椴葉鼠尾草抗煙草花葉病毒活性成分研究

王子夫, 閆俊伊, 劉 洋, 吳江梅, 閆曉慧, 胡世俊

(1. 西南林業大學生物多樣性保護學院云南省森林災害預警與控制重點實驗室, 昆明 650224;2. 西南林業大學林學院, 昆明 650224)

病毒作為危害植物安全的病原之一,嚴重程度僅次于真菌,其中,煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus, TMV)是一種被研究較為深入的典型病毒[1],危害大、防治難[2],病毒粒子穩定,可侵染500種以上植物[3],對作物的栽培生產造成了嚴重的經濟損失。在我國大多數煙區中,煙草花葉病流行年份的田間發病率達50%以上[4],植株任意部位只要被TMV侵染,病毒就會在活體細胞內進行蛋白質外殼和核酸的復制,致使全株植物攜帶病毒[5]。TMV為單鏈RNA病毒,是發現最早的植物病毒,常用于抗病毒藥物的篩選和活性評價,是發現先導化合物及研究活性物質抗病毒機制常用的模式病毒[6]。

椴葉鼠尾草(SalviatiliifoliaVahl)是唇形科(Lamiaceae)鼠尾草屬(Salvia)的一年生草本雜草[7],原產于中美洲,后隨花卉引種進入昆明并迅速擴散,目前我國云南省及四川省均發現該種植物分布,且生長狀況良好,是一個具有高入侵風險的物種[8]。有研究發現,其成分克羅烷型二萜化合物dugesin F、tiliifolin E分別具有抗流感病毒FM1[9]和神經營養活性[10],tilifodiolide具有抗炎活性和鎮痛作用[11]。為加深對椴葉鼠尾草的資源化利用,本文對其全草進行化學成分及抗煙草花葉病毒活性測定,旨在為開發新型植物源抗病毒制劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

椴葉鼠尾草(Salviatiliifolia)全草于2018年9月采自云南昆明,植物樣品由西南林業大學林學院胡世俊副教授鑒定,標本存放于西南林業大學森林災害預警與控制重點實驗室。

1.1.2 病毒與寄主

煙草花葉病毒普通株系U1由云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所提供,在普通煙草K326(NicotianatabacumL.cv.K326)上繁殖,采用文獻[12]的方法對其進行純化,并保藏于-80 ℃冰箱中備用。TMV局部枯斑寄主心葉煙(Nicotianaglutinosa)用于半葉枯斑法實驗,漂盤育苗,并在無蟲溫室培育,待煙苗長至5片左右真葉時,挑選大小相似的健康植株供試。

1.1.3 儀器與試劑

AM-500 MHz、AV-600 MHz核磁共振儀(德國布魯克公司);HTC/Esquire質譜儀(德國布魯克公司);ZF-6三用紫外分析儀(254 nm和365 nm)(上海嘉鵬科技有限公司);N-1100旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司)。GF254薄層層析硅膠板、柱層析硅膠(青島海洋化工廠);Lichroprep RP-18反向硅膠柱層析材料(德國默克公司);Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB公司);甲醇、乙腈(色譜純,上海星可高純溶劑有限公司);甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿和丙酮(化學純,云南利妍科技有限公司)經重蒸后使用;二甲基亞砜(分析純,天津市光復精細化工研究所);8%寧南霉素水劑(德強生物股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 提取與分離

椴葉鼠尾草風干粉碎后干質量為5.00 kg,用95%乙醇加熱回流提取3 h,共計4次后合并提取液,用旋轉蒸發儀回收溶劑,得乙醇提取物,加蒸餾水充分溶解,依次用石油醚、乙酸乙酯同體積萃取3次,合并萃取液并減壓濃縮干燥得石油醚萃取物(113.82 g)、乙酸乙酯萃取物(11.02 g)。

石油醚萃取物經硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=100∶1～1∶1,體積比)梯度洗脫,TLC檢測合并相同成分后得9個餾分(Fr1～Fr9)用于活性測定。

乙酸乙酯萃取物經硅膠柱層析(石油醚∶丙酮=30∶1～1∶1,體積比)梯度洗脫得7個餾分(Fr1′～Fr7′),Fr4′經(三氯甲烷∶甲醇=1∶1,體積比)凝膠柱色譜分離得3個餾分(Fr4′.1～Fr4′.3),Fr4′.1經MCI(甲醇∶水=1∶0～0∶1,體積比)脫去色素得4個餾分(Fr4′.1.1～Fr4′.1.4),Fr4′.1.2經正相硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=30∶1～10∶1,體積比)梯度洗脫得5個餾分(Fr4′.1.2.1～Fr4′.1.2.5),Fr4′.1.2.1經正相硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1,體積比)洗脫,重結晶后得35.30 mg化合物2。Fr4′.1.2.2經(三氯甲烷∶甲醇=1∶1,體積比)凝膠柱色譜分離得4.20 mg化合物3。Fr4′.2經(三氯甲烷∶甲醇=1∶1,體積比)凝膠柱色譜分離得3.60 mg化合物4。Fr4′.3經(三氯甲烷∶甲醇=1∶1,體積比)凝膠柱色譜分離得5.20 mg化合物5。Fr5′經(三氯甲烷∶甲醇=1∶1,體積比)凝膠柱色譜分離得3個餾分(Fr5′.1～Fr5′.3),Fr5′.2經正相硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯=8∶1～1∶1,體積比)梯度洗脫得7個餾分(Fr5′.2.1～Fr5′.2.7),Fr5′.2.1經(三氯甲烷∶甲醇=1∶1,體積比)凝膠柱色譜分離得30.10 mg化合物1。

1.2.2 抗TMV侵染活性測定

萃取物、化合物分別用DMSO溶解,配制成100 mg/mL萃取物和10 mg/mL化合物于4 ℃冰箱保存。臨用時用蒸餾水將萃取物稀釋至1 mg/mL,化合物稀釋至50 μg/mL,陽性對照8%寧南霉素水劑稀釋至50 μg/mL。

采用活體半葉枯斑法,選擇健康且長勢一致的心葉煙,每株挑選中上部大小相似的3片葉,每片葉的一半用提取物處理,另一半對照用相同濃度的DMSO水溶液處理,用3種方式進行施藥:(1)先施藥:接種病毒前6 h將提取物噴灑在煙葉上,測定提取物對寄主植物煙草的保護作用;(2)后施藥:接種病毒6 h后將提取物噴灑在煙葉上,測定提取物對接種病毒煙苗的治療作用;(3)混合施藥:將提取物與病毒混合30 min后摩擦接種在煙葉上,測定提取物對病毒本身的鈍化作用。病毒稀釋400倍后通過金剛砂摩擦接種至葉片,待稀釋液揮發完全,用蒸餾水將殘余金剛砂沖洗干凈。將煙苗放入無蟲溫室培育,3 d后枯斑癥狀明顯,統計枯斑數,每個處理重復3次,按公式計算抑制率:

1.2.3 抑制病毒增殖活性測定

選取生長健康,長勢一致的普通煙,以噴施50 μg/mL的單體化合物作為處理;噴施同等質量濃度的DMSO水溶液作為對照;噴施相同質量濃度的寧南霉素作為陽性對照。整株均勻施藥24 h后,每株煙選擇上部一片葉摩擦接種TMV,待葉片溶液揮發完全后將金剛砂洗凈,放入無蟲溫室培養。健康對照噴施相應質量濃度的DMSO,不接種TMV。在培養3、5、7 d時分別用打孔器取直徑為1 cm的葉圓片,每片葉取10個圓片放入離心管,保存于-80 ℃冰箱,每個處理重復3次,取樣完成后以間接ELISA法測定OD405值[13]。

1.3 數據處理

根據抑制率公式計算出椴葉鼠尾草各萃取物與各化合物對TMV抑制率。并用SPSS 17.0軟件對同種作用方式不同提取物和化合物的抑制率進行方差分析和LSD差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 化合物結構

從椴葉鼠尾草中共分離出5個化合物,根據理化性質及波譜數據鑒定化合物為(1)tilifodiolide[14];(2)eupa-tori acid[15];(3)ursolic acid(熊果酸)[16];(4)oleanolic acid(齊墩果酸)[17];(5)2-methyl-5,7-dioxy chromone(2-甲基-5,7-二羥基色原酮)[18],包括3個三萜類化合物、1個二萜類化合物和1個色酮類化合物,見圖1。

圖1 5種化合物結構Figure 1 Structures of five compounds

2.2 萃取物抗TMV侵染活性

萃取物抗TMV侵染活性結果見表1,研究發現石油醚萃取物對心葉煙的保護作用較強,抑制率為40.95%,與陽性對照寧南霉素(49.12%)無顯著差異;乙酸乙酯萃取物對心葉煙具有一定的保護作用,抑制率為24.72%,顯著低于陽性對照寧南霉素。乙酸乙酯萃取物對心葉煙的治療作用最強,抑制率達52.85%,高于陽性對照寧南霉素(35.97%),石油醚萃取物治療作用抑制率為30.61%,低于陽性對照寧南霉素。石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物對TMV鈍化作用的抑制率分別為52.85%和48.66%,與陽性對照寧南霉素(51.26%)無顯著差異。

表1 椴葉鼠尾草各萃取物抗TMV侵染活性Table 1 Anti TMV activity of Salvia tiliifolia extracts

2.3 石油醚餾分抗TMV侵染活性

采用半葉枯斑法對石油醚萃取物的9個餾分進行抗TMV活性測定(表2),發現各餾分對TMV均有一定的抑制作用。Fr7、Fr1、Fr9餾分對心葉煙的保護作用較強,抑制率分別為40.51%、35.16%、32.53%,與陽性對照寧南霉素(54.65%)無顯著差異,其余餾分抑制率在10.12%～27.73%。Fr7、Fr5餾分對心葉煙的治療作用較強,抑制率分別為45.52%、35.20%,與陽性對照寧南霉素(47.58%)無顯著差異,其余餾分在治療作用中的抑制率為11.16%～26.95%。Fr6餾分對心葉煙的鈍化作用最強,抑制率為74.63%,顯著高于陽性對照寧南霉素(53.03%),此外Fr3、Fr9、Fr4、Fr5的鈍化作用也較強,抑制率依次為62.17%、50.03%、47.51%、42.31%,與陽性對照寧南霉素無顯著差異,其余餾分鈍化作用抑制率在7.41%～30.81%。

表2 椴葉鼠尾草石油醚餾分抗TMV侵染活性Table 2 Anti TMV activity of petroleum ether fractions from Salvia tiliifolia

2.4 乙酸乙酯餾分抗TMV侵染活性

表3為乙酸乙酯萃取物的7個餾分抗TMV活性結果,結果表明,Fr1′、Fr3′餾分對心葉煙的保護作用最強,抑制率為61.77%、55.22%,與陽性對照寧南霉素(54.65%)無顯著差異,其余餾分保護作用的抑制率在12.89%～22.22%。在治療作用中Fr3′餾分活性最強抑制率為55.02%,高于陽性對照寧南霉素(47.58%),其次為Fr7′抑制率為47.75%,與寧南霉素無顯著差異,除Fr2′無治療作用外,其余餾分治療作用的抑制率為11.94%～33.31%。餾分Fr4′、Fr7′、Fr3′、Fr5′對TMV均有較強的鈍化作用,抑制率分別為60.22%、54.93%、52.48%、44.55%,與寧南霉素(53.03%)無顯著差異,除Fr1′無鈍化活性外,其余餾分鈍化作用的抑制率在24.35%～37.02%。

表3 椴葉鼠尾草乙酸乙酯餾分抗TMV侵染活性Table 3 Anti TMV activity of Salvia tiliifolia ethyl acetate fractions

2.5 化合物抗TMV侵染活性

對乙酸乙酯萃取物分離出的5個化合物進行抗TMV活性測定(表4),化合物1、化合物4表現出較弱的保護作用,抑制率分別為3.94%和17.45%,顯著低于陽性對照寧南霉素。在治療作用中,各化合物對TMV的侵染均有一定的抑制作用,抑制率在5.60%～23.73%,顯著低于陽性對照寧南霉素,其中,化合物2治療作用較好,抑制率為23.73%,其次為化合物5,抑制率為18.55%。在鈍化作用中,各化合物對TMV的侵染均有一定的抑制作用,抑制率在6.61%～26.29%,但均顯著低于陽性對照寧南霉素,其中,化合物2的鈍化作用較強,抑制率為26.29%。

表4 化合物抗TMV侵染活性Table 4 Anti TMV activity of compounds

2.6 抑制病毒增殖活性

通過普通煙葉圓片法與ELISA間接法相結合,檢測3、5、7 d時葉片中病毒外殼蛋白含量積累情況,測定OD405值以反映化合物是否具有抑制病毒活性。ELISA法檢測結果顯示(圖2),3 d與7 d時化合物5和5 d時化合物4處理的煙葉中病毒積累量小于寧南霉素,有較好的抑制病毒活性作用。全部化合物的OD405值均比健康對照的數值高,但比對照病葉的數值低,因此化合物都具有一定的抑制病毒活性。

圖2 化合物ELISA間接法檢測結果Figure 2 Compound ELISA indirect method test result

3 討論與結論

通過心葉煙活體半葉枯斑法,測定了椴葉鼠尾草石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、上述兩種萃取物不同柱層析餾分以及從乙酸乙酯萃取物中分離出的5個單體化合物對TMV侵染的抑制活性,研究發現石油醚萃取物對TMV浸染心葉煙具有較強的保護作用(40.95%),與陽性對照寧南霉素(49.12%)無顯著差異,并且該萃取物對TMV的鈍化作用也最強(52.85%),高于陽性對照寧南霉素(51.26%);乙酸乙酯萃取物的治療作用最強(52.85%),高于陽性對照寧南霉素(35.97%)。對萃取物各餾分的活性結果比較發現,不同餾分間活性有明顯差異,在石油醚萃取物各餾分中,Fr7的保護作用和治療作用最好;Fr6的鈍化作用最好。乙酸乙酯萃取物各餾分中,Fr1′的保護作用最強;Fr3′的治療作用最強;Fr4′的鈍化作用最強。說明活性成分具有一定集中性,可能是因為不同餾分中化合物極性不同導致的活性差異,在后續的研究中需進一步通過活性追蹤尋找具體活性成分。

在分離出的化合物中,化合物4(齊墩果酸)的保護作用與抑制病毒活性作用最強,化合物2(eupatoric acid)的治療作用與鈍化作用最強,這兩個化合物均為三萜類化合物。我們前期研究也曾發現苦木素等三萜類成分具有較好的抗TMV活性[19]?；衔锵噍^于萃取物與各餾分,抑制率有較大差異,可能是因為分離出的化合物主要富集在乙酸乙酯萃取物Fr4′和Fr5′餾分,該餾分段雖有較好的鈍化作用,但保護作用和治療作用相對較弱,還可能因為植物中含有多種化學成分,各成分間出現復雜的作用關系,從而產生拮抗效應或協同效應[20],Chen等[21]在研究苦木的抗TMV活性時曾發現其中的生物堿和苦木素存在協同增效作用。

煙草花葉病毒是一種寄生性的系統侵染病毒,病毒粒子入侵寄主獲取營養完成生活與繁殖,與寄主融為一體同時破壞寄主組織細胞,因此,目前的抗病毒藥劑很難在不傷害寄主植物的情況下選擇性殺死病毒,普通藥劑對病毒只有短時間的效果,長期使用會使病毒產生耐藥性且對植物有一定副作用,而植物源抗病毒制劑具有易降解、組分多元、選擇性強等優勢,所以本文對椴葉鼠尾草化學成分進行了抗TMV侵染活性測定,發現其化學成分對TMV具有一定程度的抑制作用,可為資源化利用入侵植物椴葉鼠尾草,為其變廢為寶提供一定的理論依據。