基礎導致的心腦血管疾病,全球發病率和死亡率呈明顯上升趨勢,發病態勢正逐漸向年輕化方向轉變[1-2]。AS發生發展的過程是以脂質代謝障礙為基礎病變,多種炎癥因子參與其中,最終促使動脈血管內膜斑塊形成,甚至斑塊破裂,導致多種急性心腦血管疾病的發生[3]。因此,調脂抗炎是治療AS的重要環節。他汀類藥物是目前防治AS的一線藥物,但部分應用他汀類藥物治療的患者發生了肝毒性、肌溶解等不良反應。目前,無論是實驗研究還是臨床研究,都已經廣泛認可了中醫藥在AS防治方面的功效,且相對安全[4-5]。中醫認為,高脂飲食易生濕熱,而高脂飲食同時也是導致AS的重要危險因素之一,因此,濕熱證與AS關系密切。黃連解毒湯是清熱燥濕解毒的經典方劑[6-8]。既往多項研究[9-11]表明,黃連解毒湯能夠有效達到降脂、抗炎等多種治療效果,其干預作用不僅可改善AS小鼠的脂質代謝,還可影響干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)等多種炎癥因子的表達。

本研究旨在觀察黃連解毒湯對AS ApoE-/-小鼠血脂、血清炎癥因子[白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)]水平,主動脈內膜斑塊不穩定指數(vulnerability index,VI)的影響,進一步分析炎癥因子水平和脂質代謝與AS斑塊穩定性的關系。

1 材料

1.1 動物 36只SPF級6周齡健康雄性ApoE-/-小鼠[北京唯尚立拓科技有限公司,生產許可證號:SCXK(京)2016-0009],體質量為(22.5±3.0)g,購買后于安徽中醫藥大學動物實驗中心飼養,每籠6只,自由進食及飲水,飼養設備嚴格無菌操作后使用,置于清潔飼養環境[SPF級,室溫為(23±3)℃,相對濕度為50%,12 h光/暗循環]中飼養。本實驗經安徽中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準,倫理編號為908138606021。

1.2 藥物 黃連解毒湯(組成:黃芩、黃柏各6 g,黃連、梔子各9 g)飲片:購自安徽中醫藥大學第一附屬醫院中藥房;阿托伐他汀(批號 EM4291):輝瑞制藥有限公司?？偰懝檀?total cholesterol,TC)測定試劑盒(貨號 A030)、三酰甘油(triglyceride,TG)測定試劑盒(貨號 A033)、低密度脂蛋白—膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)測定試劑盒(貨號 A028)、高密度脂蛋白—膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)測定試劑盒(貨號 A020):長春匯力生物;IL-10 ELISA試劑盒(貨號 JYM0651Ra)、IL-6 ELISA試劑盒(貨號 JYM0419Ra)、IL-1β ELISA試劑盒(貨號 JYM0419Ra)、TNF-α ELISA試劑盒(貨號 JYM0635Ra):武漢基因美科技;α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體(批號 BJ09162470):北京Bioss公司;CD68抗體(批號 GR3415295-10):英國Abcam公司。

1.3 儀器 酶標儀(RT-6000):深圳雷杜生命科學股份有限公司;半自動生化分析儀[CB171(A)X]:長春匯力生物技術有限公司;徠卡切片機(RM2016):上海徠卡儀器有限公司;OLYMPUS顯微鏡(CX41):上海普赫光電科技有限公司。

2 方法

2.1 動物分組及模型復制 采用高脂飲食構建AS ApoE-/-小鼠模型[12]。取36只6周齡健康雄性ApoE-/-小鼠,隨機分為6組(空白組,模型組,黃連解毒湯低、中、高劑量組,阿托伐他汀組),每組6只;空白組6只始終喂食普通飼料,模型組及給藥組均喂食高脂飼料(合肥青源生物科技有限公司生產;組成:4%膽固醇、10%豬油、5%白糖、81%基礎飼料)。第8周末隨機選取2只小鼠,取尾靜脈血進行血清學指標檢測,若與空白組比較,血清TC、TG、LDL水平顯著上升,HDL-C水平顯著下降,即為模型制備成功。后8周繼續給予相應飼料喂養,共16周。

2.2 藥物干預 自第8周末進行藥物灌胃干預。將黃連解毒湯中藥材依照原方比例加水煮沸,合并3次煎液,恒溫100 ℃濃縮制成水煎劑,含5 g/mL生藥,放冰箱凍存,使用時以蒸餾水以1∶10比例稀釋。根據人和動物體表面積折算系數進行換算給予相應臨床給藥劑量,黃連解毒湯低、中、高劑量組小鼠分別按10、20、40 g/(kg·d)劑量給予黃連解毒湯;阿托伐他汀組小鼠按10 mg/(kg·d)劑量給予阿托伐他汀;空白組、模型組給予等量蒸餾水。每日灌胃1次,共8周。

2.3 標本采集 第16周末(藥物治療8周后的最后1天)采集標本。實驗小鼠禁水禁食12 h,1%戊巴比妥鈉40 mg/kg進行腹腔注射麻醉,摘取小鼠眼球,采集血液,樣本靜置2 h后,離心(4 ℃,3 400 r/min,10 min),收集上清,-20 ℃保存待測。將小鼠胸腹腔打開,摘取主動脈,清理干凈后,裁取數段,分別放置在透射電子顯微鏡固定液、4%多聚甲醛溶液及液氮罐中,保存待測。

2.4 觀察指標及方法

2.4.1 小鼠主動脈內膜的病理結構變化 取小鼠主動脈1 cm左右,放置在10%甲醛溶液的EP管中固定,梯度乙醇脫水,二甲苯使組織透明化,石蠟包埋,隨后切片,蒸餾水洗,每組隨機選取5張進行蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,光學顯微鏡觀察小鼠主動脈的組織形態。

2.4.2 小鼠血脂水平及炎癥因子檢測 取血清適量,使用半自動生化分析儀檢測各組小鼠血清TC、TG、LDL-C及HDL-C水平;采用ELISA法檢測各組IL-1β、IL-6、IL-10及TNF-α水平,實驗步驟嚴格依照相應試劑盒說明書進行。

2.4.3 小鼠主動脈內膜斑塊VI檢測 利用組織學特殊病理染色技術測定主動脈內膜斑塊內巨噬細胞含量、α-SMA細胞含量、斑塊內膠原纖維含量及斑塊內脂質含量,從而計算斑塊VI:VI=(巨噬細胞含量/%+脂質含量/%)/(膠原纖維含量/%+平滑肌細胞含量/%)。

3 結果

3.1 各組小鼠主動脈內膜的組織形態比較 空白組小鼠主動脈管壁結構清晰,形態正常。與空白組比較,模型組小鼠主動脈管壁明顯增厚,內膜下有大量泡沫細胞堆積、斑塊形成,少量纖維在斑塊表層沉積,部分動脈管壁變薄且輕度膨出。與模型組比較,黃連解毒湯中劑量組小鼠動脈管壁情況有所改善,主動脈內膜下少量泡沫細胞聚集,脂質斑塊變小。黃連解毒湯高劑量組與阿托伐他汀組小鼠動脈內膜組織病理變化改善則更加明顯,主動脈管壁結構清晰,趨于正常,其中黃連解毒湯高劑量組療效最佳。見圖1。

注:A.空白組;B.模型組;C.黃連解毒湯低劑量組;D.黃連解毒湯中劑量組;E.黃連解毒湯高劑量組;F.阿托伐他汀組;箭頭指示處為疏松的結締組織、泡沫細胞及炎癥細胞浸潤

3.2 各組小鼠血脂水平比較 與空白組比較,模型組小鼠TC、TG、LDL-C水平均顯著上升(P<0.05),HDL-C水平均顯著下降(P<0.05);與模型組比較,黃連解毒湯中、高劑量組小鼠TG、TC、LDL-C水平顯著下降(P<0.05),HDL-C水平顯著上升(P<0.05);與阿托伐他汀組比較,黃連解毒湯高劑量組小鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血脂水平比較

3.3 各組小鼠血清炎癥因子水平比較 與空白組比較,模型組小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著增加(P<0.05),IL-10含量顯著減少(P<0.05);與模型組比較,黃連解毒湯中、高劑量組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α均顯著減少(P<0.05),IL-10含量顯著增加(P<0.05)。與阿托伐他汀組比較,黃連解毒湯低、中劑量組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著升高(P<0.05),IL-10含量顯著降低(P<0.05),黃連解毒湯高劑量組小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10含量差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血清炎癥因子水平比較

3.4 各組小鼠主動脈內膜斑塊VI比較 與空白組比較,模型組小鼠主動脈內膜斑塊VI顯著增加(P<0.05);與模型組比較,各給藥組小鼠主動脈內膜斑塊VI均顯著減少(P<0.05);與阿托伐他汀組比較,黃連解毒湯低、中劑量組小鼠主動脈內膜斑塊VI均顯著增加(P<0.05),而黃連解毒湯高劑量組小鼠主動脈內膜斑塊VI無明顯變化(P>0.05)。見表3。

表3 各組小鼠主動脈內膜斑塊VI比較

4 討論

AS是以巨噬細胞中脂質異常代謝堆積并伴發炎癥為特征的動脈內膜慢性病變,是多種心血管疾病的主要發病原因[13-14]。AS發生發展過程中,血脂狀況及多種炎癥細胞因子均具有重要作用,它們共同參與了AS斑塊的形成。而動脈內膜斑塊由穩定轉變為不穩定,乃至破裂,或突發血栓、出血,則是急性心腦血管事件發生的重要原因之一[15-17]。目前對斑塊不穩定的機制研究成果欠佳,因此,研究斑塊不穩定的機制以及延緩斑塊向不穩定方向發展,對于預防斑塊破裂、血栓形成都具有重要的意義。

研究[18-20]發現,AS的病理變化以脾氣虛為主,合并瘀、毒、痰三者的相互作用。氣郁化火,內蘊熱毒,灼傷脈絡,脈損血瘀,阻塞脈管,熱毒血瘀脈阻為心血管疾病的主要病機,故認為熱毒蘊結是AS的關鍵病機,可用清熱瀉火解毒法對AS進行治療。黃連解毒湯源自唐代王燾《外臺秘要》,全方主要由黃連、黃柏、黃芩、梔子4味藥組成,苦寒直折,清三焦之火。方中黃連為君,清瀉心火、中焦之火;黃芩為臣,清瀉肺熱、上焦之火;佐以黃柏,瀉下焦火;再使用梔子,通瀉三焦之火。以上四藥配伍,共奏清熱解毒之良效。實驗和臨床研究[21-23]表明,黃連解毒湯對AS等心血管疾病均有顯著的治療作用,能明顯減少患者動脈內膜斑塊的面積,穩定斑塊;還可以提高機體的抗氧化能力,防止各種炎癥因子的破壞;還有可能通過改善血漿內源性代謝物的水平,使機體恢復正常代謝,從而達到治療AS的目的。

本研究采用高脂飲食誘導構建AS ApoE-/-小鼠模型,16周后模型復制成功。就具體研究結果而言,不同劑量的黃連解毒湯對AS模型小鼠的血脂水平均具有改善作用,其中以黃連解毒湯高劑量組的總體效果最好。同時,經黃連解毒湯干預后,AS小鼠血清中促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表達水平均顯著下降,而抗炎因子IL-10的表達水平均顯著上升,VI也有所下降,且具有劑量依賴性,說明黃連解毒湯可能通過抑制炎癥反應來維持動脈內斑塊的穩定性,最終達到降低或延緩AS進程的目的。

綜上所述,本研究結果表明,黃連解毒湯對改善模型小鼠AS具有明顯的防治作用,其作用機制可能是降低炎癥因子水平和血脂水平,改善主動脈血管壁斑塊的穩定性。同時也表明,黃連解毒湯的療效具有劑量依賴性,高劑量的黃連解毒湯作用和阿托伐他汀相當,且相對安全,未見明顯不良反應。但是本研究的樣本量較少,其深入的機制與靶點有待進一步研究和探索。