納米花固定化蔗糖酶的研究

崔詩琦, 姜曉冬, 王世杰, 王紅英, 錢斯日古楞

(大連工業大學生物工程學院, 大連 116034)

蔗糖酶(Sucrase)被廣泛應用于食品和化工行業,是最常用的生物酶類之一[1]。蔗糖酶可將蔗糖水解成葡萄糖和果糖[2],產生的果糖甜度高,不易結晶,因此非結晶糖漿生產過程中使用蔗糖酶是其最重要的應用之一[3-4]。但蔗糖酶存在使用中容易失活,穩定性較差,難以回收等缺點[5]。

固定化技術[6]采用物理或化學手段,將酶固定在載體上,保持酶活性的同時,提高酶的穩定性和回收利用率[7]。納米花固定化酶技術屬于共價偶聯法,是最近研究的熱門領域[8]。無機雜化納米花可以增加酶蛋白質的結構剛性,提高酶的穩定性,形成的特殊花瓣結構有利于酶的活性表現,因此,能夠明顯提高酶的活性[9-14]。Hua等[15]報道了一種脂肪酶雜化納米花,其催化活性是游離脂肪酶的25倍;值得注意的是,經過20次循環使用后,脂肪酶雜化納米花仍可用于催化反應,轉化率達到90%。Ge等[16]發現,由 Cu2+與有機成分自組裝構成的單酶-金屬離子雜化納米花固定化酶的活性和穩定性等均比以前明顯提高。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

蔗糖酶(8.13 U/mg)由大連工業大學生物工程實驗室提供;3,5-二硝基水楊酸(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司;葡萄糖(分析純)購自北京奧博星生物技術有限責任公司;四水合氯化錳(分析純)購自西隴科學股份有限公司;其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 主要儀器

熱場發射掃描電鏡(日本電子,JSM-7800F);透射電鏡(日本電子株式會社,JEM-2100);傅里葉紅外光譜儀(美國PerkinElmer公司);X射線衍射儀(日本島津,XRD-7000S);分光光度計(計梅特勒-托利多儀器)。

1.2 方法

1.2.1 蔗糖酶活力測定

葡萄糖標準曲線的繪制,以葡萄糖為標準物,采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法;回歸方程式:Y=2.427 7X-0.062 6,R2=0.980 9。

將1 mL待測酶溶液與10 mL 10%的蔗糖溶液(pH 6.0的磷酸緩沖液配制)混合,在30 ℃水浴中準確反應10 min,得到水解液;量取0.5 mL水解液和1.5 mL DNS試劑與1.5 mL去離子水混合,在沸水中反應5 min以上;冷卻后用去離子水定容至25 mL,并在540 nm處測定其吸光值;未加水解液的做空白對照[17]。

其中,Em為標準曲線對應540 nm吸光值上讀出的葡萄糖質量,單位為mg。

酶活定義:在pH 6.0、30 ℃條件下,每分鐘水解產生1 μmol還原糖的酶量為一個酶活力單位(U/mL)。

1.2.2 Sucrase@Mn3(PO4)2制備

將一定量的酶液用60 mmol/L PBS溶液(pH 7.4)溶解,與一定量的0.5 mg/mL MnCl2溶液混勻后在一定溫度條件下靜置反應;反應液在6 000 r/min條件下離心10 min;棄上清液,沉淀用去離子水沖洗3次,冷凍干燥后獲得粉末狀固定化酶[18]。

1.2.3 Sucrase@Mn3(PO4)2制備條件優化

(1)最適酶添加量。固定化酶制備中設定0.25、0.75、1、2、3 mL蔗糖酶溶液(0.1 mg/mL)添加量,分別與10 mL 0.01g/mL的MnCl2溶液和18 mL 10 mmol/L PBS緩沖液(pH 7.4)混合,并用去離子水定容至31 mL,在20 ℃條件下靜置反應3 h,制備固定化酶;通過酶活比較,確定制備固定化酶的最適酶添加量。(2)最適PBS濃度。PBS溶液(pH 7.4)濃度分別設定為5、10、15、20、25 mmol/L,與1 mL蔗糖酶溶液(0.1 mg/mL)與10 mL 0.01g/mL 的MnCl2溶液混合,20 ℃條件下靜置反應3 h,制備固定化酶;通過酶活比較,確定制備固定化酶的最適PBS濃度。(3)最適Mn2+質量濃度。Mn2+質量濃度分別設定為0.73、1.46、2.2、2.93、3.67 g/mL,與1 mL蔗糖酶溶液(0.1 mg/mL)和18 mL 10 mmol/L PBS緩沖液(pH 7.4)混合,20 ℃條件下靜置反應3 h,制備固定化酶;通過酶活比較,確定制備固定化酶的最適Mn2+質量濃度。(4)最適pH值條件。PBS緩沖液(10 mmol/L)的pH值分別設定為5.4、6.4、7.4、8.4及9.4,與1 mL蔗糖酶溶液(0.1 mg/mL)和1.46 g/mL Mn2+溶液混合,20 ℃條件下靜置反應3 h,制備固定化酶;通過酶活比較,確定制備固定化酶的最適pH值。(5)最適反應溫度。將1 mL蔗糖酶(0.1 mg/mL)與1.46 g/mL Mn2+溶液、18 mL PBS緩沖液(pH 7.4、10 mmol/L)混合,分別在15、20、25、30和35 ℃溫度下靜置反應3 h,制備固定化酶;通過酶活比較,確定制備固定化酶的最適反應溫度。(6)最適反應時間。將1 mL蔗糖酶(0.1 mg/mL)與1.46 g/mL Mn2+溶液、18 mL PBS緩沖液(pH 7.4、10 mmol/L)混合,在20 ℃條件下分別靜置反應0.5、1、3、6、9 h,制備固定化酶;通過酶活比較,確定制備固定化酶的最適反應時間。

1.2.4 Sucrase@Mn3(PO4)2的形態及結構表征

采用SEM技術、TEM技術、紅外光譜技術、X衍射技術和EDS能級色譜技術對制備的固定化酶形貌特征、成分特征、結構特征等進行表征。

1.2.5 Sucrase@Mn3(PO4)2的酶學性質

(1)溫度變化對酶活的影響。固定化酶的活力分別在20、30、40、50和60 ℃條件下測定,通過比較酶活力,分析反應溫度變化對酶活的影響,確定固定化酶的最適反應溫度。(2)酸堿變化對酶活的影響。固定化酶的活力分別在pH 4、5、5.6、6、6.6、7、8條件下測定,通過比較酶活力,分析環境酸堿變化對酶活的影響,確定固定化酶的最適反應pH值。(3)固定化酶的熱穩定性。將固定化酶分別在25、35、45、55和65 ℃條件下保溫2 h,冷卻后在30 ℃條件下測定酶活,比較酶活力,確定固定化酶的溫度穩定性。(4)固定化酶的酸堿穩定性。將固定化酶分別在pH 4～11 BR緩沖液中4 ℃放置2 h,在30 ℃、pH 5條件下測定酶活,比較酶活力,確定固定化酶的酸堿穩定性。(5)固定化酶的重復利用率。將固定化酶在30 ℃、pH 5條件下重復測定酶活,比較和分析酶活變化,確定固定化酶的重復利用率。固定化酶的回收,采用6 000 r/min離心10 min與去離子水沖洗3次的方法。(6)固定化酶的儲存穩定性。將固定化酶在4 ℃條件下保存28 d;期間每隔7 d測定1次酶活,比較和分析酶活變化,確定固定化酶的儲存穩定性。

2 結果與分析

2.1 Sucrase@Mn3(PO4)2制備條件的優化

2.1.1 酶的添加量對固定化酶制備的影響

蔗糖酶添加量對Sucrase@Mn3(PO4)2制備的影響如圖1所示。在添加設定范圍內,當酶的添加量為1 mL(0.1 mg/mL)時,固定化酶活力達最高值;隨后酶活力急劇下降,這是由于酶質量濃度增大,形成的納米花結構緊密、花瓣收緊,不利于酶蛋白與底物接觸反應。因此制備納米花固定化蔗糖酶的最適酶添加量選定為1 mL。

圖1 酶的添加量對固定化酶活力的影響Figure 1 Effect of enzyme addition on the activity of immobilized enzyme

2.1.2 PBS濃度對固定化酶制備的影響

PBS濃度對Sucrase@Mn3(PO4)2制備的影響如圖2所示。PBS濃度在5～10 mmol/L范圍內,固定化酶的活力隨PBS濃度的增加而提高;當PBS濃度為10 mmol/L時酶活力達最高值,隨后其活力緩慢下降,因此制備納米花固定化蔗糖酶的最適PBS濃度選定為10 mmol/L。

圖2 PBS濃度對固定化酶活力的影響Figure 2 Effect of PBS concentration on the activity of immobilized enzyme

2.1.3 Mn2+質量濃度對固定化酶制備的影響

Mn2+質量濃度對Sucrase@Mn3(PO4)2制備的影響如圖3所示。Mn2+質量濃度為1.46 mg/mL時,固定化酶活力達最高值,隨后活力持續下降,因此制備納米花固定化蔗糖酶Mn2+的最佳添加質量濃度選定為1.46 mg/mL。

圖3 Mn2+質量濃度對固定化酶活力的影響Figure 3 Effect of Mn2+ mass concentration on the activity of immobilized enzyme

2.1.4 pH值對固定化酶制備的影響

pH值的變化對Sucrase@Mn3(PO4)2制備的影響如圖4所示。制備環境pH值由弱酸性變為中性時酶活力持續提高,到達pH 7.4時固定化酶活力達最高值,隨后下降,最后選定pH 7.4為制備納米花固定化蔗糖酶的最適pH值。

圖4 pH值的變化對固定化酶活力的影響Figure 4 Effect of pH change on the activity of immobilized enzymes

2.1.5 反應溫度對固定化酶制備的影響

反應溫度對Sucrase@Mn3(PO4)2制備的影響如圖5所示。隨反應溫度的提高,固定化酶活力提升,20 ℃時酶活力達最高值,隨后其活力持續下降,因此,20 ℃為制備納米花固定化蔗糖酶的最適反應溫度。

圖5 反應溫度對固定化酶活力的影響Figure 5 Effect of reaction temperature on the activity of immobilized enzyme

2.1.6 反應時間對固定化酶制備的影響

反應時間對Sucrase@Mn3(PO4)2制備的影響如圖6所示。反應時間為1 h時,固定化蔗糖酶的活力達到最高值,此后隨著制備時間的增加,其活力逐漸下降,因此選擇反應時間1 h為制備固定化酶的最適反應時間。

圖6 反應時間對固定化酶活力的影響Figure 6 Effect of reaction time on the activity of immobilized enzyme

2.2 Sucrase@Mn3(PO4)2的形態結構

2.2.1 微觀形貌表征

通過 SEM技術和TEM技術對Sucrase@Mn3(PO4)2的形態結構進行表征,結果如圖7所示。Sucrase@Mn3(PO4)2具有多級結構,構成的花瓣間緊密附著,結構均勻,分散性良好。以上結構特征增加了酶與底物的接觸面積,并且對酶起支撐和保護作用,有利于酶活表現。

(a)2 000倍SEM圖;(b)10 000倍SEM圖;(c)3 000倍TEM圖;(d)25 000倍TEM圖。圖7 Sucrase@Mn3(PO4)2的SEM圖和TEM圖Figure 7 SEM and TEM images of Sucrase@Mn3(PO4)2

2.2.2 EDS特征

圖8 Sucrase@Mn3(PO4)2能級色譜圖Figure 8 Sucrase @ Mn 3 (PO4) 2 energy level chromatogram

2.2.3 FT-IR吸收特征

圖9 Sucrase@Mn3(PO4)2、Mn3(PO4)2和Sucrase的FT-IR光譜圖Figure 9 The FT-IR spectrum of Sucrase @ Mn3 (PO4) 2, Mn3 (PO4) 2, and Sucrase

2.2.4 XRD分析

為探究固定化是否對納米花晶型產生影響,利用XRD對Sucrase@Mn3(PO4)2晶體結構進行分析,結果如圖10所示。Sucrase@Mn3(PO4)2與Mn3(PO4)2的標準卡片(JCPDS 03-0426)在2θ為25.94°、29.66°、34.33°等處的衍射峰相對應,強度也大致相同,表明固定化后納米花晶體結構未發生變化,保持原有結晶度[20]。

圖10 Sucrase@Mn3(PO4)2的X衍射圖Figure 10 The X diffraction pattern of Sucrase @ Mn3 (PO4) 2

2.3 Sucrase@Mn3(PO4)2的酶學性質

2.3.1 最適反應溫度

反應溫度對酶活的影響見圖11。Sucrase@Mn3(PO4)2的活性在30 ℃時達到最高值,且比游離酶的提高5 ℃;隨后其活力持續下降,但反應溫度60 ℃時,固定化酶的活力仍保持其最高活力的近50%;因此確定30 ℃為Sucrase@Mn3(PO4)2的最適反應溫度。

圖11 固定化酶和游離酶的最適反應溫度Figure 11 Optimal reaction temperature for the immobilized and free enzymes

2.3.2 最適反應pH值

反應pH值對酶活的影響如圖12所示。納米花Sucrase@Mn3(PO4)2的活性在pH 5時達到最高值,這比其游離酶的最適pH 6向酸性方向移位;在測定酸性條件下固定化酶均保持較高活性;最終確定pH 5為Sucrase@Mn3(PO4)2的最適反應pH值。

圖12 固定化酶和游離酶的最適反應pH值Figure 12 Optimal reaction pH for immobilized and free enzymes

2.3.3 固定化酶的耐熱穩定性

Sucrase@Mn3(PO4)2溫度穩定性測定如圖13所示。在測定25～65 ℃范圍內,固定化酶和游離酶活力均有下降,但固定化酶的活力下降比游離酶的緩慢,且保持相對較高活力,表明納米花固定化蔗糖酶表現出良好的熱穩定性。

圖13 固定化酶和游離酶的耐熱穩定性Figure 13 Thermal stability of immobilized and free enzymes

2.3.4 固定化酶的酸堿穩定性

固定化酶的酸堿穩定性測定結果如圖14所示。Sucrase@Mn3(PO4)2的活性在測定pH 4～11范圍內均保持其最高活力的60%以上,說明Sucrase@Mn3(PO4)2表現出良好的酸堿穩定性;同時發現,蔗糖酶被納米花固定化時其pH穩定性比其游離酶的提高一倍左右。

圖14 固定化酶和游離酶的酸堿穩定性Figure 14 Acid-base stability of the immobilized and free enzymes

2.3.5 固定化酶的重復利用率

Sucrase@Mn3(PO4)2重復利用率結果如圖15所示。固定化酶隨利用次數的增加而其活力下降,但重復利用7次時其殘余活力仍保持其初始活力的近40.38%,說明Sucrase@Mn3(PO4)2表現出較好的重復利用率。

圖15 固定化酶的重復利用率Figure 15 Reuse rate of immobilized enzyme

圖16 固定化酶和游離酶的儲存穩定性Figure 16 Storage stability of immobilized and free enzymes

2.3.6 固定化酶的儲存穩定性

在4 ℃儲存過程中,Sucrase@Mn3(PO4)2的酶活隨儲存時間的延長而下降,但活力下降速度要比其游離酶緩慢,在28 d時固定化酶的活力仍保持其初活力的50%以上,說明Sucrase@Mn3(PO4)2表現出良好的儲存穩定性。

3 討論

酶在工業化應用中表現出難以回收利用和穩定性差等缺點。納米花固定化酶具有展開的花瓣結構,酶在花瓣上均勻分散分布,以上結構特征增加了比表面積,有利于酶與底物的接觸,加強酶的空間構型,提高酶的催化活力及重復利用率等[21]。徐沁蕊[22]在固定化纖維二糖差向異構酶的研究中發現,酶質量濃度為0.10 mg/mL,Co2+濃度為1.6 mmol/L時制備的納米花固定化酶的活力比其自由酶的提高了1.49倍;朱衡等[23]利用羧基載體LX-1000IDA對脂肪酶進行固定化,并重復利用4次時其活力仍保持最初活力的50%以上;彭開敏等[24]利用豬肝酯酶與磷酸鈣制備的納米花固定花酶重復利用6次后其活力仍保持最初活力的10%以上。本研究利用錳離子、磷酸根離子與蔗糖酶制備的納米花固定化酶,其酶活力比游離酶的提高2.49倍;重復利用7次時,其活力仍保持最初活力的40%以上,這一結果與以上納米花固定化酶研究結果一致。

盡管本研究成功制備了有機-無機雜化納米花固定化蔗糖酶,且表現出較好的酶活性和重復利用率,但其熱穩定性、酸堿穩定性等酶學性質仍有進一步提升的空間。未來需要對其他金屬離子誘導組裝[25]的蔗糖酶納米花制備進行研究,并通過酶學性質、結構特性的比較,進一步解析固定化蔗糖酶納米花形成的機制,從而強化蔗糖酶納米花的酶學性質,提高蔗糖酶的使用性能。同時,未來可以針對蔗糖酶進行酶分子改造[26],提高其相關催化性能,強化納米花酶的固定化率,提高酶活力等。

綜上所述,本文利用錳離子、磷酸根離子與蔗糖酶制備的有機-無機雜化納米花固定化酶,不僅制備成本低,過程綠色、高效,而且制備的固定化酶表現出較好的穩定性和重復利用率,拓展了蔗糖酶的應用范圍,為工業化大規模應用提供參考。

4 結論

本研究通過向含有蔗糖酶的磷酸鹽緩沖溶液中滴加錳離子制備得到納米花固定化酶Sucrase@Mn3(PO4)2。最佳制備條件:在pH 7.4條件下,向濃度為10 mmol/L 的PBS緩沖液中添加1 mL 0.1mg/mL蔗糖酶、1.46 g/mL Mn2+溶液, 20 ℃條件下充分混勻后靜置反應1 h,制備的Sucrase@Mn3(PO4)2酶活性最高。通過SEM技術、TEM技術、紅外光譜技術、X衍射和EDS能級色譜技術進行測定和分析發現,納米花固定化酶的結構為盛開的花朵狀,具有多級結構,構成的花瓣間緊密附著,納米花結構均勻,分散性良好。Sucrase@Mn3(PO4)2在其最適反應條件下,即pH 5,反應溫度30 ℃,其酶活是游離酶的2.49倍。Sucrase@Mn3(PO4)2具有一定的儲存穩定性,但較長時間儲存過程中存在酶活下降的現象,原因有待進一步研究。該固定化蔗糖酶連續測定酶活7次時,其活力仍保持最初活力的40.38%。因此在進一步提高Sucrase@Mn3(PO4)2重復利用性及儲存穩定性后,在工業應用上具有巨大潛力。