電針對功能性消化不良大鼠十二指腸CRHR2、NLRP6表達的影響

樂 薇,姚函伶,范建超,徐派的,吳貽森,楊格格

(1.武漢市中西醫結合醫院針灸科,湖北 武漢 430022;2.湖北中醫藥大學針灸骨傷學院,湖北 武漢 430061)

功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是較常見的胃十二指腸疾病之一,此類患者無明顯的器質性病變,常見癥狀有進食后飽脹、惡心、上腹部疼痛或上腹部燒灼感等,部分患者可伴發焦慮、抑郁等心理癥狀[1]。流行病學調查[2]顯示,FD全球發病率呈逐年上升趨勢,且復發率高,病情復雜,難以治愈。目前,研究多認為FD的發病與內臟高敏性、腦—腸軸功能紊亂、十二指腸炎癥等密切相關[3-5],其中十二指腸低度炎癥以及黏膜屏障的缺陷是誘發FD的關鍵因素。研究[6-8]表明,電針是治療FD的有效療法,也是當今功能性胃腸疾病的研究熱點。本研究通過多因素干預法復制FD大鼠模型,采用電針“印堂”“內關”“足三里”的方法干預FD大鼠,從大鼠一般狀態、胃腸動力、胃腸炎癥反應和黏膜通透性等方面,探討電針對FD大鼠十二指腸中促腎上腺皮質激素釋放激素受體2(corticotropin-releasing hormone receptor2, CRHR2)及NOD樣受體家族pyrin結構域蛋白6(NOD-like receptor family pyrin domain containing 6,NLRP6)表達的影響。

1 材料

1.1 實驗動物及分組 40只健康SPF級雄性SD大鼠,體質量(180±20)g,購自三峽大學動物實驗中心[動物生產許可證號:SCXK(鄂)2022-0012]。將大鼠喂養于湖北中醫藥大學SPF級實驗動物房,環境溫度20～26 ℃,濕度40%～60%,12 h晝夜交替,所有動物均自由攝食、飲水,適應性喂養1周。1周后隨機選擇10只大鼠作為空白組;剩余30只大鼠采取多因素干預法復制FD大鼠模型,模型復制14 d后隨機抽取10只大鼠作為模型組,另外抽取10只大鼠作為電針組。此次研究已通過湖北中醫藥大學實驗動物中心審批(倫理編號:HUCMS202203001),整個實驗期間的操作和處理均符合《湖北省動物管理條例》。

1.2 主要試劑 CRHR2抗體(貨號 25267-2-AP):武漢三鷹生物技術有限公司;NLRP6抗體(貨號 A15628):武漢愛博泰克生物科技有限公司;內參抗體GAPDH(貨號 GB12002)、RIPA裂解液(貨號 G2002)、BCA試劑盒(貨號 G2026)、蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染液套裝(貨號 G1003):武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 臺式高速冷凍離心機(型號 D3024R):北京大龍興創實驗儀器有限公司;轉印電泳儀(型號 SVT-2)、柯達膠片(型號 WGJP0001):武漢賽維爾生物科技有限公司;灰度分析軟件(型號 Innotech):Alpha Innotech。

2 方法

2.1 FD大鼠模型復制 采用多因素干預法[9]復制FD大鼠模型,即改良郭氏夾尾刺激法聯合不規則飲食及冰0.9%氯化鈉注射液灌胃法。①改良郭氏夾尾刺激法。用自粘繃帶呈螺旋狀包裹纏繞止血鉗,夾取大鼠尾端1/3處,給予大鼠刺激,引誘其與同籠大鼠相互打斗、撕咬。操作期間應及時松開止血鉗,避免長時間夾取一個部位,引發尾部缺血壞死。每籠大鼠夾尾30 min,每日2次,下一次夾尾操作需間隔4 h,連續夾尾14 d。夾尾結束后需要對大鼠尾部行常規無菌操作處理,以防尾部感染。②不規則飲食。清除單日剩余的飼料,逢雙日禁食;補充無菌水,保證正常飲水。③冰0.9%氯化鈉注射液灌胃法。取出提前冰凍的0.9%氯化鈉注射液,有少許注射液解凍至流動狀態后開始灌胃,每只2 mL,每日2次,共14 d。若大鼠出現少動、喜扎堆、毛發變黃如枯草狀、大便稀軟甚至呈水糊樣、進食量減少、體質量減輕,提示模型復制成功。

2.2 干預方法 電針組于模型復制結束后第2天開始給予電針干預,選取“印堂”(兩眼眶上緣最高點連線的中點)、“內關”(前肢內側,距腕關節約3 mm的尺橈骨縫間)、“足三里”(膝關節后外側,在腓骨頭下約5 mm處),定位參考《實驗動物常用穴位名稱與定位第2部分:大鼠》[10]。將大鼠穿好鼠衣后固定于鼠架上,暴露四肢,采用75%乙醇對穴位進行無菌操作后,手持一次性毫針(0.28 mm×25 mm)向下平刺“印堂”5 mm,直刺“內關”1 mm“足三里”7 mm。同側“內關”“足三里”連接1組電極,1只大鼠共連接2組電極,啟動華佗牌電針儀,選用連續波,頻率2 Hz,電流強度1 mA,控制四肢的振動幅度,避免劇烈抖動。操作完成后,拔出毫針并用無菌紗布按壓防止出血。模型組大鼠僅固定,不予電針。模型組和電針組每日干預1次,每次30 min,共干預14 d。

2.3 檢測指標

2.3.1 大鼠一般狀態 觀察并記錄各組大鼠實驗過程中毛發情況、活動度、大便性狀、進食量和體質量等變化情況。

2.3.2 大鼠胃排空率及小腸推進率 對大鼠進行末次電針干預結束后,進行禁食不禁水處理,于取材前稱質量。按文獻[11]的方法制備黑色半固體糊:用10 g羧甲基纖維素鈉溶于250 mL蒸餾水中,依次添加8 g糖、8 g淀粉、16 g奶粉和2 g活性炭末,順時針攪拌至無干粉狀態。每只大鼠灌胃3 mL,30 min后用2%戊巴比妥鈉(2 mL/kg)麻醉大鼠,麻藥起效后,將大鼠四肢固定于自制鼠板上,開腹,暴露胃及小腸,先用線結扎胃賁門及幽門,沿結扎處剪斷,取出全胃,用濾紙輕輕沾干血液后,放置于有干凈濾紙的微量電子秤上測量全胃質量。找到胃大彎,沿邊緣剪開胃體,置于裝有0.9%氯化鈉注射液的換藥碗中,清除胃內殘留物,洗凈后用濾紙吸干水分,再次放置于微量電子秤上稱質量,得到胃凈質量,根據公式推算胃排空率。胃排空率=[1-(全胃質量-胃凈質量)/灌胃量]×100%。稱質量后剪取胃竇部組織,再次洗凈后置于4%多聚甲醛中固定。剪取胃組織后,用鑷子分離與其他組織相連的腸管,取完整小腸組織,平展于空實驗臺,用軟尺測量幽門至黑色半固體糊最前端的長度,再次測量幽門和回盲部的總長度,并計算小腸推進率。小腸推進率=黑色半固體糊最前端長度/小腸總長度×100%。測量完畢后剪取多段十二指腸組織,沿腸壁一側剪開十二指腸,并用生理鹽水將十二指腸內容物清洗干凈,置于-80 ℃冰箱保存待用。

2.3.3 HE染色法觀察大鼠胃竇的組織形態 用4%多聚甲醛固定胃竇組織,隨機抽取已固定的胃竇組織送檢,每組5份,組織切片用蘇木精染色3～5 min后,自來水洗凈,用乙醇梯度脫水,加入伊紅染液中染色5 min,脫水后用中性樹膠封片,置于光學顯微鏡下,觀察每只大鼠胃竇組織形態。

2.3.4 Western blot法檢測大鼠十二指腸CRHR2、NLRP6蛋白表達水平 于每組中隨機取5份十二指腸組織,添加RIPA裂解液裂解后,提取蛋白,使用BCA試劑盒檢測蛋白濃度;調配10% SDS-PAGE凝膠,轉膜處理后,添加脫脂牛奶,室溫下封閉30 min;分別加入一抗CRHR2(1∶1 000)、NLRP6(1∶1 000),4 ℃恒溫培養過夜,用TBST快速洗膜3次后,添加二抗(1∶5 000),室溫培養30 min,添加混合好的ECL溶液曝光條帶,采用Image J圖像分析軟件對目的條帶灰度值進行分析。

2.3.5 阿利新藍染色法觀察大鼠十二指腸的組織形態 取凍存的十二指腸組織,石蠟包埋,超薄切片后,脫臘水洗,將切片浸泡于阿利新藍A染液中10 min,水洗后,用阿利新藍B染液浸染細胞核3 min,至細胞核清晰,脫水透明,樹膠封片。使用CaseViewer 2.2(3DHISTECH有限公司)選取組織的目的區域進行成像。

3 結果

3.1 模型復制前后3組大鼠一般狀態比較 模型復制前,3組大鼠均活潑好動,修飾行為較多,反應靈敏,糞便呈顆粒狀,毛發有光澤,進食量多,體質量增長較快,且3組大鼠體質量比較,差異無統計學意義(P>0.05)。模型復制14 d后,模型組和電針組大鼠喜扎堆,少動,常蜷臥于角落處,毛發發黃呈打結狀,大便稀軟或呈水糊樣,有腥臭味,進食量減少,體質量下降,與空白組比較,差異有統計學意義(P<0.05)。電針干預14 d后,電針組大鼠反應靈敏,動作迅速,活動及修飾行為增多,毛發整齊順滑,大便干燥,無明顯異味,進食量增加,體質量較模型組顯著上升(P<0.05)。見圖1。

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.2 3組大鼠胃竇的組織形態比較 光學顯微鏡下,空白組大鼠胃竇結構完整,細胞排列整齊,無異常增生。模型組大鼠胃竇基質的組織液增多,結締組織排列疏松,黏膜下層輕度水腫,伴有少量淋巴細胞浸潤。電針組大鼠胃竇固有層排列緊密,黏膜上皮完整,無明顯細胞脫落,各層肌纖維著色一致,細胞分界明晰,無炎癥細胞聚集。見圖2。

注:A.空白組;B.模型組;C.電針組;標尺示50 μm

3.3 3組大鼠胃排空率及小腸推進率比較 與空白組比較,模型組大鼠胃排空率、小腸推進率顯著降低(P<0.05)。與模型組比較,電針組大鼠胃排空率、小腸推進率顯著升高(P<0.05)。見圖3。

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;A.空白組;B.模型組;C.電針組

3.4 3組大鼠十二指腸組織中CRHR2、NLRP6蛋白表達水平比較 與空白組比較,模型組大鼠十二指腸組織中CRHR2、NLRP6蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)。與模型組比較,電針組大鼠十二指腸組織中CRHR2、NLRP6蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖4。

注:A.空白組;B.模型組;C.電針組;與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.5 3組大鼠十二指腸組織形態比較 與空白組比較,模型組大鼠十二指腸絨毛上皮細胞間隙增寬,黏膜不連續,腸絨毛結構細長、破碎,隱窩深度增加,杯狀細胞數減少。與模型組比較,電針組十二指腸絨毛上皮細胞間隙清晰、排列緊密、長短一致,組織結構粗壯、完整,隱窩深度下降,杯狀細胞數豐富。見圖5。

注:A.空白組;B.模型組;C.電針組;標尺示50 μm

4 討論

FD的發病機制尚未探明,目前認為十二指腸的異常是其重要的致病因素,主要表現為十二指腸的敏感性增高、黏膜通透性增大,進而導致黏膜屏障功能受損以及黏膜的低級別炎癥等[12]。十二指腸可歸屬于中醫學“小腸”范疇。當小腸的泌別清濁功能失常時,胃中食糜下傳受阻,小腸無法將水谷精微上輸至脾,亦無法將糟粕下傳至大腸,食糜滯留于胃腸,脾氣難升,胃氣難降,導致氣機升降失常,臨床可見腹部脹痛、噯氣、呃逆等不適,與FD癥狀相符。因此,本研究著眼于十二指腸功能,探討電針對FD大鼠十二指腸CRHR2、NLRP6蛋白表達的影響,旨在為FD的治療提供實驗依據。

研究[13]顯示,足三里、內關是治療FD的常用穴位,兩者合用可健脾理氣、和胃降逆。研究[14-15]發現,針刺足三里可降低白細胞介素類炎癥因子在腸組織中的表達水平,對腸道炎癥具有明顯調節作用;另一方面可加速胃腸黏膜DNA、RNA與蛋白質的合成,為胃腸道黏膜提供營養,加速胃腸道黏膜的修復。內關是手厥陰心包經的絡穴,針刺內關可增加腦血管數,使側支循環發揮代償作用,改善大腦局部缺血狀況,減輕神經元的損傷,可治療神志疾病;同時,內關也是八脈交會穴,通于陰維脈,陰維脈與足三陰經相聯系,均上行進入腹部,故針刺內關還可助脾化濕、理氣解郁,促進胃腐熟,可用于治療脾胃系統疾病[16]。肖夢麗等[17]采用關鍵詞共現分析法統計發現,抑郁、焦慮量表是FD相關文獻的高頻關鍵詞,說明FD與精神情志密切相關,抑郁、焦慮等負面情緒可加重FD患者胃腸不適癥狀。印堂穴屬督脈,是治療抑郁、焦慮的經典穴位[18],有調神解郁的功效。因此,本實驗采用“標本配穴”法,選取固護后天之本(脾胃)的“本穴”足三里,結合調理心神的“標穴”內關、印堂,共同發揮調理心神、標本兼治、最終調理脾胃氣機的作用。

腸道是人體最大的內分泌及免疫器官,對維持腸道穩態起著關鍵作用。其中,腸黏膜作為人體與外界環境接觸面積最大的組織,不僅能有選擇性地從外部攝取養分,還能抵御細菌及其代謝產物的入侵。完整的腸黏膜屏障是維持人體健康,避免組織損害和疾病的關鍵[19]。研究[20]表明,促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH)的激活是慢性應激誘導FD腸道通透性增強的重要因素,慢性應激觸發下丘腦—垂體—腎上腺軸的激活并增加CRH分泌,隨后,腸蛋白酶、組胺、5-羥色胺、炎癥因子等遞質表達增多,損害腸上皮細胞之間的細胞內緊密連接。CRHR2可調節慢性應激誘導肥大細胞脫顆粒,能夠激活腸道干細胞,有助于維持腸道黏液的正常分泌,并參與腸道微環境的穩態[21]。李曉紅等[22]采用單獨飼養加慢性捆綁束縛應激法連續刺激大鼠3周,成功復制肝郁脾虛證大鼠模型,發現肝郁脾虛證模型大鼠胃組織CRHR2水平顯著降低,大鼠出現胃部緊縮、胃排空延遲、胃敏感性升高等不適癥狀。此外,研究[23-25]發現,CRHR2參與調節小鼠結腸炎的黏膜修復,抑制血管生成及結腸癌細胞的生長,提示CRHR2對十二指腸炎癥反應存在正向調節作用。在本實驗中,模型組大鼠胃排空率、小腸推進率和CRHR2蛋白表達水平均明顯下降,這與李曉紅等[22]的研究結果一致,慢性應激可使FD大鼠胃腸運動減弱,腸黏膜功能受損。

NLRP6是NOD樣受體家族成員之一,主要分布于腸上皮細胞以及分泌腸道黏液的杯狀細胞中,可參與機體炎癥免疫應答和腸道微生態的調控。研究[26]證實,慢性應激可激活腦—腸軸應激信號CRH,異常升高的CRH能夠直接作用于腸上皮細胞并抑制NLRP6的表達,進而誘導腸道微生物群失常。此外,Bruce等[27]發現,NLRP6、CRHR2的表達水平與CRH存在負相關性,慢性應激可誘導FD,FD患者出現十二指腸杯狀細胞數量和黏蛋白胞吐減少,提示FD腸黏膜免疫的失常,同時十二指腸組織中NLRP6、CRHR2蛋白表達水平降低,表明FD患者十二指腸中下丘腦—垂體—腎上腺軸信號傳導失調可損害CRHR2的表達,使NLRP6自噬功能降低,導致腸道黏液分泌減少,從而增高腸道黏膜通透性,破壞腸上皮細胞的屏障功能。本實驗發現,模型組大鼠大便不成形,胃竇黏膜下層輕度水腫,黏膜層排列疏松,有輕度炎癥反應,十二指腸絨毛上皮細胞間隙增寬,腸絨毛變細、破碎,隱窩深度增加,杯狀細胞數減少。腸絨毛與營養物質的吸收有關,隱窩則與黏液的分泌相關,隱窩的深度與腸上皮細胞的成熟率呈負相關[28]。電針“印堂”“內關”“足三里”可調整FD大鼠大便性狀,改善胃竇炎癥反應,恢復十二指腸絨毛上皮細胞正常間隙,降低隱窩深度,提升杯狀細胞數,表明電針通過改善FD模型大鼠的一般狀態,減輕胃腸炎癥反應,提高十二指腸的吸收功能,增加腸上皮細胞成熟率及杯狀細胞數,從而降低胃腸黏膜通透性,恢復腸道的機械屏障功能,其作用機制可能與上調FD大鼠十二指腸組織中CRHR2、NLRP6的表達水平有關。

綜上所述,慢性應激可使FD大鼠出現精神欠佳、少動、毛發打結發黃、大便不成形等一般狀態的異常,胃排空率、小腸推進率降低,出現胃竇組織的炎癥反應,十二指腸組織的通透性增高,電針“印堂”“內關”“足三里”可增加FD大鼠十二指腸組織中CRHR2、NLRP6表達水平,進而改善FD模型大鼠一般狀態,增強胃腸動力,減輕胃竇炎癥細胞浸潤,激活腸道免疫,下調腸黏膜的通透性,參與維持腸道屏障的完整性。然而,電針是否通過調控腸道緊密連接或其他調節通路發揮下調腸黏膜通透性的作用,還需要進一步研究。