鴨源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

郭偉娜, 王紫葦, 馬佰賀, 王 旋

(1.安徽科技學院 動物科學學院,安徽 鳳陽 233100;2.動物營養調控與健康安徽省重點實驗室,安徽 鳳陽 233100)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,Pm)是一種具有莢膜、沒有鞭毛和芽孢的革蘭陰性菌,瑞氏染色或美藍染色表現為明顯的兩極濃染現象,在世界各地分布廣泛。Pm可感染哺乳動物、鳥類、禽類、爬行動物甚至人類,引起急性出血性敗血癥和慢性肺炎、萎縮性鼻炎、皮膚壞死、腦膜炎等,病死率較高,對我國畜牧業的健康發展和公共衛生安全影響較大[1-2]。目前,Pm根據莢膜多糖抗原結構的不同,分為A、B、D、E、F等5個血清型;根據脂多糖結構的差異,分為16個血清型[3-4]。其中,A型、B型和E型Pm菌株主要引起牛出血性敗血癥,D型Pm菌株主要引起豬傳染性萎縮性鼻炎,A型Pm菌株能夠引起豬的肺疫,而禽霍亂多數是由A型和F型Pm菌株引起,但也有報道分離到莢膜B型的雞源Pm菌株[5]。多殺性巴氏桿菌對雞、鴨、鵝具有高度易感性,引起的出血性敗血癥又稱為禽霍亂,發病較為嚴重,病死率較高,對養禽業造成重大的經濟損失[6-7]。長期以來,抗菌藥物的使用是防治禽霍亂等細菌病的常用方法之一,但是由于臨床上不規范的藥物使用或濫用導致常用藥物效果降低,所產生的耐藥性非常嚴重[8-9]。研究表明,養殖場嚴格的飼養管理制度以及合理的疫苗免疫是預防該病的關鍵措施[10]。本研究主要是從一例疑似禽霍亂的病死鴨肝臟中進行病原菌的分離鑒定及藥敏試驗,為深入研究多殺性巴氏桿菌的致病機理和防控提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

血瓊脂培養基和藥敏紙片購于比克曼生物科技(湖南常德)有限公司。普通營養瓊脂培養基、麥康凱培養基購于海博生物(青島)有限公司。PCR MasterMix預混液、50×TAE緩沖液、DL-2000 DNA Marker等均購于生物工程(上海)有限公司。

1.2 樣品采集

安徽某養鴨場送檢的4只20日齡病死肉鴨,剖檢后發現心冠脂肪有出血,肺臟也有出血點或出血斑,肝臟病變最典型,腫大變脆,表面有大量針尖大小的灰白色壞死點,如圖1所示。疑似禽霍亂,無菌采集其肝臟組織進行病原的分離鑒定。

圖1 病死鴨的剖檢病變Fig.1 Pathological changes of dead ducks

1.3 分離純化

無菌條件下采集病死鴨的肝臟病料組織,劃線接種于普通營養瓊脂培養基、麥康凱培養基及血瓊脂培養基上,然后放入恒溫培養箱于37 ℃培養24 h,觀察分離菌的生長狀況及菌落形態;挑取符合Pm典型菌落特點的單菌落在血瓊脂培養基上進一步分離純化,對純化培養后的菌落進行革蘭染色和顯微鏡觀察。

1.4 模板的制備

蘸取純化后細菌的單個菌落放置于50 μL滅菌的超純水中,充分振蕩混勻。采用煮沸法提取其核酸:100 ℃煮沸10 min,冰浴5 min,最后12 000 r/min離心5 min,離心后吸取上清液即為DNA模板,于-20 ℃保存備用。

1.5 引物合成

細菌16S rRNA基因的通用引物序列[11],由通用生物(安徽)有限公司合成引物,引物詳細序列及擴增產物大小如表1所示。

表1 引物序列及目的片段大小Table 1 Primer sequences and size of target fragments

1.6 16S r RNA的PCR擴增及測序

PCR反應體系為50 μL:2 μL分離菌株核酸模板、25 μL PCR MasterMix、2 μL上下游引物、19 μL超純水。PCR擴增程序為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,35個循環;72 ℃ 10 min。取1.25%瓊脂糖進行PCR產物凝膠電泳檢測,將有目的條帶的PCR擴增產物回收后由通用生物(安徽)有限公司進行分離菌株16S rRNA測序,測序結果用DNAStar軟件中的MegAlign程序進行同源性分析和遺傳進化樹的構建。

1.7 藥敏試驗

圓紙片擴散法測定分離菌株對六大類共18種抗菌藥物(四環素類:四環素、強力霉素、米諾環素;氨基糖苷類:阿米卡星、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素;青霉素類:氨芐西林、哌拉西林;多肽類:多粘菌素B、萬古霉素;林可霉素類:林可霉素;頭孢菌素類:頭孢唑林、頭孢哌酮、頭孢氨芐、頭孢曲松、頭孢呋辛鈉、頭孢他啶)的敏感性,用抑菌圈的大小判定其敏感程度。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離及染色結果

該分離菌株在血瓊脂培養基上菌落特征為稍微隆起、表面光滑、濕潤、灰白色、露珠樣半透明的圓形菌落(圖2),但在普通營養瓊脂和麥康凱培養基上不生長。該分離菌株用革蘭染色鏡檢,可見典型的兩極濃染的紅色球桿菌(圖3),符合Pm的染色特征。

圖2 血瓊脂培養基上的分離菌菌落特征Fig.2 Colony morphology of isolated bacteria on blood agar medium

圖3 革蘭染色鏡檢結果(×1 000)Fig.3 Gram staining microscopic results (×1 000)

2.2 16S r RNA的PCR擴增及測序結果

16S r RNA的PCR擴增結果顯示有1 500 bp左右的目的條帶(圖4)。PCR擴增產物的測序結果表明,分離菌株的基因序列與Pm菌株Q(GenBank登錄號:CP033597)的序列相似性為99.86%。將分離菌株的16S rRNA測序結果與13株參照菌株相應序列進行同源性比對分析,并進行遺傳進化樹的構建,如圖5～6。圖中Seq1表示分離菌株序列,其他參考菌株用GenBank登錄號代表。由圖5可知,該分離菌株與多殺性巴氏桿菌參照菌株具有99.3%～100%的同源性;由圖6可知,分離菌株與3個參照菌株均屬于同一分支,親緣關系較近,從而鑒定該分離菌株為多殺性巴氏桿菌。

圖4 16S rRNA的PCR擴增結果Fig.4 Results of PCR amplification for 16S rRNA注:M為DL-2000 Marker;1為分離菌株;2為陰性對照。

圖5 16S rRNA基因序列同源性分析Fig.5 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences

圖6 基于16S rRNA基因構建的遺傳進化樹Fig.6 Homology analysis of 16S rRNA sequence

2.3 藥敏試驗結果

Pm分離菌株對18種藥物的抑菌圈測定結果如表2所示,分離菌株對米諾環素的敏感性最高,抑菌圈直徑為19 mm;對四環素、強力霉素、慶大霉素、氨芐西林、頭孢哌酮表現中度敏感,其他藥物均為耐藥。

表2 分離菌株的藥敏試驗結果Table 2 Results of drug susceptibility test of the isolates

3 結論與討論

Pm是人獸共患病病原微生物,能夠感染多種家畜、家禽、經濟動物、野生動物等,導致禽霍亂、牛出血性敗血癥、豬肺疫、兔多殺性巴氏桿菌病等疾病。該病多為地方流行性,不同地區、不同動物體內主要的流行血清型有一定差異[12-13]。因此,研究Pm的致病性以及如何防控該病具有重要意義。李亞菲等[14]從貴州省某養鴨場分離到7株Pm,所采用的病料是腦、脾臟和肝臟組織,PCR擴增的kmt1基因序列與參考菌株相應序列的同源性高于99%。張小波等[15]從貴州遵義某養鴨場分離到1株花邊鴨源Pm,其16S rRNA序列與Pm菌株LSBS1的同源性為99.93%。本研究從4只病死鴨的肝臟中分離鑒定到一株未知菌,其菌落生長特征和染色特點均與Pm相符,16S rRNA測序結果與Pm參考菌株Q的相似性為99.86%,并且親緣關系最近。

本研究藥敏試驗結果表明,Pm分離菌株對米諾環素的敏感性最高,抑菌圈直徑為19 mm;對四環素、強力霉素、慶大霉素、氨芐西林、頭孢哌酮表現中度敏感,其他藥物均為耐藥。所以,推薦養殖戶及時采用米諾環素進行治療,后期反饋用藥治療效果不錯。王紅琳等[16]分離的一株蛋鴨源多殺性巴氏桿菌對頭孢類、鏈霉素和四環素均耐藥,與本研究結果一致。王喜等[17]從云南某雞場分離到1株雞源多殺性巴氏桿菌,該菌株對卡那霉素、鏈霉素、四環素等12種藥物耐藥,但對頭孢氨芐、頭孢他啶、氨芐西林敏感;伍瀾等[5]從湖北荊州某雞場分離到1株莢膜B型的雞源Pm,該菌株對頭孢類、四環素類、氨基糖苷類和喹諾酮類等多種藥物高度敏感,與莢膜A型禽源Pm對藥物的敏感性差異較大,例如于勇等[7]分離的4株莢膜A型的Pm對卡那霉素、四環素等7種抗生素表現為全部或部分耐藥。嚴專強等[18]從我國華東、華南、西南地區的番鴨中分離鑒定了13株Pm,以及肉雞中分離鑒定到4株Pm,這些菌株對卡那霉素、四環素、慶大霉素和鏈霉素等均表現耐藥,與本研究不完全相符。鄭小蘭等[19]分離鑒定到鴨源Pm共3株,并且對多粘菌素B和頭孢唑林均較為敏感,本研究卻表現為耐藥,但對鏈霉素的敏感性一致,均為耐藥。陳國權等[20]從肉鴨中分離到1株Pm,同時對頭孢菌素類、慶大霉素等表現敏感,本研究中卻為耐藥。

綜上可知,不同地區各個養殖場分離的多殺性巴氏桿菌菌株對抗菌藥物的敏感性有明顯差異。細菌耐藥性產生的原因較多,如不同養殖戶的用藥習慣不同,長期不規范用藥、甚至濫用抗菌藥的現象較為嚴重。建議養殖戶在臨床上如有禽霍亂發生,必須結合病原分離及藥物敏感試驗,篩選敏感藥物盡早治療,注意合理用藥,降低經濟損失。