高生物利用度姜黃素對腫瘤壞死因子-α致人臍靜脈內皮細胞炎癥損傷模型的保護作用

何飛燕,陳 歡,邱志霞,金子恒,齊淑貞,黃 芳

(1.中國藥科大學中藥學院,江蘇 南京 211198;2.河南中大恒源生物科技股份有限公司,河南 漯河 462600;3.中國醫學科學院皮膚病研究所,江蘇 南京 210042)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是以脂質代謝障礙為基礎的血管疾病,病變常累及大、中動脈,同時伴有平滑肌細胞和纖維基質增生[1]。AS是目前引起心血管疾病的主要原因之一[2]。炎癥在AS發生發展的各個階段都具有重要作用,因此AS通常也被認為是一種慢性炎癥性疾病[3]。內皮細胞是維持血管內穩態和低氧化應激的重要調節器。其可以通過分泌各種因子響應物理化學信號,進而調節血管張力、細胞黏附、血栓生成、平滑肌細胞增殖和血管壁炎癥等[4]。持續的炎癥刺激可以誘導內皮細胞持續激活,發生內皮細胞功能障礙,在AS等心血管疾病的進程中發揮重要作用[5]。

姜黃素(Curcumin)是從姜黃屬(CurcumaL.)中藥材中提取獲得的多酚類活性成分。研究[6-8]證實其具有抗炎、抗氧化、免疫調節等多種作用,表現出很強的內在活性。然而,傳統姜黃素水溶性低,腸道吸收相對較差,體內代謝途徑廣泛,經膽囊排泄迅速,口服的系統生物利用度較低[9-10],嚴重影響姜黃素的臨床應用。

1 材料

1.1 實驗動物 12只清潔級SD大鼠,6～8周齡,體質量180～220 g,雌雄各半,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。生產許可證號為SCXK(湘)2019-0004,實驗動物質量合格證號為430727200101169841。動物飼養于西南大學藥學院實驗動物中心,相對濕度50%～70%,室溫23～25 ℃,自然晝夜光線照明。

1.2 細胞株 HUVECs:江蘇凱基生物技術股份有限公司。

1.4 儀器 多功能熒光酶標儀:美國Thermo Fisher Scientific公司;化學發光成像儀:上海天能科技有限公司;實時熒光定量PCR儀:美國Bio-Rad公司;液質聯用系統UPLC(I-Class)-MS(XEXO TQD):美國Waters公司;AB 135-S天平:梅特勒·托利多儀器有限公司。

2 方法

2.2.1 標準溶液的配制 對照品溶液的配制:精密稱取姜黃素對照品1.09 mg,甲醇定容至10 mL,得濃度為10.9 μg/mL的貯備液。內標溶液的配制:精密稱取鹽酸小檗堿對照品1.60 mg,甲醇定容至10 mL,得濃度為160 μg/mL的貯備液,再用甲醇稀釋,配制濃度為960 ng/mL的內標對照品溶液。

2.2.2 樣品的預處理方法 取空白血漿100 μL,加入鹽酸小檗堿內標溶液10 μL,混勻,加乙酸乙酯0.3 mL,渦旋混合2 min,4 000 r/min離心10 min,分離上清液;下層沉淀重復上述操作,合并2次的上清液,40 ℃真空干燥。殘渣加100 μL甲醇復溶,渦旋混勻2 min,經0.22 μm微孔濾膜過濾,待測。

2.2.3 UPLC-MS/MS分析條件 色譜條件:Waters ACQUITY UPLC BEH(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)色譜柱;流動相為0.1%甲酸水溶液(A相)及0.1%甲酸乙腈溶液(B相),流速0.4 mL/min;柱溫35 ℃;進樣量1 μL。梯度洗脫(0～0.5 min,95% A;0.5～1.5 min,95%～2% A;1.5～3.5 min,2% A;3.5～4 min,2%～95% A,4～6 min,95%A)。質譜條件:ESI離子源;正離子模式;離子源溫度400 ℃;脫氣流速700 L/h;錐孔體積流量流速50 L/h;毛細管電壓3.0 kV。

2.3 HUVECs培養 HUVECs采用含10%血清的RPMI-1640培養基培養,于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育。倒置顯微鏡觀察,細胞生長至約80%時傳代。

2.5 TNF-α誘導HUVECs炎癥模型 HUVECs炎癥模型的建立參照文獻[11-12]。將生長良好的HUVECs接種于96孔板中,細胞貼壁后棄去培養液,加入含TNF-α(30 ng/mL)的無血清培養基培養24 h,誘導HUVECs炎癥模型。

2.8 實時定量PCR檢測關鍵炎癥因子環氧合酶-2(cyclooxygense-2,COX-2)、MCP-1 mRNA表達水平 HUVECs給藥及模型復制方法同“2.6”項。模型復制24 h后收集細胞以提取RNA。以20 μL逆轉錄反應體系進行逆轉錄后進行實時熒光定量PCR。反應條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性10 s;55～60 ℃退火20 s;72 ℃延伸20 s。引物序列見表1。實驗平行重復3次。

表1 目標基因的引物序列

2.9 Western blot法檢測NF-κB通路關鍵蛋白的表達水平 將生長良好的HUVECs以每孔2×105個接種于6孔板,按照“2.6”項的分組對細胞進行給藥預保護及TNF-α作用24 h,模型復制完成后于冰上提取蛋白。BCA試劑盒進行蛋白定量,SDS-PAGE進行電泳分離并電轉到PVDF膜,5% BSA封閉1 h,4 ℃孵育p65、p-p65、IκB、p-IκB一抗過夜,次日于室溫孵育對應二抗1 h,洗膜后加入ECL發光液顯影成像。實驗重復3次。

3 結果

圖1 兩種姜黃素制劑在大鼠體內的血藥

表2 兩種姜黃素制劑在大鼠體內的主要藥物動力學參數比較

注:與0 μmol/L比較,#P<0.05

3.3 相同給藥時間、不同給藥濃度兩種姜黃素制劑的抗炎作用比較

3.3.1 8組HUVECs內NO水平比較 與空白組比較,模型組NO水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,各濃度姜黃素組NO水平顯著降低(P<0.05)。結果表明,姜黃素干預可顯著降低TNF-α誘導的細胞內NO水平,減輕內皮細胞損傷。見圖3。

注:A.空白組;B.模型組;C.0.5 μmol/L PURCUMIN組;D.1 μmol/L PURCUMIN組;E.5 μmol/L PURCUMIN組;F.10 μmol/L PURCUMIN組;G.5 μmol/L Curcumin 95%組;H.10 μmol/L Curcumin 95%組;與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05

注:A.空白組;B.模型組;C.0.5 μmol/L PURCUMIN組;D.1 μmol/L PURCUMIN組;E.5 μmol/L PURCUMIN組;F.10 μmol/L PURCUMIN組;G.5 μmol/L Curcumin 95%組;H.10 μmol/L Curcumin 95%組;與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05

注:A.空白組;B.模型組;C.0.5 μmol/L PURCUMIN組;D.1 μmol/L PURCUMIN組;E.5 μmol/L PURCUMIN組;F.10 μmol/L PURCUMIN組;G.5 μmol/L Curcumin 95%組;H.10 μmol/L Curcumin 95%組;與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05

注:A.空白組;B.模型組;C.0.5 μmol/L PURCUMIN組;D.1 μmol/L PURCUMIN組;E.5 μmol/L PURCUMIN組;F.10 μmol/L PURCUMIN組;G.5 μmol/L Curcumin 95%組;H.10 μmol/L Curcumin 95%組;與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05

3.4 相同給藥濃度、不同給藥時間兩種姜黃素制劑的抗炎作用比較

注:A.空白組;B.模型組;C.10 μmol/L PURCUMIN組;D.10 μmol/L Curcumin 95%組;與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05

注:A.空白組;B.模型組;C.10 μmol/L PURCUMIN組;D.10 μmol/L Curcumin 95%組;與空白組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05

4 討論

值得注意的是,在相同給藥時間、不同給藥濃度的抗炎作用實驗中,兩種姜黃素制劑的濃度設計并不完全對應,這一方面是由于在摸索給藥濃度的預實驗中,低濃度(0.5、1 μmol/L)的Curcumin 95%抗炎作用的差異無統計學意義;另一方面,從正式實驗的定量結果中可以看到,Curcumin 95%(5 μmol/L)給藥后除顯著降低IL-6水平之外,對其他炎癥因子及關鍵炎癥基因的抑制作用并不顯著,對NF-κB通路中關鍵蛋白表達也不存在顯著的調節作用,即5 μmol/L Curcumin 95%體外抗炎作用仍然較差?；谏鲜霰尘?筆者認為沒有必要設置低濃度(0.5、1 μmol/L)的Curcumin 95%組別,并在最終的實驗中取消了這兩個組別。